專利名稱：水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因nrrb及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因，特別涉及水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻細(xì)菌條斑病(Bacterial Leaf Streak，簡(jiǎn)稱為細(xì)條病)是水稻生產(chǎn)中的一個(gè)重要病害，屬于全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性對(duì)象。該病害于1918年在菲律賓首次報(bào)道，而在中國(guó)最早于1953年發(fā)現(xiàn)于珠江三角洲。細(xì)條病在國(guó)內(nèi)主要分布于華南稻區(qū)，近年來(lái)在長(zhǎng)江流域雜交晚稻上亦有大面積發(fā)生。雜交稻對(duì)水稻細(xì)條病極為敏感，隨著雜交稻的大面積推廣，水稻細(xì)條病已上升為華南、中南稻區(qū)的主要細(xì)菌病害，其危害程度已超過(guò)水稻白葉枯病，減產(chǎn)可達(dá)5% 25%。此外，水稻細(xì)菌條斑病在東南亞各國(guó)和非洲中部也有發(fā)生。由此可見(jiàn)，水稻細(xì)條病具有分布廣、危害嚴(yán)重的特點(diǎn)。水稻細(xì)條病的病原菌為稻生黃單胞桿菌 (Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola)，屬薄壁菌門黃單胞桿菌科黃單胞桿菌屬。通過(guò)加強(qiáng)檢疫，杜絕病菌傳播，選用抗病品種，培育無(wú)病壯秧，加強(qiáng)肥水管理和及時(shí)進(jìn)行用藥控制等措施在一定程度上可以預(yù)防和控制細(xì)菌性條斑病發(fā)生和為害。現(xiàn)有的抗細(xì)條病水稻資源僅限于一些地方古老品種且性狀較差，這限制了它們?cè)谏a(chǎn)上的應(yīng)用。而使用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，具有效果不夠理想，病原菌容易產(chǎn)生抗藥性和污染環(huán)境等缺點(diǎn)。利用生物技術(shù)挖掘細(xì)條病抗性相關(guān)基因，并將其用于水稻品種改良，培育抗細(xì)條病水稻品種，為控制水稻細(xì)條病，提高水稻產(chǎn)量，開(kāi)辟了一條新的道路。在植物中，通過(guò)增強(qiáng)或者干擾某個(gè)或某些相關(guān)基因(尤其抗性相關(guān)基因)的表達(dá)可以提高植物對(duì)病害的抗性。其中干擾基因表達(dá)的方法有超量表達(dá)正義基因、基因反義表達(dá)、雙鏈RNA介導(dǎo)的RNA干擾和人工微小RNA干擾等多種，而RNA干擾(RNAinterference， RNAi)，即雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性基因沉默是較為有效而易行的干擾基因表達(dá)方法之一。 一些研究表明，表達(dá)發(fā)夾式雙鏈RNAQiairpin RNAi)比表達(dá)一般雙鏈RNA (非發(fā)夾式)具有更好的干擾效果。這種表達(dá)發(fā)夾式雙鏈RNA的RNAi技術(shù)顯著特征是在正義DNA序列和反義序列之間加入一個(gè)內(nèi)含子，而使經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄加工和拼接后產(chǎn)生的雙鏈RNA呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣更能有效引起靶標(biāo)基因mRNA的降解(1、Smith, N. Α.，S.P.Singh，et al. Total silencing by intron-splicedhairpin RNAs[J]. Nature. 2000. 407(6802) :319-320 ；2> Wesley, S. V. , C.A. Helliwell, et al. Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. PlantJ. 2001. 27(6) :581_590)。RNAi技術(shù)在植物性狀改良應(yīng)用方面的報(bào)道很多，有研究報(bào)道，通過(guò)RNAi技術(shù)干擾棉花中脂肪酸脫飽和酶基因的表達(dá)可改良棉籽油成分(3、Liu, Q.，S. P. Singh, et al. High-stearic andHigh—oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA—mediated post-transcriptional genesilencing[J]. Plant Physiol.2002. 129(4) :1732-1743.)； 另有研究表明，用RNAi技術(shù)抑制黃苷甲基轉(zhuǎn)移酶基因CaMXMTl的表達(dá)可以降低轉(zhuǎn)基因植株中可可堿和咖啡因的含量，從而有望獲得脫咖啡因的可可品種(4、Ogita, S.，H. Uefuji,et al.Application of RNAi to confirmtheobromine as the major intermediate for caffeine biosynthesis in coffee plants with potential forconstruction of decaffeinated varieties [J]. Plant Mol Biol. 2004. 54(6) :931-941.) 在植物抗病蟲(chóng)害方面的應(yīng)用，有研究報(bào)道用RNAi干擾煙草中根結(jié)線蟲(chóng)基因Mi Tisll (轉(zhuǎn)錄因子)可導(dǎo)致根結(jié)線蟲(chóng)大量減少(5、Fairbairn，D. J.，Α. S. CavalIaro, et al. Host-delivered RNAi :an effective strategyto silence genes in plant parasitic nematodes[J]. Planta. 2007. 226(6) : 1525-1533.)。用RNAi技術(shù)在玉米中表達(dá)玉米根蟲(chóng)雙鏈RNA，可以降低玉米根蟲(chóng)取食造成的損害(6、Baum, J. A.，T. Bogaert, et al. . Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].NatureBiotechnology.2007.25(11) 1322-1326)。在水稻中，許多研究報(bào)道(7、Yuan, B.，X. Shen, et al. Mitogen-activated protein kinase 0sMPK6negatively regulates rice disease resistance to bacterialpathogens[J]Planta. 2007. 226(4) :953-960 ；8、Tao, Ζ. , H. Liu, et al. A pair of allelic WRKY genesplay opposite roles in rice-bacteria interactions. Plant Physiol. 2009. 151(2) :936-948 ；9、Jiang, C. J. , M. Shimono, et al. Suppression ofthe rice fatty-acid desaturase gene 0sSSI2enhances resistance toblast and leaf blight diseases in rice. Mol Plant Microbe Interact. 2009.22(7) :820-829 ；10> Yamaguchi, Τ. , M. Kuroda,et al. Suppression of a phospholipase D gene, OsPLDbetal, activatesdefense responses and increases disease resistance in rice. Plant Physiol. 2009. 150 (1) :308-319.)，通過(guò)RNAi干擾一些重要病害防御基因提高水稻病害抗性，抑制MPK6、0sWRKY45-l、0sSSI2和OsPLD β 1表達(dá)能夠相應(yīng)增強(qiáng)病害的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB。本發(fā)明的第二目的在于提供水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB編碼的蛋白。本發(fā)明的第三目的在于提供水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB在培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用。所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No 1所示。所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No 2 所示。所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB可用于提高水稻對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性，培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻。所述培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻可采用如下方法構(gòu)建水稻細(xì)條病相關(guān)基因NRRB的RNA干擾表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到水稻，篩選獲得細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻。所述表達(dá)載體可為Ti類質(zhì)粒載體；所述轉(zhuǎn)化可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明中的水稻細(xì)條病相關(guān)基因NRRB的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株株系的細(xì)菌條斑病病斑平均長(zhǎng)度在Ttl和T1代顯著小于對(duì)照，表明該基因的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高水稻對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性。本發(fā)明為培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻提供了一條重要途徑。而生產(chǎn)上栽培細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻，對(duì)減少農(nóng)藥使用、增加糧食產(chǎn)量等具有重要
眉、ο


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR擴(kuò)增電泳圖。在圖1中，M為DL 5000DNAMarker, 1為野生型水稻植株，2為陽(yáng)性質(zhì)粒DNA, 3 ~ 13為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株。圖2為NRRB基因在Ttl和T1代RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中的相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比圖。在圖2中，WT為野生型水稻植株，Rl Rll和Ral Ra7分別為11株Ttl代和7株 T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株；柱形圖代表NRRB基因相對(duì)表達(dá)水平，其上豎線代表3個(gè)技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3為Ttl和T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和相應(yīng)野生型水稻植株的細(xì)菌條斑病病斑的平均長(zhǎng)度對(duì)比圖。在圖3中，WT為野生型水稻植株，Rl Rll和Ral Ra7分別為11株Ttl代和7株T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株，柱形圖代表病斑平均長(zhǎng)度，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，“**”表示NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間的病斑平均長(zhǎng)度存在極顯著差異(P < 0. 01)。圖4為接菌14天后全部11株Ttl代和全部7株T1代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與相應(yīng)野生型植株的病斑長(zhǎng)度對(duì)比圖。在圖4中，WT為野生型水稻植株，RNAi為NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，柱形圖代表病斑平均長(zhǎng)度，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤；“**”表示NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間的病斑平均長(zhǎng)度存在極顯著差異(P < 0. 01)。圖5分別為NRRB基因在Ttl和T1代RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中的相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比圖。在圖5中，WT為野生型水稻植株，Rl Rll和Ral Ra7分別為11株Ttl代和 7株T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株；柱形圖代表NRRB基因相對(duì)表達(dá)水平，其上豎線代表3個(gè)技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6為Ttl和T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和相應(yīng)野生型水稻植株的細(xì)菌條斑病病斑的平均長(zhǎng)度對(duì)比圖。在圖6中，WT為野生型水稻植株，Rl Rll和Ral Ra7分別為11株Ttl代和7株T1代NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株，柱形圖代表病斑平均長(zhǎng)度，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，“**”表示NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間的病斑平均長(zhǎng)度存在極顯著差異(P < 0. 01)。圖7為接菌14天后全部11株Ttl代和全部7株T1代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與相應(yīng)野生型植株的病斑長(zhǎng)度對(duì)比圖。在圖7中，WT為野生型水稻植株，RNAi為NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，柱形圖代表病斑平均長(zhǎng)度，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤；“**”表示NRRB基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株之間的病斑平均長(zhǎng)度存在極顯著差異(P < 0. 01)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB的獲得水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB是一個(gè)在細(xì)菌條斑病菌侵染的水稻中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因。具體獲得方法是，采用蛋白雙向電泳O-DE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry)的技術(shù)從細(xì)菌條斑病菌侵染的水稻蛋白質(zhì)組中找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后根據(jù)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的肽指紋搜索相關(guān)水稻蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得包含這些肽指紋的蛋白質(zhì)信息。再通過(guò)搜索GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，找到日本晴水稻基因組中編碼該差異表達(dá)蛋白的核酸序列及其基因編號(hào)。實(shí)施例2水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建選擇NRRB基因cDNA的5，端346bp核酸序列，合成一對(duì)引物NRRB_f和NRRB_r NRRB-f :caccttagtt aatcagttgg gaac ；NRRB-r :atgctcatcg gaatcatctg ；其中正向引物NRRB-f中引入Τ0Ρ0克隆識(shí)別位點(diǎn)，以便用Τ0Ρ0克隆方法將基因 DNA片斷克隆于pENTR/D-TOPO載體上。用上述引物，并以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)曾，以獲得NRRB基因cDNA的5， 端；3妨bp DNA片斷。PCR 的擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C lmin，;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min?；厥漳繕?biāo) 346bp DNA 片斷，按照 pENTR Directional T0P0 Cloning Kits (Invitrogen，USA)試劑盒的操作說(shuō)明將此DNA片斷克隆于pENTR/D-T0P0載體上， 挑選陽(yáng)性重組克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆命名為pENTR34RNAi ；提取 pENTR34RNAi 和 RNA 干擾表達(dá)載體 pH7GWIWG2 (II)質(zhì)粒 DNA，取 50ng 的 pENTR34RNAi 和 IOOng 的 pH7GWIWG2 (II)質(zhì)粒DNA，參考Gateway LR clonase II Enzyme Mix (Invitrogen, USA)操作說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，通過(guò)(Gateway LR重組反應(yīng)將NRRB基因cDNA的5，端!B^bp DNA片斷連接于RNA干擾表達(dá)盒中。重組的RNA干擾表達(dá)盒包含了一個(gè)NRRB基因cDNA的 5，端346bp正義DNA片斷和一個(gè)該基因cDNA的5，端346bp反義DNA片斷。pH7GWIWG2 (II) 表達(dá)載體資料參見(jiàn)文獻(xiàn)(Kafimi, M. , Inze, D. , Depicker, A. , Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 2002May ；7 (5) 193-195.)。用NRRB-f和NRRB_r引物進(jìn)行菌落PCR鑒定篩選陽(yáng)性重組克隆，并將陽(yáng)性重組克隆命名為pH34i ；取1 μ g pH34i質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 ；菌落PCR鑒定抗性平板上的農(nóng)桿菌克隆，可得到陽(yáng)性農(nóng)桿菌克隆，向其菌液中加入20%甘油，保存于-80°C備用。實(shí)施例3水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB基因RNA干擾表達(dá)構(gòu)建轉(zhuǎn)化水稻及PCR 檢測(cè)鑒定農(nóng)桿菌懸浮液的配制取20 μ L含pH34i質(zhì)粒的農(nóng)桿菌甘油保存液，接種于IOmL LB (含50mg/L卡那霉素)中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用適當(dāng)體積AAM培養(yǎng)液重懸，使農(nóng)桿菌懸浮液0D_值在0. 3 1之間，最后加入乙酰丁香酮使之最終濃度達(dá)到50mg/ L0取日本晴或中花11號(hào)成熟種子，脫殼后，用體積比例為1/3的次氯酸鈉溶液(活性氯約為3% )，表面消毒30min，用無(wú)菌水清洗2 5遍；在無(wú)菌濾紙上晾干后，接種于N6D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在黑暗的條件下誘導(dǎo)愈傷組織，2周后將愈傷組織在新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。取新鮮生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中，靜置30min，倒去農(nóng)桿菌懸浮液，將愈傷組織置于無(wú)菌濾紙上晾干，然后轉(zhuǎn)移到2N6-AS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(加50mg/ L乙酰丁香酮并預(yù)先在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上墊一張無(wú)菌濾紙)接著置于19 23°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天。3天后，將共培養(yǎng)愈傷組織取出，用無(wú)菌水洗凈農(nóng)桿菌，并置于無(wú)菌濾紙上晾干，然后轉(zhuǎn)移到N6D-S篩選培養(yǎng)基(加50mg/L潮霉素和400mg/L羧卞青霉素)上，于
黑暗條件下培養(yǎng)若干周，期間大部分愈傷組織逐漸褐化，少部分愈傷組織可以長(zhǎng)出淡黃色、松散的生長(zhǎng)較旺盛的新鮮抗性愈傷組織。將此抗性愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)移至MS-NK分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行分化培養(yǎng)，抗性愈傷組織在2周左右可以開(kāi)始分化出綠色的再生苗，分化的再生苗繼續(xù)在MS-HF生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待根基本長(zhǎng)成， 可移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，隨后移栽至田間。其中所述AAM培養(yǎng)液、2N6-AS共培養(yǎng)培養(yǎng)基、N6D-S 篩選培養(yǎng)基、MS-NK分化培養(yǎng)基和MS-HF生根培養(yǎng)基配方可參考文獻(xiàn)(Nishimura，Α.， I. Aichi, et al. (2006). “ A protocolforAgrobacterium-mediated transformation in rice. “ Nature Protocols 1(6) :2796-2802)。分別取上述轉(zhuǎn)化苗的葉片，提取基因組DNA，并以基因組DNA為模板，用以下1對(duì)特異引物P!35s-f和NRRB-idr進(jìn)行PCR檢測(cè)P35s-f :gacgtaaggg atgacgcaca a ；NRRB-idr :atgctcatcg gaacactg。由于引物P3k-f靶向花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子DNA，而NRRB-idr靶向 NRRB基因DNA，因而可以用于檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，而在檢測(cè)野生型植株時(shí)預(yù)期結(jié)果呈陰性。在對(duì)11株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，編號(hào)3 13的轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即能特異擴(kuò)增到大約420bp的目標(biāo)DNA條帶，而以野生型植株 (編號(hào)1)基因組DNA為模板的PCR的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，即不能特異擴(kuò)增到大約420bp的目標(biāo)DNA條帶(參見(jiàn)圖1)。實(shí)施例4 ；代和T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中的NRRB基因表達(dá)及其對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性分析分別對(duì)11株同處于孕穗期的Ttl代RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)野生型植株的 NRRB基因表達(dá)進(jìn)行定量分析和細(xì)菌條斑病抗性鑒定。在獲得Ttl代轉(zhuǎn)基因種子后，取Ttl代 NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子和相應(yīng)野生型水稻種子，分別播種后，按常規(guī)栽培方法進(jìn)行栽培，待植株長(zhǎng)到孕穗期，對(duì)野生型植株和T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的NRRB基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，并測(cè)試這些轉(zhuǎn)基因植株對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性。具體操作方法如下在水稻葉片接種水稻細(xì)條病菌Xanthomonas oryzae ρν· oryzicola(Xoc) RS105菌株之前，分別從野生型植株和NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株各取3段長(zhǎng)約5cm葉片，并從中提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以這些cDNA為模板，用基因特異引物對(duì)Actin-rqF/Actin-rqR和!Mreal-f/iMreal-r分別對(duì)樣品中Actin基因和NRRB 基因進(jìn)行定量分析。分析基因表達(dá)水平時(shí)，以Actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，用相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法(Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J], Nucleic Acids Res. 2001,29(9) :2002-2007.)分析NRRB 基因在不同轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)水平。在基因表達(dá)的定量分析中，每個(gè)基因至少重復(fù)2次熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過(guò)上述方法分析NRRB基因在11株Ttl代和7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)野生型植株中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NRRB基因在11株Ttl代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)水平約為野生型植株的0. 18 0. 90倍(參見(jiàn)圖 2)。NRRB基因在7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)水平約為野生型植株的0. 21 1. 20倍(參見(jiàn)圖5)。由此可見(jiàn)，在11株Ttl代和7株T1代NRRB基因RNA 干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，NRRB基因的表達(dá)被不同程度抑制。所用引物序列為34real_F :cttattttgc tgcatggggt ；34real-R :ctgttttgga cttgggcaat ；Actin-rqF :tgtatgccag tggtcgtacc a ；Actin-rqR :ccagcaaggt cgagacgaa。在進(jìn)行水稻細(xì)菌條斑病的抗性測(cè)試實(shí)驗(yàn)之前，先將細(xì)菌性條斑病菌X.oryzae pv. oryzicola (Xoc) RS105強(qiáng)毒菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基即NA培養(yǎng)基(+100mg/L利福平)上劃線培養(yǎng)2 3天，用無(wú)菌水洗下菌體，配制病菌懸浮液，使之OD6tltl值達(dá)到1. 0左右，最后往懸浮液中加入Tween-20使之終濃度達(dá)到0. 1%。用別針針尖蘸菌液，在完全展開(kāi)葉片上扎針接菌，具體接菌方法是在葉片葉脈兩側(cè)且靠葉鞘端、中間端和葉末端處扎針接菌，每片葉片共接菌6 8處，每株共接菌處理3 5片葉片。同時(shí)用無(wú)菌水(含0. 1 % Tween-20) 代替菌液進(jìn)行模擬處理，以進(jìn)行發(fā)病癥狀比較。在接菌14天后，用直尺測(cè)量接菌葉片的病斑長(zhǎng)度。病斑以能見(jiàn)的水漬邊緣為界，對(duì)所有接菌葉片的病斑進(jìn)行測(cè)量并記錄病斑長(zhǎng)度數(shù)據(jù)。病斑長(zhǎng)度數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用origin 8. 0軟件附帶的統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行平均值差異顯著性或極顯著分析。對(duì)11株Ttl代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)野生型植株的病斑長(zhǎng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，11株Ttl代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株病斑平均長(zhǎng)度為4. 8 7. 0mm,而野生型植株病斑平均長(zhǎng)度約為7. 6mm，其中4株(編號(hào)為R5、R6、 R7和R9)!；代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的病斑平均長(zhǎng)度顯著(“*”，P < 0. 05) 或者極顯著C‘**”，P < 0. 01)短于野生型植株的病斑平均長(zhǎng)度(參見(jiàn)圖幻。而全部11株 NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的病斑平均長(zhǎng)度約為6. 3 mm,極顯著(“#”，P < 0. 01) 短于野生型植株病斑的平均長(zhǎng)度7. 6mm(參見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明，與野生型水稻植株相比，T0 代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性顯著增強(qiáng)。同樣方法統(tǒng)計(jì)分析野生型植株和7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的病斑長(zhǎng)度，7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株病斑平均長(zhǎng)度為5. 1 8. 9mm,而野生型植株病斑平均長(zhǎng)度約為8. 2mm，其中5株(編號(hào)為Ral_Ra5)NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的病斑平均長(zhǎng)度顯著(“*”，P < 0. 05)或者極顯著(“**”，P < 0. 01)短于野生型植株的病斑平均長(zhǎng)度(參見(jiàn)圖6)。而全部7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的病斑平均長(zhǎng)度約為6. 2mm，極顯著(“**”，P < 0. 01)短于野生型植株病斑的平均長(zhǎng)度 8. 2mm(參見(jiàn)圖7)。結(jié)果表明，與野生型水稻植株相比，7株T1代NRRB基因RNA干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性顯著增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB，其特征在于其核苷酸序列為序列表中的SEQID No1。
2.如權(quán)利要求1所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No :2。
3.如權(quán)利要求1所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB在培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB在培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于采用如下方法構(gòu)建所述水稻細(xì)條病相關(guān)基因NRRB的RNA干擾表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到水稻，篩選獲得所述細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻。
5.如權(quán)利要求4所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB在培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)載體為Ti類質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求4所述水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB在培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
全文摘要
水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB及其編碼蛋白與應(yīng)用。涉及水稻基因，提供水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB及其編碼蛋白與應(yīng)用。水稻細(xì)條病抗性相關(guān)基因NRRB可用于提高水稻對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性，培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻。水稻細(xì)條病相關(guān)基因NRRB的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株株系的細(xì)菌條斑病病斑平均長(zhǎng)度在T0和T1代均顯著小于對(duì)照，表明該基因的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高水稻對(duì)細(xì)菌條斑病的抗性。為培育細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻提供了一條重要途徑。生產(chǎn)上栽培細(xì)菌條斑病抗性增強(qiáng)的水稻，對(duì)減少農(nóng)藥使用、增加糧食產(chǎn)量等具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102181455SQ20111010931
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者崔欣欣, 趙婷婷, 郝國(guó)靜, 郭小玲, 郭立佳, 陳亮 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)