專利名稱：輔助檢測ndm-1基因的專用引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助檢測NDM-I基因的專用引物及其應(yīng)用。
技術(shù)背景 早在人類誕生之前，細(xì)菌便開啟了自己的生命歷程，二戰(zhàn)期間細(xì)菌嚴(yán)重威脅了人類的生命。19 年，弗萊明偶然間發(fā)現(xiàn)了青霉素(Penicillin)，隨著抗生素藥物的問世，細(xì)菌的耐藥性在一些國家得到一定的控制。1961年，后英國學(xué)者Jevons首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resitant Staphylococcus aureus，MRSA)，MRSA 能分泌一種酚可溶性調(diào)控蛋白(Phenol-soluble modul in, PSM)破壞人類的嗜中性粒細(xì)胞，形成嚴(yán)重感染——第一任“超級細(xì)菌”就此誕生。近年來抗生素濫用及抗生素累積的雙重因素，使得細(xì)菌中的耐藥基因不斷積累，從而產(chǎn)生了多重抗藥性。據(jù)2010年8月11日出版的英國《The Lancet Infectious Diseases》期刊報道，目前有一種新的耐藥基因在一些國家流行，一些西方醫(yī)學(xué)家稱其為NDM-I基因。NDM-I 基因編碼的蛋白被命名為“新德里金屬- β-內(nèi)酰胺酶1 (New Metallo-^-Lactamase-D0 新德里金屬- β -內(nèi)酰胺酶1由269個氨基酸殘基組成，與現(xiàn)有的其它金屬- β -內(nèi)酰胺酶 (Metallo-β -Lactamase)的一致性不足33%，且在酶活性位點附近經(jīng)常有其獨特的氨基酸殘基及插入序列，并能與碳青霉烯類抗生素緊密結(jié)合。NDM-I基因目前已發(fā)現(xiàn)于克雷伯式桿菌的1801Λ的質(zhì)粒和大腸桿菌的1401Λ的質(zhì)粒上。在NDM-I基因上游的2個區(qū)域中還存在能夠抵抗鏈霉素、紅霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒劑和磺胺藥物的多種耐藥基因。由于含有NDM-I基因的質(zhì)粒即能在菌株之間穿梭傳遞，又可以在轉(zhuǎn)移中發(fā)生重組，且通過攜帶NDM-I基因的質(zhì)粒的傳遞，還可使對抗生素敏感的細(xì)菌獲得多重耐藥性，大大增加臨床抗生素使用的困難。目前，攜帶有NDM-I基因的超級細(xì)菌正在全球蔓延，印度、美國、英國、澳大利亞、 加拿大、法國、荷蘭等多個國家已經(jīng)出現(xiàn)了疑似病例。面對“超級細(xì)菌”的跨國傳播趨勢，尋找一種簡便、快速、準(zhǔn)確的耐藥基因檢測方法成為許多科研工作者的重大課題，也是臨床實踐檢驗中急切解決的問題。建立快速、簡便、可靠的檢測方法對NDM-I基因進(jìn)行檢測，對于指導(dǎo)臨床的早期治療和有效的控制超級細(xì)菌的傳播具有重大意義。LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ^ 2000 Notomi
明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區(qū)域的四條引物 (兩條外引物，兩條內(nèi)引物)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9-IOltl個拷貝數(shù)量級。整個反應(yīng)僅需1小時，在擴(kuò)增反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結(jié)果。LAMP技術(shù)具有簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價、易檢測等特點。目前，國內(nèi)外尚未見LAMP 方法檢測NDM-I基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的是提供一種輔助檢測NDM-I基因的專用引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助檢測NDM-I蛋白(新德里金屬-內(nèi)酰胺酶1)的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、 序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒，包括所述的專用引物。所述專用引物可用于制備輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒。所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因。所述專用引物或所述試劑盒可用于輔助鑒定含有NDM-I蛋白的編碼基因的生物樣本。所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或⑷所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或O)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA 分子；(4)與⑴或⑵限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因的方法，包括如下步驟(1)提取所述待測生物樣本的基因組DNA ；(2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用所述的專用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增；(3)根據(jù)步驟O)的擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定所述待測生物樣本是否含有所述NDM-I蛋白的
編碼基因。所述環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)程序可為65°C 1小時，80°C 5分鐘。所述環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2 所示DNA的濃度均可為0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA 的濃度均可為1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA的濃度均可為 0. 8 μ mol/L。所述待測生物樣本可為大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)或月市炎鏈球菌 (Strep tococcus pneumoniae)。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌DH5 α、所述金黃色葡萄球菌具體可為金黃色葡萄球菌ATCC25923、所述肺炎克雷伯氏菌具體可為肺炎克雷伯氏菌EL-2株、所述肺炎鏈球菌具體可為肺炎鏈球菌R6。所述環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有鈣黃綠素時，可通過熒光顯色進(jìn)行結(jié)果判讀，如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系顯示為綠色，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系顯示為橙色，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過觀察沉淀進(jìn)行結(jié)果判讀，如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系中生成白色沉淀，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系中沒有生成白色沉淀，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判讀，如果反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。還可通過濁度儀進(jìn)行結(jié)果判讀，從反應(yīng)開始時刻即通過Loopamp濁度儀檢測反應(yīng)液，如果生成濁度變化曲線待測生物樣本中含有所述NDM-I蛋白的編碼基因，如果沒有生成濁度變化曲線待測生物樣本中不含有所述NDM-I蛋白的編碼基因。應(yīng)用所述專用引物可以通過LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增)技術(shù)從分子水平上直接快速、準(zhǔn)確檢測NDM-I耐藥基因，具有如下優(yōu)點⑴在恒溫條件下即可發(fā)生反應(yīng)，擺脫了了對于儀器的依賴；⑵反應(yīng)時間短；在Ih內(nèi)即可完成；(3)靈敏度高；比傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增技術(shù)提高了兩個數(shù)量級，最低檢測限為eOcopies/反應(yīng)；(4)特異性強(qiáng)；應(yīng)用6個靶基因位點，內(nèi)引物及外引物在6個區(qū)域特異性結(jié)合方可進(jìn)行擴(kuò)增；( 鑒定簡便；在核酸大量合成時，從 dNTP解離出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀；如果在反應(yīng)體系中加入結(jié)合了 Mn2+的鈣黃綠素，Mg2+則替換掉鈣黃綠素中結(jié)合的Mn2+，是鈣黃綠素發(fā)出黃綠色熒光；以上兩種方法均不需要借助其他儀器便可肉眼觀察實驗結(jié)果，實現(xiàn)了結(jié)果可視化；也可通過Loopamp濁度儀檢測的方式進(jìn)行結(jié)果判讀；(6)步驟簡單；先將DNA 模板在96°C，預(yù)變性:3min。再將所有配制在一起的試劑，一步添加進(jìn)去，實現(xiàn)一步核酸擴(kuò)增，免開蓋操作，可保證臨床檢驗人員自身安全，進(jìn)而亦避免了“超級細(xì)菌”的傳播。應(yīng)用本發(fā)明提供的專用引物檢測NDM-I蛋白的編碼基因，解決了其他檢測技術(shù)對于臨床實際應(yīng)用需求的針對性不強(qiáng)的技術(shù)弊端，并且解決了其他檢測技術(shù)耗時長、操作復(fù)雜、檢測儀器昂貴、靈敏度及特異性差等技術(shù)問題，具有靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)、簡便、 安全等特點，為快速、準(zhǔn)確的檢測NDM-I耐藥基因打下堅實的基礎(chǔ)，其廣泛應(yīng)用將大大提高低儀器配置地區(qū)的病原微生物檢測能力，對病原微生物的早期、準(zhǔn)確診斷有著重大意義。本發(fā)明不僅可指導(dǎo)臨床合理用藥，以免延誤病情和增加治療費用，而且有利于控制其傳播，防止暴發(fā)流行，這對提高治療效果和控制醫(yī)院內(nèi)感染均有重要意義。


圖1為實施例2中通過檢測濁度變化判讀結(jié)果。圖2為實施例3中通過瓊脂糖凝膠電泳判讀結(jié)果。圖3為實施例4中NDM-I基因語同源序列的BLAST比對結(jié)果。圖4為對比例中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a 公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得； 參考文獻(xiàn)韓俊，陳嵐，段淑敏等，金屬催化劑有效快速裂解SARS冠狀病毒和其他微生物， 中國實驗動物學(xué)報，2006年9月，第14卷，第3期，199-212頁。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923 公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn)王堅，吳梅，陸煒方等，48株金黃色葡萄球菌檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及藥敏分析，中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2009年1月第12卷第1期，93-94。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)EL-2株公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn)孔慶娟，劉馬峰，白建等，大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的藥敏試驗，畜禽業(yè)，2005年第1期總第177期，64-66。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) R6 公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn)張巧，林科雄，馬千里等，肺炎鏈球菌溶菌酶作為肺炎鏈球菌多價核酸疫苗候選抗原的保護(hù)效能評價，重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010年第35卷第5期。實施例1、專用引物的設(shè)計和制備設(shè)計并合成表1所示的各條引物(FOP、BOP, FIP、BIP、FLP和BLP)。表1所示的六條引物組成專用引物，用于實施例2。表1引物的核苷酸序列
引物序列(5' -3')引物長度FOP (序列表的序列1)TTTGATCGTCAGGGATGGC19bpBOP (序列表的序列2)GCTGGTTCGACAACGCATTG20bpFIP (序列表的序列3)GGCAGGTTGATCTCCTGCTTGAGGTCGATACCGCCTGGAC40bpBIP (序列表的序列4)CTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATAAGTCGCAATCCCCG39bpFLP (序列表的序列5)TCTGGGCGGTCTGGTCATCG20bpBLP (序列表的序列6)GCATCAGGACAAGATGGGC19bpNDM-I蛋白的氨基酸序列如序列表的序列7所示，其編碼基因如序列表的序列8所示，開放閱讀框為序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸。實施例2、應(yīng)用專用引物檢測NDM-I基因一、模板的制備合成序列表的序列11所示的DNA(模板)，為了使靶序列的核苷酸序列不能翻譯成為具有活性的功能蛋白，將所述靶序列中的個別核苷酸進(jìn)行了替換，為了便于與其它模板區(qū)分，將序列11所示的DNA也稱為NDM-I基因。二、應(yīng)用專用引物檢測NDM-I基因
1、通過觀察熒光顏色變化判讀結(jié)果(熒光顯色法)采用步驟一合成的模板(濃度為2. 9ng/ μ 1)進(jìn)行LAMP (環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增)，LAMP 反應(yīng)體系見表2。表2LAMP 反應(yīng)體系(25 μ L)
權(quán)利要求
1.輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的專用引物；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述專用引物在制備輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因的試劑盒中的應(yīng)用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述專用引物或權(quán)利要求2所述試劑盒在輔助檢測NDM-I蛋白的編碼基因中的應(yīng)用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述專用引物或權(quán)利要求2所述試劑盒在輔助鑒定含有NDM-I蛋白的編碼基因的生物樣本中的應(yīng)用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的專用引物，如權(quán)利要求2所述的試劑盒，或如權(quán)利要求3至5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下⑴或(2)或(3)或⑷ 所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的 DNA分子。
7.一種輔助鑒定待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因的方法，包括如下步驟(1)提取所述待測生物樣本的基因組DNA;(2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的專用引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增；(3)根據(jù)步驟O)的擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定所述待測生物樣本是否含有NDM-I蛋白的編碼基因；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述NDM-I蛋白的編碼基因為如下(1)或 ⑵或(3)或(4)所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至擬6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的 DNA分子。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)程序為 650C 1小時，80°C 5分鐘。
10.如權(quán)利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA的濃度均為0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA的濃度均為0. 8 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助檢測NDM-1基因的專用引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了輔助檢測NDM-1蛋白的編碼基因的專用引物，由序列表的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示DNA組成；NDM-1蛋白是由序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。應(yīng)用所述專用引物檢測，具有靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)、簡便、安全等特點，其廣泛應(yīng)用將大大提高低儀器配置地區(qū)的病原微生物檢測能力，對病原微生物的早期、準(zhǔn)確診斷有著重大意義。本發(fā)明不僅可指導(dǎo)臨床合理用藥，以免延誤病情和增加治療費用，而且有利于控制其傳播，防止暴發(fā)流行，這對提高治療效果和控制醫(yī)院內(nèi)感染均有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102199669SQ201110108668
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者張苑怡, 朱寶利, 武娜, 王志云 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所