專利名稱：一種糙皮側(cè)耳est-ssr分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異弓I物體系及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糙皮側(cè)耳是我國第一大食用菌栽培菌種。在人們長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中，積累了豐富而珍貴的糙皮側(cè)耳種質(zhì)資源，特別是近年來，隨著糙皮側(cè)耳栽培產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，糙皮側(cè)耳的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國糙皮側(cè)耳栽培品種(包括國外引進(jìn)菌種)已達(dá)300多個(gè)。豐富的種質(zhì)資源為糙皮側(cè)耳品種改良、新品種選育以及遺傳工程奠定了基礎(chǔ)。然而，糙皮側(cè)耳種質(zhì)資源庫不斷擴(kuò)大，對(duì)育種工作者來說，要想知道這些育種材料的詳細(xì)信息，并進(jìn)行深入細(xì)致的評(píng)價(jià)鑒定，變得越來越困難。特別是由于我國食藥用菌品種登記制度尚未完善，糙皮側(cè)耳的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和同名異種現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這就給育種工作者正確評(píng)價(jià)和鑒定這些種質(zhì)資源帶來很大的不便。因此，如何更有效地保存和開發(fā)利用現(xiàn)有糙皮側(cè)耳種質(zhì)資源，特別是對(duì)特異種質(zhì)材料進(jìn)行有效地篩選和挖掘，是當(dāng)前迫切需要解決的問題。目前，用于作物種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但對(duì)于核心種質(zhì)構(gòu)建、基因性狀鑒定、品種指紋圖譜建庫等研究，SSR分子標(biāo)記是公認(rèn)的最佳方法。開發(fā)SSR標(biāo)記主要有構(gòu)建與篩選基因組文庫法、微衛(wèi)星富集法、省略篩庫法和數(shù)據(jù)庫搜索法等。其中數(shù)據(jù)庫搜索法，尤其是從表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中搜索，開發(fā) EST-SSR標(biāo)記，已經(jīng)成為一種廣為采用的方法。EST-SSR標(biāo)記相對(duì)于基因組SSR標(biāo)記而言， 由于其來自于轉(zhuǎn)錄譜，能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，使EST-SSR標(biāo)記可以直接與目標(biāo)性狀(如高產(chǎn)或多抗)相聯(lián)系，在分子標(biāo)記輔助選擇上具有更高的應(yīng)用價(jià)值。然而，由于食藥用真菌基因組學(xué)研究的相對(duì)滯后，EST-SSR標(biāo)記技術(shù)在食藥用真菌中的研究很少，僅見在香菇和真姬菇中有研究報(bào)道，而在糙皮側(cè)耳中尚未開展該方面的研

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用。一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括4對(duì)核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GLlF :ctgctcgttgtacacgcttc(SEQ ID NO. 1), GLlR :gaaagacagacgcgggatta ； (SEQ ID NO. 2)；GL2F :ggtaatctcggcttcacgat(SEQ ID NO. 3), GL2R :ttgagaatcttcggcacctc(SEQ ID NO. 4)；GL4F :gagcaggcgatctctttcaa(SEQ ID NO. 5), GL4R :gcgaagggagtggtacacat(SEQID NO. 6)；GL19F :agtacgtagctgccgtccag(SEQ ID NO. 7) , GL 1 9R cctgatacgtcccgtaacca(SEQ ID NO. 8)。上述體系，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GL26F :tatgggcatgatgaagaacg(SEQ ID NO. 9) , GL26R cgacgacgacgactatgaga(SEQ ID NO· 10)。上述體系，還包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GL38F :tctttacatccacgccatga(SEQ ID NO. 1 1) , GL38R caaagtgaaggtgagcgaca(SEQ ID NO. 12)0上述EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系在糙皮側(cè)耳遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(1)提取樣品 DNA;(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的成對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增EST-SSR分子標(biāo)記，得PCR產(chǎn)物；(3)將步驟( 制得的得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析和多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析。所述步驟(1)提取樣品DNA，步驟如下(i)刮取菌絲用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60_65°C水浴l_2h ；(ii)4°C 12000rpm離心lOmin，取上清加入等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿與異戊醇體積比24 1)，混勻后，4°C 12000rpm離心IOmin ；(iii)重復(fù)步驟(ii)；(iv)取上清加入2倍體積的無水乙醇于_20°C靜置2h ；(v) 40C 8000rpm離心lOmin，棄上清，用70 %乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入適量
TE溶解，即得樣品DNA。所述步驟⑵的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為糙皮側(cè)耳基因組DNA 50-100ng，10X 緩沖液 2. 5μ L，2. 5mmol 的 dNTPs 2 μ L, 2. 5U· μ L1Taq-O. 25 μ L，濃度為10 μ M · L—1的正向引物溶液1 μ L，濃度為10 μ M · L—1的反向引物溶液1 μ L，添加(MH2O至體系體積為25 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性30s ；53 56°C復(fù)性 45s ；72°C延伸Imin,反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0所述步驟(3)的瓊脂糖凝膠電泳為2%的瓊脂糖凝膠電泳。所述步驟(3)的遺傳多樣性分析是根據(jù)EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的特異引物在糙皮側(cè)耳樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)清晰穩(wěn)定的條帶后，應(yīng)用非加權(quán)類平均聚類方法對(duì)糙皮側(cè)耳樣品進(jìn)行聚類分析?？蓞⒖?Sokal R R,Michener C D. A statistical method for evaluating systematic relationships. Univ Kansas Sci Bull,1958, 28 :1409-1438) (Sneath P H, Sokal R R. Numerical Taxonomy :The Principal and Practice of Numerical Classification. San Francisco :ff. H. Freeman and Company, 1973)中的記載。
所述步驟(3)的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析是根據(jù)統(tǒng)計(jì)在同一電泳遷移位置擴(kuò)增條帶的有無，有擴(kuò)增條帶的記為1，沒有擴(kuò)增條帶的記為0，生成分子數(shù)據(jù)矩陣；然后，利用NTSYS2. 1 軟件的非加權(quán)平均數(shù)法(UPMGA)進(jìn)行了聚類分析?？蓞⒖?Sokal R R, Michener C D. A statistical method for evaluating systematic relationships. Univ Kansas Sci Bull，1958,28 :1409-1438)或(Sneath P H, Sokal R R. Numerical Taxonomy :The Principal and Practice of Numerical Classification. San Francisco :ff.H.Freeman and Company, 1973)中的記載。有益效果1、本發(fā)明初步構(gòu)建了糙皮側(cè)耳的EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，該體系為建立糙皮側(cè)耳的核心種質(zhì)庫、提高整個(gè)種質(zhì)庫的管理和利用水平，特別是為采用一系列先進(jìn)手段和方法有目的、有重點(diǎn)地進(jìn)行重要性狀遺傳規(guī)律的研究提供了新的手段，具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)用價(jià)值。2、本發(fā)明用于建立糙皮側(cè)耳的核心種質(zhì)庫，使用方便，能簡(jiǎn)單快捷的進(jìn)行種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建和功能基因的研究；相較傳統(tǒng)方法， 可以大大縮短分析周期，提高研究效率。3、本發(fā)明中的特異引物的退火溫度非常接近，有利于其使用分析自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)。


圖1、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GL4在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖2、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GL2在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖3、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GLl在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖4、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GL19在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖5、16株糙皮側(cè)耳菌株基于EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物擴(kuò)增結(jié)果的聚類樹狀圖；圖6、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GU6在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖7、糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物GL38在16株糙皮側(cè)耳菌株中的擴(kuò)增結(jié)果；圖8、實(shí)施例2中16株糙皮側(cè)耳菌株基于EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物擴(kuò)增結(jié)果的聚類樹狀圖；圖9、實(shí)施例3中16株糙皮側(cè)耳菌株基于EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中引物擴(kuò)增結(jié)果的聚類樹狀圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
實(shí)施例中所用的糙皮側(cè)耳菌株均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所公開銷售的菌種。實(shí)施例1 :EST-SSR引物的篩選。1、SSR位點(diǎn)的來源與篩選從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)數(shù)據(jù)庫中搜索并下載(以 FASTA 格式) 已有的糙皮側(cè)耳EST序列，采用EST-trimmer軟件除去5’或3’端的polyA或polyT，除去長(zhǎng)度小于IOObp的EST序列，對(duì)于長(zhǎng)度大于700bp的EST則保留其5，端的700bp ；再利用 CAP3軟件進(jìn)行片段重疊群分析和聚類，拼接時(shí)設(shè)定的初始裝配參數(shù)均為默認(rèn)值，得到高質(zhì)量的Unigenes，利用SSR Finder軟件在其中搜索SSR，搜索標(biāo)準(zhǔn)為單、二、三、四、五、六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為12、6、5、5、5、5次，同時(shí)也包括中間被一段序列打斷(不超過 IObp)的不完全重復(fù)SSR。2、EST-SSR標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)利用引物設(shè)計(jì)軟件primer3. 0在含有SSR位點(diǎn)的序列中設(shè)計(jì)引物。對(duì)于EST-SSR 引物設(shè)定參數(shù)為=(I)GC含量為45% 60% ； (2)退火溫度為55 65°C ； (3)預(yù)期片段長(zhǎng)度在150 300bp之間；(4)引物長(zhǎng)度在18 27bp之間。3、引物的優(yōu)化不同引物根據(jù)不同的Tm值進(jìn)行優(yōu)化，擴(kuò)增反應(yīng)用BioRad PCR儀，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性30s ；50 65°C復(fù)性45s ；72°C延伸lmin，反應(yīng)進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 反應(yīng)體系為(25 μ L) =IOX 緩沖液 2. 5 μ L，2. 5mmol ^ dNTPs 2 μ L，2. 5U · μ L-1Taq酶0. 25 μ L，正反向引物各1 μ L，模板為50_100ng。模板是隨機(jī)的4 個(gè)糙皮側(cè)耳菌株。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后再凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果，選取雜帶少、條帶清晰穩(wěn)定多態(tài)性好的PCR對(duì)應(yīng)的溫度作為最佳的退火溫度。4、EST-SSR引物的確定根據(jù)上面篩選出的Tm值選取16個(gè)糙皮側(cè)耳菌株檢測(cè)這些EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性30s，53 56°C復(fù)性45s， 72°C延伸lmin，反應(yīng)進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。反應(yīng)體系為(25μ L) :10Χ 緩沖液 2. 5μ L，2. 5mmol 的 dNTPs 2 μ L, 2. 5U · μ L^1Taq 酶0. 25 μ L，正反向引物各1 μ L，模板為50-100ng。PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果，分析確定多態(tài)性，最后選出6對(duì)特異引物可作為糙皮側(cè)耳EST-SSR標(biāo)記，6對(duì)特異引物如表1所示。表1、開發(fā)獲得的4對(duì)可適用于糙皮側(cè)耳的EST-SSR標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括4對(duì)核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GLlF :ctgctcgttgtacacgcttc，GLlR gaaagacagacgcgggatta ；GL2F :ggtaatctcggcttcacgat，GL2R :ttgagaatcttcggcacctc ；GL4F :gagcaggcgatctctttcaa，GL4R gcgaagggagtggtacacat ；GL19F :agtacgtagctgccgtccag，GL19R :cctgatacgtcccgtaacca0
2.如權(quán)利要求1所述的特異引物體系，其特征在于，還包括核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GL26F :tatgggcatgatgaagaacg，GL26R :cgacgacgacgactatgaga0
3.如權(quán)利要求1所述的特異引物體系，其特征在于，還包括核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子標(biāo)記特異引物GL38F :tctttacatccacgccatga，GL38R :caaagtgaaggtgagcgaca0
4.權(quán)利要求1所述EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系在糙皮側(cè)耳遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)提取樣品DNA；(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的成對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增EST-SSR分子標(biāo)記，得PCR產(chǎn)物；(3)將步驟( 制得的得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析和多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)提取樣品DNA，步驟如下(i)刮取菌絲用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60_65°C水浴1_濁；(ii)4°C12000rpm離心lOmin，取上清加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混勻后， 40C 12000rpm 離心 IOmin ；(iii)重復(fù)步驟( )；(iv)取上清加入2倍體積的無水乙醇于_20°C靜置濁；(v)40C 8000rpm離心lOmin，棄上清，用70 %乙醇洗2_3次，倒置晾干，加入適量TE溶解，即得樣品DNA。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟O)的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為糙皮側(cè)耳基因組 DNA 50-100ng, IOX 緩沖液 2. 5 μ L, 2. 5mmol 的 dNTPs 2 μ L,2. 5U· μ L1Taq-O. 25 μ L，濃度為10 μ M · L—1的正向引物溶液1 μ L，濃度為10 μ M · L—1的反向引物溶液1 μ L，添加(MH2O至體系體積為25 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性30s ；53 56°C復(fù)性45s ； 72°C延伸Imin,反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的瓊脂糖凝膠電泳為2%的瓊脂糖凝膠電泳。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的遺傳多樣性分析是根據(jù) EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系中的特異引物在糙皮側(cè)耳樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)清晰穩(wěn)定的條帶后，應(yīng)用非加權(quán)類平均聚類方法對(duì)糙皮側(cè)耳樣品進(jìn)行聚類分析。
10.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析是根據(jù)統(tǒng)計(jì)在同一電泳遷移位置擴(kuò)增條帶的有無，有擴(kuò)增條帶的記為1，沒有擴(kuò)增條帶的記為0，生成分子數(shù)據(jù)矩陣；然后，利用NTSYS 2. 1軟件的非加權(quán)平均數(shù)法進(jìn)行了聚類分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。一種糙皮側(cè)耳EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系，它包括4對(duì)EST-SSR分子標(biāo)記特異引物。本發(fā)明還提供EST-SSR分子標(biāo)記特異引物體系在糙皮側(cè)耳遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用。本發(fā)明用于建立糙皮側(cè)耳的核心種質(zhì)庫，使用方便，能簡(jiǎn)單快捷的進(jìn)行種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建和功能基因的研究；相較傳統(tǒng)方法，可以大大縮短分析周期，提高研究效率。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102181559SQ20111010872
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者萬魯長(zhǎng), 任海霞, 任鵬飛, 姚強(qiáng), 宮志遠(yuǎn), 張雪梅, 曲玲, 李瑾, 趙軍勝, 韓建東, 高興喜 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所