專利名稱：利用單一微生物將可發(fā)酵碳源生物轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括利用單一微生物將一種可發(fā)酵的碳源生物轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是一種在生產(chǎn)聚酯纖維中和在制造聚亞胺酯及環(huán)狀化合物中具有潛在應(yīng)用價值的單體。已經(jīng)知道有多種化學(xué)途徑能夠生產(chǎn)1，3_丙二醇。例如，可以利用一種催化劑，在存在磷化氫、水、一氧化碳、氫氣和一種酸的情況下，通過丙烯醛的催化溶液相水合，然后還原，將環(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇。或用碳?xì)浠衔锶绺视?，在存在一氧化碳和氫氣的條件下，使用含周期表第八族原子的催化劑進(jìn)行反應(yīng)來制備。雖然使用這些方法都能產(chǎn)生1， 3-丙二醇，但它們非常昂貴，并且會產(chǎn)生含有環(huán)境污染物的廢物。人們在一個世紀(jì)前就已經(jīng)知道，1，3-丙二醇可以通過發(fā)酵甘油來生產(chǎn)。已經(jīng)在多種細(xì)菌例如檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、泥桿菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬和暗桿菌屬中發(fā)現(xiàn)了能夠生產(chǎn)1，3_丙二醇的菌株。在每種已經(jīng)研究的情況中，甘油都經(jīng)兩個酶促反應(yīng)序列步驟轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，第一步，一種脫水酶催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛(3-HP) 和水，方程1。第二步，3-HP被一種NAD+相連的氧化還原酶還原為1，3-丙二醇，方程2。1， 3-丙二醇不再被進(jìn)一步代謝，因而在培養(yǎng)基中高濃度積累。整個反應(yīng)消耗等當(dāng)量的還原性輔助因子-還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH被氧化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。甘油一3-HP+H20(方程 1)3-HP+NADH+H+ — 1,3-丙二醇 +NAD+ (方程 2)由甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇一般以甘油為唯一碳源在厭氧條件下進(jìn)行，并且沒有其它外源的還原性等價受體。在這種條件下，在如檸檬酸桿菌屬，梭菌屬，和克雷伯氏菌屬的菌株中，起作用的是一種甘油代謝的平行途徑，這一途徑包括，甘油首先被一種NAD+-(或 NADP+-)連接的甘油脫氫酶氧化為二羥基丙酮(DHA)，方程3。DHA在一種DHA激酶的作用下磷酸化后產(chǎn)生磷酸二羥基丙酮(DHAP)(方程4)，就可通過如糖酵解途徑用于生物合成和支持ATP的產(chǎn)生。相對于1，3_丙二醇途徑，這一途徑可以為細(xì)胞提供碳源和能量，并且產(chǎn)生而不是消耗NADH。甘油+NAD+ — DHA+NADH+H+ (方程 3)DHA+ATP — DHAP+ADP (方程 4)在肺炎克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌中，編碼功能相連的甘油脫水酶(dhaB)、l， 3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫水酶(dhaD)和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性的基因都包含在調(diào)節(jié)子dha中。檸檬酸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的dha調(diào)節(jié)子已在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，并且都顯示能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。制備甘油的生物過程已經(jīng)知道，除一些細(xì)菌外，絕大多數(shù)甘油生產(chǎn)者是酵母，其它真菌和藻類也已知可產(chǎn)生甘油。細(xì)菌和酵母都通過糖酵解途徑中的果糖-1，6- 二磷酸途徑或Embden Meyerhof Parnas途徑轉(zhuǎn)化葡萄糖或其它碳水化合物來生產(chǎn)甘油，但是，某些特定的藻類將葉綠體中溶解的二氧化碳和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化成卡爾文循環(huán)中的三碳中間產(chǎn)物。在一系列步驟中，這種三碳中間產(chǎn)物-磷酸甘油被轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛很容易互變?yōu)槠渫悩?gòu)體-磷酸二羥丙酮，并最終轉(zhuǎn)化為甘油。雖然生產(chǎn)甘油和1，3_丙二醇的生物方法都已經(jīng)知道，但一直沒能證明整個過程能由單一有機(jī)體來完成。上面介紹的生產(chǎn)1，3_丙二醇的化學(xué)方法和生物方法都不能很好地適應(yīng)于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，因為化學(xué)過程消耗大量的能量，而生物過程需要昂貴的起始物質(zhì)-甘油。因此需要一種只要求低能量輸入和廉價起始物的方法。更需要這樣一種方法，它應(yīng)含有一種微生物， 這種微生物能將基本碳源如碳水化合物或糖轉(zhuǎn)化為所需的1，3-丙二醇終產(chǎn)物。雖然需要能將可發(fā)酵碳源而不是甘油或二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的單一有機(jī)體轉(zhuǎn)化，但已經(jīng)證明這種努力需要克服重大的困難。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)指出，多數(shù)對生產(chǎn)1，3_丙二醇有用的菌株如弗氏檸檬酸桿菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌，其生長會因存在氫供體如果糖或葡萄糖而受到干擾。短乳桿菌和布氏乳桿菌的菌株在甘油與果糖或葡萄糖中共發(fā)酵時能生產(chǎn)1，3_丙二醇，但在用甘油作唯一碳源時卻不能生長，而且，雖然已經(jīng)顯示靜止細(xì)胞能代謝葡萄糖或果糖，但它們不產(chǎn)生1，3_丙二醇(Veiga DA Cunha等，《細(xì)菌學(xué)雜志》174卷，1013頁 (1992)) 0同樣，已經(jīng)顯示多養(yǎng)泥桿菌的一個菌株，當(dāng)提供甘油和乙酸時能產(chǎn)生1，3_丙二醇，但在沒有甘油時不能由碳水化合物包括果糖和葡萄糖產(chǎn)生1，3_丙二醇。(Steib，《微生物學(xué)叢刊》(Arch. Microbiol. )140卷，139頁(1984))。最后，Tong等人(《應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)》34卷，149頁(199 )指出，轉(zhuǎn)化有編碼甘油脫水酶的dha調(diào)節(jié)子的重組大腸桿菌在沒有外源甘油時，不能由葡萄糖或木糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。提高由甘油生產(chǎn)1，3_丙二醇的產(chǎn)量的努力已經(jīng)有了報導(dǎo)，這些方法包含能提供還原性等價物的輔助底物，典型的輔助底物為可發(fā)酵的糖類。已有人宣稱弗氏檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270的靜止細(xì)胞在共發(fā)酵甘油和葡萄糖時，產(chǎn)量能夠提高(Gottschalk 等，上文；Tran-Dinh 等，DE 3734 764)；但肺炎克雷伯氏菌 ATCC25955 的生長細(xì)胞在共發(fā)酵甘油和葡萄糖時不能產(chǎn)生1，3_丙二醇(I-T.Tong，Ph.D.論文， Wisconsin-Madison大學(xué)(199 )。用重組大腸桿菌在甘油與葡萄糖或果糖中共發(fā)酵時也有產(chǎn)量提高的報導(dǎo)；但在沒有甘油時，不能產(chǎn)生1，3-丙二醇(Tong，上文)。在這些系統(tǒng)中， 單一有機(jī)體將碳水化合物用作產(chǎn)生NADH的原料，并為細(xì)胞的維持和生長提供能量和碳。這些公開內(nèi)容提示，糖類并沒有進(jìn)入產(chǎn)生1，3_丙二醇的碳流動。沒有一種情況是在不含外源甘油的情況下產(chǎn)生了 1，3_丙二醇。因此文獻(xiàn)清楚地提示，用單一有機(jī)體由一種碳水化合物生產(chǎn)1，3-丙二醇是不可能的。本發(fā)明解決的難題是用單一有機(jī)體由廉價的碳底物如葡萄糖或其它糖類生物生產(chǎn)1，3-丙二醇。這種生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物法需要甘油作為一個兩步順序反應(yīng)的底物， 在這個兩步順序反應(yīng)中，一種脫水酶(典型的酶是一種依賴輔酶B12的脫水酶)將甘油轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3-羥基丙醛，后者隨后被一種依賴于NADH-(或NADPH)的氧化還原酶還原成1， 3-丙二醇。由于所需的輔助因子非常復(fù)雜，因此用這種反應(yīng)順序生產(chǎn)1，3_丙二醇的工業(yè)方法必須使用完整細(xì)胞作為催化劑。而且，為使這種生產(chǎn)方法在經(jīng)濟(jì)上可行，需要比甘油或二羥基丙酮便宜一些的原料。葡萄糖和其它碳水化合物是合適的底物，但正如上面所討論的，它們干擾1，3-丙二醇的生產(chǎn)。結(jié)果沒有一種單一的有機(jī)體顯示出能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1， 3-丙二醇。本發(fā)明的申請者已經(jīng)解決了上述難題，本發(fā)明提供使用單一有機(jī)體將一種可發(fā)酵碳源直接生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法。葡萄糖被用作為模式底物，而且這種生物轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用于任何存在的微生物。攜帶一種脫水酶基因的微生物能將葡萄糖和其它糖類通過甘油降解途徑轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇，產(chǎn)量和選擇性都非常好。而且，本發(fā)明還可通用于包括任何一種能方便地轉(zhuǎn)化為1)甘油、幻二羥基丙酮、或幻甘油氧化而成的C3化合物(例如甘油3-磷酸)或4) 二羥基丙酮氧化而成的C3化合物(例如磷酸二羥基丙酮或甘油醛 3-磷酸)的碳底物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括使用單一微生物將一種碳底物生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法，這種方法通過將所說的微生物與所說的底物接觸來進(jìn)行，所說的微生物至少帶有一個能表達(dá)一種脫水酶的基因。這種微生物可以是野生型的，或者是遺傳性狀改變了的，例如一種重組微生物或微生物的一種突變體。脫水酶優(yōu)選為一種甘油脫水酶或一種二醇脫水酶。本發(fā)明進(jìn)一步包括上述方法的產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種粘粒，這種粘粒含有一個從肺炎克雷伯氏菌中分離的351Λ 的DNA片段，其中所說的DNA片段編碼一種有活性的甘油脫水酶，其限制酶切圖譜見圖1的泳道1和泳道2。這種粘粒在轉(zhuǎn)入一種微生物時，能代謝一種碳底物特別是葡萄糖產(chǎn)生1，
3-丙二醇。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種轉(zhuǎn)化的微生物，這種轉(zhuǎn)化的微生物包含宿主微生物和上面所說的粘?；蛩f粘粒的編碼一種活性功能蛋白但不是甘油脫水酶的任何DNA片段。本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3_丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將甘油與至少帶有一個能表達(dá)一種脫水酶的基因的單一微生物接觸，所用的微生物選自曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、沙門氏菌屬、芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3_丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將一種碳底物與至少帶有一個能表達(dá)一種脫水酶的基因的單一微生物接觸， 其中所說的基因編碼甘油脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、暗桿菌屬、泥桿菌屬和梭菌屬。本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)1，3_丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，這種生物轉(zhuǎn)化方法包括，在合適的條件下將一種碳底物與至少帶有一個能表達(dá)一種脫水酶的基因的單一微生物接觸， 其中所說的基因編碼甘油脫水酶，并分離自克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬。優(yōu)選的宿主微生物選自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬。本發(fā)明包含的重組微生物在生物保藏物簡述中進(jìn)行闡述。


圖 1 顯示粘粒 pKPl、pKP2 和 ρΚΡ4 的限制酶(EcoRI、BamHI、EcoRV 和 NotI)消化物及其在0. 8%瓊脂糖凝膠電泳上的分離圖譜，上述粘粒圖譜分別標(biāo)記為泳道1、2和4。分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物上樣在末端泳道。標(biāo)記為數(shù)字1和2的泳道代表含有一個甘油脫水酶的粘粒。圖2顯示pKPl的部分物理圖譜和各基因以DNA序列為基礎(chǔ)的位置。這些基因的鑒定基于推導(dǎo)出的開放閱讀框與Genbank數(shù)據(jù)庫的比較，比較所用的軟件為Wisconsin大學(xué)的序列分析軟件提供的Tfasta程序(Genetics Computer Group，1991年4月，第7版， 575 Science Drive, Madison, WI53711)。生物保藏物和序列表簡述含有粘粒pKPl的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci依照《布達(dá)佩斯條約》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名為ATCC69789，粘粒pKPl含有克雷伯氏菌基因組的編碼甘油脫水酶的部分。含有粘粒PKP4的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α依照《布達(dá)佩斯條約》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名為ATCC69790，粘粒ρΚΡ4含有克雷伯氏菌基因組的編碼二醇脫水酶的部分。轉(zhuǎn)化有一個含dhaB操縱子的質(zhì)粒的銅綠假單胞菌菌株ΡΑ02845 :pDT9依照《布達(dá)佩斯條約》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名為ATCC55760。轉(zhuǎn)化有非復(fù)制型質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母菌株MSP42.81依照《布達(dá)佩斯條約》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名為ATCC74363，非復(fù)制型質(zhì)粒上含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT基因的表達(dá)盒。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的啤酒酵母菌株pMCKl/10/17 (HM) #A, 在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_(dá)佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為 ATCC74370。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的淺青紫鏈霉菌菌株SL/14. 2，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_(dá)佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98052。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaBl、dhaB2和dhaB3操縱子的質(zhì)粒的地衣芽胞桿菌菌株BG188/piC6(克隆#8)，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_(dá)佩斯條約》于1996年5月9 日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98051。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的枯草芽胞桿菌菌株BG^64/pM27(克隆#1)，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_(dá)佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名為ATCC98050。轉(zhuǎn)化有一個含有dhaBl、 dhaB2、dhaB3和dhaT操縱子的質(zhì)粒的黑曲霉株TGR40-13，在本國際申請?zhí)峤磺耙勒铡恫歼_(dá)佩斯條約》于1996年5月9日保藏在ATCC,并被命名為ATCC74369?！癆TCC”指位于12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 U. S. A的美國典型培養(yǎng)物保藏中心國際保藏處。命名是指保藏物的登記號。本發(fā)明的申請人提供46個序列，這些序列遵循“專利申請中核苷酸和氨基酸序列標(biāo)準(zhǔn)表述的規(guī)定”(ΕΡ0局長決議的附錄I和附錄II，發(fā)表于OJ EPO的No 2增補件， 12/1992)，并遵循37C. F. R. 1. 821—1. 825和附錄A和B( “含有核苷酸和/或氨基酸序列的申請文件的要求”)。
具體實施例方式本發(fā)明提供一個在單一有機(jī)體中由可發(fā)酵的碳源生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。 這種方法包括一種含脫水酶的微生物，這種微生物與一種碳底物相接觸，而1，3_丙二醇從生長培養(yǎng)基中分離。這種單一有機(jī)體可以是野生型有機(jī)體，或者可以是攜帶有編碼脫水酶的基因的、遺傳性狀改變了的有機(jī)體。本發(fā)明提供一個快速、廉價和符合環(huán)保的1，3_丙二醇單體來源，這種1，3_丙二醇單體在聚酯和其它聚合物的生產(chǎn)中非常有用。在這里，下列詞可用于權(quán)利要求和說明書的解釋。在這里，“核酸”一詞指由單體(核苷酸)組成的大分子，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。核苷酸包含一分子的糖、磷酸以及一分子的嘌呤或嘧啶?！昂怂崞巍敝杆o核酸分子的一個部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)參與DNA到蛋白質(zhì)的信息轉(zhuǎn)移?！盎蚪M”指有機(jī)體中每個細(xì)胞所含的全部遺傳物質(zhì)?！昂塑账嵝蛄小币辉~指DNA或RNA的多聚物，它可以是單鏈的，也可以是雙鏈的，并可選擇地含有能摻入DNA或RNA多聚物的人工合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。在這里，“基本上相同”指DNA序列可有并不引起所編碼氨基酸改變的堿基改變，或者堿基改變使一個或多個氨基酸改變，但并不影響DNA序列所編碼蛋白質(zhì)的功能特性。所以應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明所包含的要大于序列特例。本發(fā)明也包括基本上不影響結(jié)果蛋白分子功能特性的序列修改，諸如在序列中產(chǎn)生沉默改變的刪除、插入或替換。例如，本發(fā)明包括反映遺傳密碼簡并性的基因序列改變，或在給定位點導(dǎo)致產(chǎn)生一個化學(xué)等價氨基酸的基因序列改變。因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一個疏水性稍弱的氨基酸殘基如甘氨酸的密碼子取代，或可被編碼疏水性更強(qiáng)的氨基酸殘基的密碼子取代，如被編碼纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼子取代。同樣，導(dǎo)致一個帶負(fù)電荷的殘基取代另一個帶負(fù)電荷的殘基的改變，如天冬氨酸取代谷氨酸，或一個帶正電荷的殘基取代另一個帶正電荷的殘基，如賴氨酸取代精氨酸，預(yù)計也可產(chǎn)生生物等價產(chǎn)物。導(dǎo)致蛋白分子的N末端部分和C末端部分改變的核苷酸改變也不一定改變蛋白的活性。在某些情況下，事實上需要使序列突變來研究改變對蛋白生物活性的影響。上面每種設(shè)想的修改和編碼產(chǎn)物保留的生物活性的鑒定都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。而且，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)知道，本發(fā)明所包括的“基本上相同”的序列也可由它們與這里所舉的序列例子在嚴(yán)格條件下(0. 1XSSC，0. 1% SDS，65°C )雜交的能力來定義?！盎颉敝副磉_(dá)一個特殊蛋白的核酸片段，包括編碼序列前面(5'非編碼區(qū))和后面(3'非編碼區(qū))的調(diào)節(jié)序列?！疤烊弧被颉耙吧汀钡幕蛑缸匀唤缰邪l(fā)現(xiàn)的帶有其自身調(diào)節(jié)序列的基因?！斑z傳改變的或遺傳改變的微生物”指適用于本發(fā)明的、天然遺傳機(jī)制經(jīng)歷了改變的任何微生物。微生物的遺傳改變可通過含異源核酸片段的載體轉(zhuǎn)化、誘變劑(例如，UV 燈，乙磺酸)誘變、或其它任何能在細(xì)胞基因組中產(chǎn)生穩(wěn)定改變的方法來進(jìn)行?！皹?gòu)建物”一詞指任何來源的質(zhì)粒、病毒、自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，它們可以是線型的或環(huán)狀的、單鏈的或雙鏈的DNA或RNA，在它們中，多種核苷酸序列組合或重組成一個獨特的結(jié)構(gòu)，這種獨特的結(jié)構(gòu)能將一個啟動子片段、所選基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3'非翻譯序列導(dǎo)入一個細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”指細(xì)胞在整合核酸后獲得新的基因。所獲得的基因可以整合在染色體中，也可作為染色體外復(fù)制序列導(dǎo)入?！稗D(zhuǎn)化子”指轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物?！斑z傳改變的”指用轉(zhuǎn)化或突變的方法改變遺傳物質(zhì)的過程。“表達(dá)”指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到基因產(chǎn)物。在這里，“質(zhì)?！被颉拜d體”或“粘?！敝溉旧w外的遺傳元件，它們常常帶有不是細(xì)胞中心代謝的一部分的基因，并且通常為雙鏈環(huán)狀的DNA分子形式?！懊撍浮敝溉魏文軌?qū)⒏视头肿赢悩?gòu)或轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛產(chǎn)物的酶。根據(jù)本發(fā)明的目的，脫水酶包括甘油脫水酶或二醇脫水酶，它們的優(yōu)選底物分別為甘油和1，2_丙二“碳底物”或“碳源”的意思是任何能被一種微生物代謝的碳源，其中底物中至少有一個碳原子。本發(fā)明的前提是，碳底物不是甘油或二羥基丙酮。重組有機(jī)體的構(gòu)建本發(fā)明的重組有機(jī)體含有將碳底物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的酶促途徑的編碼基因， 重組有機(jī)體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。在本發(fā)明中，編碼脫水酶的基因可從一個天然宿主如克雷伯氏菌中分離，并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌株DH5 α、ECL707和ΑΑ200。從一個細(xì)菌的基因組中獲取所需基因的方法在分子生物學(xué)領(lǐng)域中非常普通和熟知。例如，如果基因的序列是已知的，就用限制性內(nèi)切酶消化來構(gòu)建合適的基因組文庫，并可用與所需基因序列互補的探針進(jìn)行篩選。一旦分離到序列，就可用標(biāo)準(zhǔn)的引物指導(dǎo)下的擴(kuò)增方法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) (U. S. 4，683，202)擴(kuò)增DNA，來獲得大量適于用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA。另外，可以構(gòu)建粘粒文庫，即可將大片段的基因組DNA(35-451Λ)包裝到載體中， 用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。粘粒載體的獨特性在于能容納大量的DNA。粘粒一般至少有一個拷貝的cos DNA序列，cos序列對于外源DNA的包裝及隨后的環(huán)化是必需的。除了 cos序列外，這些載體還含有復(fù)制的起始區(qū)域(Col El)和藥物抗性標(biāo)記(如抗氨芐青霉素或抗新霉素的基因)。用粘粒來轉(zhuǎn)化合適細(xì)菌宿主的方法在Sambr00k，J.等，《分子克隆實驗指南》， 第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press中有詳細(xì)的介紹，在此引入作為參考。對典型的粘?？寺碚f，外源DNA分離后，使用合適的限制性內(nèi)切酶將其連接到粘粒載體的COS區(qū)域。然后含有線性外源DNA的粘粒載體與一個DNA包裝載體如λ噬菌體反應(yīng)。在包裝過程中，cos位點被切割，外源DNA被包裝到細(xì)菌病毒顆粒的頭部。然后這些顆粒被用于轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌。一旦注射到細(xì)胞內(nèi)部，外源DNA在cos 粘性末端的影響下環(huán)化。通過這種方式，外源DNA的大片段能被導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞，并在其中表達(dá)。粘粒載體和粘粒轉(zhuǎn)化方法在本發(fā)明的上下文中被用來從已知能將甘油加工成1， 3丙二醇的細(xì)菌種屬中克隆基因組DNA的大片段。特別是，來自肺炎克雷伯氏菌的基因組 DNA用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行了分離，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3A消化，然后插入到粘粒載體Supercos 1 ,并用GigapackII包裝抽提物包裝。載體構(gòu)建后，用此粘粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue MR細(xì)胞。使細(xì)胞在存在甘油的條件下生長，并分析培養(yǎng)基中1，3-丙二醇的形成，來篩選能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的轉(zhuǎn)化子。對兩個1，3_丙二醇陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了分析，并將其粘粒命名為pKPl和pKP2。 DNA測序表明它們與來自弗氏檸檬酸桿菌的甘油脫水酶有著廣泛的同源性，這證明這些轉(zhuǎn)化子含有編碼甘油脫水酶基因的DNA。對其它1，3-丙二醇陽性的轉(zhuǎn)化子也進(jìn)行了分析，它們的粘粒命名為ΡΚΡ4和pKP5。DNA測序表明這些粘粒帶有編碼二醇脫水酶基因的DNA。雖然本發(fā)明使用了來自一個克雷伯氏菌屬粘粒的分離基因，脫水酶基因的其它來源還可包括但不限于檸檬酸桿菌屬、梭菌屬和沙門氏菌屬。能正向影響1，3_丙二醇產(chǎn)生的其它基因可在合適的宿主中表達(dá)。例如很可能非常需要甘油降解途徑和/或其它途徑中的特定酶超量表達(dá)，比現(xiàn)在在野生型細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平要高得多。這可通過將編碼這些酶的基因選擇性克隆到多拷貝質(zhì)粒中或?qū)⑦@些基因置于一個誘導(dǎo)型或組成型的強(qiáng)啟動子的后面來完成。超量表達(dá)所需蛋白的方法在分子生物學(xué)領(lǐng)域非常普通和熟知，在以上Sambrook文中可找到例子。而且，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法對特定基因進(jìn)行特異性地刪除，會明顯影響1，3_丙二醇的產(chǎn)生。這些方法的例子可在《酶學(xué)方法》,217卷，R. Wu編，Academic Press San Diego (1993)中找到。突變體應(yīng)當(dāng)理解，除了舉例所用的細(xì)胞，本發(fā)明還能使用有著單一或多個突變的細(xì)胞，這些突變被特別設(shè)計來增加1，3-丙二醇的產(chǎn)量。通常將碳原料偏離到不能產(chǎn)生1，3_丙二醇的途徑的細(xì)胞，或出現(xiàn)明顯的分解代謝產(chǎn)物阻遏的細(xì)胞，都可通過突變來消除這些表型缺陷。例如，許多野生型細(xì)胞可因培養(yǎng)基中的葡萄糖和副產(chǎn)物產(chǎn)生分解代謝阻遏?？梢岳斫膺@些有機(jī)體的突變株，如能抵抗葡萄糖的阻遏而生產(chǎn)1，3_丙二醇，將在本發(fā)明中特別有用。產(chǎn)生突變體的方法在本領(lǐng)域中非常普通和熟知。例如，野生型細(xì)胞可暴露在各種試劑如輻射或化學(xué)誘變劑中，然后篩選所需要的表型。當(dāng)用輻射來產(chǎn)生突變時，紫外線(UV) 或離子輻射都可以使用。用于遺傳突變的合適短波紫外線的波長范圍為200nm至300nm， 優(yōu)選波長為2Mnm。這個波長的UV輻射原則上導(dǎo)致核酸序列中的鳥嘌呤和胞嘧啶改變?yōu)橄汆堰屎托叵汆奏ぁＲ驗樗械募?xì)胞都有DNA修復(fù)機(jī)制，能修復(fù)多數(shù)UV誘導(dǎo)的突變，可加入試劑如咖啡堿和其它抑制劑來干擾修復(fù)過程，使有效突變的數(shù)量變得最大。使用波長在 300nm至400nm范圍的長波UV誘變也可以，但除非與多種激活劑如能與DNA作用的補骨質(zhì)素染料聯(lián)用，一般不如短波UV有效。用化學(xué)試劑來產(chǎn)生突變體也非常有效，常用的物質(zhì)包括能影響非復(fù)制DNA的化合物如HNO2和NH2OH,以及影響復(fù)制DNA的試劑如吖啶染料，吖啶染料因能引起移碼突變而非常引人注目。用輻射或化學(xué)試劑產(chǎn)生突變體的特殊方法在本領(lǐng)域中文獻(xiàn)非常多。例如見， Thomas D. Brock，《生物技術(shù)工業(yè)微生物教程》，第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.， Sunderland, ΜΑ.，或Deshpande，Mukund V.，《應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)》，36卷，227頁， (1992)，這里引入作為參考。誘變發(fā)生后，具有所需表型的突變體可用多種方法進(jìn)行選擇。隨機(jī)篩選是最常用的，即選擇能產(chǎn)生所需產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的誘變細(xì)胞。另外，可使誘變?nèi)后w在只有抗性克隆能夠生長的選擇培養(yǎng)基上生長來選擇性地分離突變體。突變體選擇的方法在工業(yè)微生物領(lǐng)域已經(jīng)非常完備和熟知。見Brook,上文，DeMancilha等，《食品化學(xué)》，14卷，313頁，(1984)。
1,3-丙二醇產(chǎn)生途徑中的突變和轉(zhuǎn)化代表性的酶途徑。從葡萄糖產(chǎn)生1，3_丙二醇可由下面的系列步驟來完成。這個步驟系列是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的多種途徑的代表。葡萄糖經(jīng)過一系列步驟在糖酵解途徑的酶催化下轉(zhuǎn)化為磷酸二羥基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。然后，甘油可由 DHAP水解成二羥基丙酮(DHA)后還原形成，或由DHAP還原成甘油3-磷酸(G3P)后水解來形成。水解步驟可由各種已知沒有底物特異性的細(xì)胞磷酸酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。還原步驟可由一種NAD+(或NADP+)相連的宿主酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。值得注意的是dha調(diào)節(jié)子含有一個甘油脫氫酶(E. C. 1. 1. 1. 6)，這個酶催化方程3的逆反應(yīng)。甘油一3-HP+H20(方程 1)3-HP+NADH+H+ — 1,3-丙二醇 +NAD+ (方程 2)甘油+NAD+ — DHA+NADH+H+ (方程 3)甘油經(jīng)3-羥基丙醛(3-HP)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇，這已在前面作了詳細(xì)介紹。從甘油產(chǎn)生3-HP(方程1)是由脫水酶催化的，脫水酶可以由宿主編碼或用轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入宿主。這種脫水酶可以是甘油脫水酶(E. C. 4. 2. 1. 30)、二醇脫水酶(E. C. 4. 2. 1. 28) 或任何能夠催化這個轉(zhuǎn)化的酶。甘油脫水酶是由dha調(diào)節(jié)子編碼的，而二醇脫水酶不是。 從3-HP產(chǎn)生1，3_丙二醇(方程幻是由一種NAD+(或NADP+)相目連的宿主酶催化，或者這種活性可用轉(zhuǎn)化來導(dǎo)入宿主。這個產(chǎn)生1，3_丙二醇的最后反應(yīng)可由1，3_丙二醇脫氫酶 (E. C. 1. 1. 1. 202)或其它乙醇脫氫酶催化。影響碳通道的突變和轉(zhuǎn)化。多種在1，3-丙二醇產(chǎn)生途徑含有變異的突變有機(jī)體在本發(fā)明中非常有用。例如將一個丙糖磷酸異構(gòu)酶突變(tpi_)引入本發(fā)明的微生物是一個應(yīng)用突變來促進(jìn)碳通道運行的例子。突變可直接針對一個結(jié)構(gòu)基因來修復(fù)或提高一個酶的活性，或直接針對一個調(diào)節(jié)基因來調(diào)節(jié)一個酶活性的表達(dá)水平。另外，轉(zhuǎn)化和突變可組合使用來控制特定的酶活性，從而增加1，3-丙二醇的生成。因此，對能提高1，3_丙二醇產(chǎn)生的全細(xì)胞催化能力的修飾也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基和碳底物本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的碳底物包括但不局限于單糖 (如葡萄糖和果糖)、寡糖(如乳糖和蔗糖)、多糖(如淀粉或纖維素)或其混合物和從可再生的原料(如酪清、玉米漿、蔗糖甜菜漿、大麥麥芽)獲得的未純化的混合物。另外，碳底物還可以是已經(jīng)證明可代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵生物化學(xué)中間物的一碳底物如二氧化碳或甲醇。由單一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸)生產(chǎn)甘油在嗜甲基酵母(K. Yamada等，《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》， 53卷第2期，541-543頁，(1989))和細(xì)菌(Hunter等，《生物化學(xué)》，24卷，4148-4155頁， (1985))中都已有報導(dǎo)。這些有機(jī)體能同化氧化狀態(tài)的范圍從甲醇到甲酸的單碳化合物，并產(chǎn)生甘油。碳同化的途徑可通過核酮糖單磷酸、絲氨酸、或木酮糖單磷酸(Gottschalk，《細(xì)菌代謝》，第二版，Springer-Verlag =New York(1986))等途徑。核酮糖單磷酸途徑包括甲酸與核酮糖-5-磷酸結(jié)合而形成一個六碳糖，然后這個六碳糖轉(zhuǎn)化為果糖并最終轉(zhuǎn)化為三碳產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸。同樣，絲氨酸途徑經(jīng)過亞甲基四氫葉酸將一碳化合物同化到糖酵解途徑中。除了一種或兩種碳底物外，嗜甲基有機(jī)體還已知有著利用多種含碳化合物(如甲胺和葡萄糖胺)和多種氨基酸的代謝活性。例如，嗜甲基酵母已知可利用甲胺的碳來形成海藻糖和甘油(Bellion等，《微生物在一碳化合物上的生長》(Microb. Growth Cl Compd), [Int. Symp]，第 7 期(1993),415-32 頁.編輯Murrel，J. Collin ;Kelly，Don P.出版 Intercept,Andover,UK)。同樣，假絲酵母屬的許多種能代謝丙氨酸或油酸(Suiter等，《微生物學(xué)叢刊》，(1990)，153卷第5期，485-9頁)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明所用的碳源可包括多種含碳底物，并僅由有機(jī)體的選擇來限制。雖然可以理解上述所有提到的碳底物及其混合物在本發(fā)明中都是適用的，但優(yōu)選的底物是葡萄糖、果糖、蔗糖或甲醇。除了一種合適的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的合適的礦物質(zhì)、鹽、輔助因子、緩沖液和其它成分，這些成分應(yīng)適于培養(yǎng)物的生長和啟動1，3_丙二醇產(chǎn)生所必需的酶促途徑。特別應(yīng)當(dāng)注意Co(II)的鹽類和/或維生素B12或其前體。培養(yǎng)條件細(xì)胞一般在合適的培養(yǎng)基中30°C進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)選的生長培養(yǎng)基為普通的商業(yè)制備培養(yǎng)基,例如Luria Bertani (LB)肉湯、Sabouraud Dextrose(SD)肉湯、或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。其它的精確或合成的生長培養(yǎng)基也可以使用，而且特殊微生物生長的合適培養(yǎng)基應(yīng)為微生物學(xué)和發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。還可在反應(yīng)培養(yǎng)基中使用已知能直接或間接調(diào)節(jié)代謝終產(chǎn)物抑制的試劑，如環(huán)腺苷2' 3'-單磷酸。同樣，還可將已知能調(diào)節(jié)酶活性從而導(dǎo)致1，3_丙二醇產(chǎn)生增加的化合物(如甲基紫精)與遺傳操作結(jié)合使用， 或用來代替遺傳操作。發(fā)酵的合適pH范圍在pH5. O至pH9. O之間，其中pH6. O至pH8. O為優(yōu)選的初始條件。反應(yīng)可在有氧或無氧的條件下進(jìn)行，其中，優(yōu)選的條件是無氧或微氧。分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵本方法包括一個分批發(fā)酵的方法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是一個封閉的系統(tǒng)，培養(yǎng)基的成分在發(fā)酵開始時設(shè)置好，并在發(fā)酵過程中不再人為改變。因此，在發(fā)酵開始時培養(yǎng)基與所需的有機(jī)體或有機(jī)體混合物一起接種，在發(fā)酵開始后不再向系統(tǒng)中加入任何東西。在典型情況下，“分批”發(fā)酵是就碳源的加入而言的，人們常常需要控制某些因素如PH和氧濃度。 在分批發(fā)酵系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝和各組分的生物量持續(xù)改變直到發(fā)酵結(jié)束。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞從靜止的延遲期進(jìn)入高速生長的對數(shù)期并最后進(jìn)入穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期中，細(xì)胞的生長率降低或停止。如果不進(jìn)行處理，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞會最終死亡。處于對數(shù)期的細(xì)胞通常產(chǎn)生大多數(shù)的終產(chǎn)物和中間物。補料分批系統(tǒng)是標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一個變化。補料分批發(fā)酵方法也適用于本發(fā)明， 它除了包括經(jīng)典的分批系統(tǒng)外，還包括在發(fā)酵過程中增加底物的量。補料分批系統(tǒng)在分解代謝物抑制細(xì)胞代謝時非常有用，因為在這種情況下需要限制培養(yǎng)基中的底物量。測定補料分批系統(tǒng)中的實際底物濃度非常困難，因而只能以可測量因素的變化為基礎(chǔ)進(jìn)行估計， 例如用PH、溶解氧和廢氣如(X)2的分壓的變化進(jìn)行估計。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵在本領(lǐng)域非常普通和熟知，相應(yīng)的例子可在以上Brock文中找到。雖然本發(fā)明以分批模式進(jìn)行，但應(yīng)當(dāng)理解這些方法也適合于連續(xù)發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵是一個開放系統(tǒng)，在連續(xù)發(fā)酵中，一種精確發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)加入生物反應(yīng)器中，同時等量的反應(yīng)培養(yǎng)基被移出。連續(xù)發(fā)酵一般使培養(yǎng)物維持持續(xù)的高濃度，而細(xì)胞主要處于對數(shù)生長期。連續(xù)發(fā)酵允許對影響細(xì)胞生長或終產(chǎn)物濃度的一個因素或多種因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，一種方法能嚴(yán)格保持限制性養(yǎng)分如碳源或氮水平，而讓其它參數(shù)改變。在其它系統(tǒng)中， 可以連續(xù)改變多種影響生長的因子，而細(xì)胞濃度(用細(xì)胞濁度進(jìn)行測量)保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)盡量保持穩(wěn)定的生長環(huán)境，因此，發(fā)酵中由于取出培養(yǎng)基而造成的細(xì)胞損失必須與細(xì)胞生長率相平衡。在連續(xù)發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)養(yǎng)分和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成率達(dá)到最大的技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域是眾所周知的，而且多種方法已由Brock，上文，作了詳細(xì)介紹。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可使用分批、補料分批或連續(xù)的方法實現(xiàn)，任何已知的發(fā)酵模式都是適用的。另外，應(yīng)當(dāng)理解細(xì)胞可作為全細(xì)胞催化物固定在底物上，為1，3_丙二醇的生成提供發(fā)酵環(huán)境。1,3-丙二醇的純化和鑒定從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化1，3-丙二醇的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，丙二醇可用下述方法從細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得，這個方法包括用一種有機(jī)溶劑抽提反應(yīng)混合物、蒸餾和柱層析 (U. S. 5，356，812)。在這個過程中，一個特別好的有機(jī)溶劑是環(huán)己烷(U. S. 5，008，473)?？梢酝ㄟ^對培養(yǎng)基進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)來直接鑒定1，3-丙二醇。在本發(fā)明中優(yōu)選的方法是在一個分析用離子交換柱上，使用等梯度的0. OlN的硫酸作流動相對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分析。細(xì)胞適用于本發(fā)明的細(xì)胞包括那些攜帶脫水酶的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，合適的細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，并僅受它們表達(dá)活性脫水酶的能力的限制。在本發(fā)明中特別有用的細(xì)胞是能方便地應(yīng)用于大規(guī)模發(fā)酵方法的細(xì)胞。這樣的有機(jī)體在工業(yè)生物工程領(lǐng)域是眾所周知的，它們的例子可在《應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)的重組微生物》，Murooka等編輯， Marcel Dekker, Inc. ,New York,New York(1994)中找到，包括發(fā)酵型的細(xì)菌以及酵母和絲狀真菌。典型的酶可以是甘油脫水酶也可以是二醇脫水酶，其特異性底物分別為甘油和1，
2-丙二醇。脫水酶能將甘油轉(zhuǎn)化為羥基丙醛(3-HPA)，然后3-HPA轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇。含有這個途徑的細(xì)胞可包括來自檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬和乳桿菌屬的突變或重組有機(jī)體。為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的能通過發(fā)酵產(chǎn)生甘油的微生物都可以作為重組脫水酶的宿主，例如曲霉屬、酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、Dimaliella、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬和甲基菌屬。其它在本發(fā)明中適合用作宿主的細(xì)胞包括芽胞桿菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬和鏈霉菌屬。若不囿于理論，可以認(rèn)為，自然界中存在的、屬于上面所提到種類的有機(jī)體都適用于本發(fā)明。在申請人的實驗工作基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)理解多種細(xì)胞可用于本發(fā)明。例如申請人已經(jīng)證明，在遺傳和表型組合上差別很大的多種細(xì)胞都能將一種合適的碳底物生物轉(zhuǎn)化為1，
3-丙二醇，所舉的細(xì)胞例子包括一個組合有dha基因的肺炎克雷伯氏菌突變菌株、含有克雷伯氏菌屬基因組中甘油或二醇脫水酶編碼基因的元件的重組大腸桿菌菌株、和也用克雷伯氏菌屬的元件轉(zhuǎn)染并在編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因上帶有一個突變的重組大腸桿菌 (tpil菌株。
雖然，即使在存在葡萄糖和木糖的情況下，含有來自肺炎克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子的大腸桿菌重組子也能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇(Tong等，《應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)》，34卷，149頁(199 )。但在僅有葡萄糖存在的情況下，在這些有機(jī)體中不能檢測到1， 3-丙二醇。與這一公開內(nèi)容不同，本發(fā)明的申請人發(fā)現(xiàn)，三株大腸桿菌在沒有外源加入甘油存在的情況下由葡萄糖原料產(chǎn)生1，3-丙二醇，這三株大腸桿菌攜帶兩種獨立分離的、含來自肺炎克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子的粘粒中的一種。攜帶有含肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子的粘粒載體ρΚΡ-l或ρΚΡ-2的大腸桿菌菌株ECL707，顯示在沒有外源加入甘油的情況下可以檢測到由葡萄糖產(chǎn)生的1，3_丙二醇，雖然產(chǎn)量不高(實施例4)。從另一個宿主有機(jī)體-DH5 α構(gòu)建而來的重組大腸桿菌菌株也含有ρΚΡ-l或ρΚΡ_2粘粒載體，這種菌株被發(fā)現(xiàn)在合適的條件下由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇比ECL707重組體有效得多，(實施例3)。在實施例4的條件下，由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇更有效的菌株是含有粘粒載體ρΚΡ-l或ρΚΡ-2 的重組大腸桿菌菌株ΑΑ200，實施例2，大腸桿菌ΑΑ200含有一個有缺陷的丙糖磷酸異構(gòu)酶 (tpD。從轉(zhuǎn)化反應(yīng)獨立分離株的混合物中選擇了 ΑΑ200-ρΚΡ1的一個菌株作進(jìn)一步的研究，這株細(xì)菌經(jīng)過一個兩階段反應(yīng)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇。在第一階段，菌株 ΑΑ200-ρΚΡ1-5在不含葡萄糖和甘油的條件下生長到高細(xì)胞濃度。在第二階段，將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸浮在含有葡萄糖但沒有甘油的培養(yǎng)基中，細(xì)胞就會以很高的轉(zhuǎn)化率和選擇性將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，實施例5。雖然在免疫化學(xué)、色譜和遺傳上不同，依賴于輔酶B12的酶-甘油脫水酶(E. C. 4. 2. 1. 30)和二醇脫水酶(E. C. 4. 2. 1. 28)都能催化甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛。dha調(diào)節(jié)子中包含甘油脫水酶，但不含二醇脫水酶。肺炎克雷伯氏菌ATCC87M含有一個二醇脫水酶而不是甘油脫水酶，它能將甘油轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇O^rage等，《細(xì)菌學(xué)雜志》，149卷，413頁，(1982))。重組大腸桿菌菌株ECL707和AA200均含有能編碼二醇脫水酶的粘粒PKP4，它們都能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，實施例2和實施例4。肺炎克雷伯氏菌ECL2106是從一個天然存在的菌株通過誘變制備而來的(Ruch 等，《細(xì)菌學(xué)雜志》124卷，348頁，(197 )，它能夠組成型表達(dá)dha調(diào)節(jié)子(Ruch等，上文； Johnson等，《細(xì)菌學(xué)雜志》164卷，479頁(1985))。用同樣方法制備了具有同樣表型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的一個衍生菌株Oarage等，《細(xì)菌學(xué)雜志》149卷，413頁(1982))。 克雷伯氏菌屬dha結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)部分受一個抑制子的控制(dha R的產(chǎn)物)(Sprenger等， 《普通微生物學(xué)雜志》135卷，1255頁(1989))。本發(fā)明的申請人已經(jīng)證示，含有組成型dha 結(jié)構(gòu)基因的ECL2106能在沒有外源加入甘油的條件下，由葡萄糖原料生產(chǎn)1，3-丙二醇，實施例6。這與野生型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955相反。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955在相同條件下不能產(chǎn)生可檢測水平的1，3-丙二醇，實施例6。ECL2016中dha結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)一步受到分解代謝物表達(dá)的控制(Sprenger 等，《普通微生物學(xué)雜志》135卷，1255頁，(1989))。將必需的結(jié)構(gòu)基因置于另外的啟動子控制下能夠消除分解代謝物抑制。這一點已在弗氏檸檬酸桿菌的1，3_丙二醇氧化還原酶 (dhaT)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的二醇脫水酶中得到了證實(Daniel等，《細(xì)菌學(xué)雜志》177卷， 2151頁(1995)和Tobimatsu等，《生物與化學(xué)雜志》270卷，7142頁，(1995))。通過這種方式在ECL2106中消除分解代謝物抑制，成功地提高了在沒有外源甘油的情況下由葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇的產(chǎn)量。按前述的方法使用合適的碳通道可進(jìn)一步提高1，3-丙二醇產(chǎn)量，例如使用tpi—突變。因為檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌的dha調(diào)節(jié)子非常相似。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在克雷伯氏菌中用來在沒有外源甘油的條件下由葡萄糖生產(chǎn)1，3_丙二醇的技術(shù)也可用于檸檬酸桿菌。而且，因為丁酸梭菌的甘油代謝與肺炎克雷伯氏菌相同Geng等，《生物技術(shù)與生物工程》44卷，902頁，(1994))，這些技術(shù)也可用于梭菌。實施例通用方法磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化的過程是本領(lǐng)域眾所周知的，在下面的實施例中適用的技術(shù)可在Sambrook，J等，《分子克隆實驗指南》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中找到。適用于細(xì)菌培養(yǎng)物維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在下面的實施例中適用的技術(shù)可在《普通細(xì)菌學(xué)方法手冊》(Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow，Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 和 G. Briggs Phillips,編輯)，美國微生物學(xué)會，Washington, DC(1994)中，或在Thomas D. Brock的《生物技術(shù)工業(yè)微生物教程》,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, ΜΑ.中找到。除非另行說明，所有用于細(xì)菌生長和維持的試劑和材料都購自Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI),DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBC0/BRL(Gaithersburg，MD)和Sigma Chemical Company(St Louis, M0)。縮寫的含義如下“h”指小時，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“ L ”指升，50amp為50ug/mL的氨芐青霉素，LB-50amp為含50ug/mL氨芐青霉素的 Luria-Bertani 肉湯。在表中使用了下列縮寫?！癈on”為轉(zhuǎn)化，“％1”是以碳為基礎(chǔ)的選擇性，“nd”指沒
有檢測。酶試驗無細(xì)胞抽提物中的甘油脫水酶用1，2-丙二醇作底物來測定。這個試驗的基礎(chǔ)是醛與甲基苯并-2-噻唑酮腙反應(yīng)，詳見i^rage和faster的介紹(《生物物理與生物化學(xué)學(xué) m (B. B. A) 569, 249, (1979))。1，3-丙二醇氧化還原酶有時被稱為1，3-丙二醇脫氫酶，其活性可按照J(rèn)ohson和Lin，《細(xì)菌學(xué)雜志》169卷，2050頁(1987)介紹的方法進(jìn)行測定。1，3-丙二醇的分離和鑒定甘油到1，3_丙二醇的轉(zhuǎn)化用HPLC來監(jiān)測，使用色譜領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和材料進(jìn)行分析。一個合適的方法是使用一臺WatersMaxima 820HPLC系統(tǒng)，并用 UV(2IOnm)和RI進(jìn)行檢測。樣品注入一個已裝有Shodex SH-IOllP預(yù)裝柱(6mmX50mm)的 Shodex SH-IOll 柱(8mmX 300mm，購自 Waters，Milford，MA)，溫度控制在 50°C，使用 0. OlN H2SO4作流動相，流速為0. 5mL/min。當(dāng)需要進(jìn)行定量分析時，樣品與作為外部標(biāo)準(zhǔn)的一定量的三甲基乙酸一起制備。一般來說，甘油(RI檢測)、1，3_丙二醇(RI檢測)和三甲基乙酸 (UV和RI檢測)的保留時間分別為20. 67分、20. 68分和35. 03分。1，3_丙二醇的產(chǎn)生用GC/MS來證實。使用GC/MS領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的技術(shù)和材料進(jìn)行分析。一個合適的方法是使用一臺與Hewlett Packard 5971系列質(zhì)量選擇檢測器(EI)偶聯(lián)的Hewlett Packard 5890系列II氣相色譜和一個HP-INNOWax柱(30m長，0. 25mm i. d. ,0. 25micro film厚)。所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的保留時間和質(zhì)譜圖與確定的 1，3_丙二醇(m/e :57,58)進(jìn)行比較。另一個GC/MS方法包含樣品的衍生。在1. OmL樣品(例如，培養(yǎng)物上清)中加入 30uL濃(70% ν/ν)高氯酸，混勻后將樣品冷凍并干燥。在干燥物中加入雙(三甲基硅)三氯乙胺吡啶的1 1混合物(300uL)，劇烈混勻，在65°C放置1小時。離心除去不溶物，獲得的液體分為兩相，用上層液體進(jìn)行分析。在一個DB-5柱(48m，0. 25mm I. D.，0. 25um film 厚；獲自J&W Scientific)上對樣品進(jìn)行層析。從培養(yǎng)物上清中獲得的1，3-丙二醇衍生物的保留時間和質(zhì)譜圖與確定的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較。TMS衍生的1，3_丙二醇的質(zhì)譜圖包括205、 177、130和115AMU的特征離子。肺炎克雷伯氏菌粘粒文庫的構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)在IOOmL LB培養(yǎng)基中37°C通氣培養(yǎng)8小時。使用 DuPont Sorvall GLC 2. B離心機(jī)在室溫下將細(xì)菌(每管25ml) 3000rpm離心15分鐘。取細(xì)菌沉淀并棄去上清。將細(xì)菌沉淀在_20°C冷凍。按下面指出的方法分離染色體DNA，并注意避免DNA剪切(即避免渦旋)。將每管細(xì)菌重新懸浮在2. 5mL的50mM Tris-IOmM EDTA中， 加入500uL溶菌酶(lmg/mL)。溫和懸浮細(xì)菌，并將懸液在37°C保溫15分鐘。在懸液中加入十二烷基硫酸鈉至終濃度為0.5%。這會導(dǎo)致溶液變清。在懸液中加入蛋白酶K(50ug/ mL)并55°C保溫2小時。將試管取出轉(zhuǎn)至一個冰槽中，并加入氯化鈉至終濃度0. 4M。在溶液中加入兩倍體積的乙醇。用一根玻璃管插入界面使DNA溫和地纏繞在其上。將DNA浸入一個含70 %乙醇的試管中。真空干燥后，將DNA重新懸浮于50uL水中，并用分光光度法測定DNA的濃度。取小份DNA稀釋后在0. 5%的瓊脂糖凝膠上觀察DNA的完整性。染色體DNA按Sambrook等，上文，介紹的方法用Sau 3A部分消化，DNA (0. 2ug)用 2單位的Sau 3A(Promega, Madison, WI)在室溫下消化，反應(yīng)總體積為200uL。在0、5、10 和20分鐘分別取樣(50uL)，轉(zhuǎn)入含5umol EDTA的試管中，將這些試管在70°C保溫10分鐘。取一份(2uL)在0.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分析，確定消化的水平，剩余的樣品G8uL) 在-20°C保存。將凝膠用溴化乙啶染色并在UV下觀察來測定染色體的部分消化。觀察到染色體DNA的大小隨時間的延長而變小，這表明染色體DNA的變小是由于Sau 3A作用。用標(biāo)準(zhǔn)程序方法從剩余樣品中抽提DNA (Sambrook等，上文)。肺炎克雷伯氏菌的部分消化DNA粘粒文庫用Supercos粘粒載體試劑盒和 GigapackII包裝抽提物制備，所用的試劑購自Mratagene (La Jolla, CA)。操作按廠家提供的說明進(jìn)行。包裝后的肺炎克雷伯氏菌用轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLl-Blue MR來測定，含有4X IO4 至1.0X105的噬菌體滴度。從6個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中分離到了粘粒DNA，并發(fā)現(xiàn)它們含有大的DNA插入片段 (25 至 30kb)。實施例1用粘粒DNA克隆和轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞來表達(dá)1，3_丙二醇培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基S12用來篩選能產(chǎn)生1，3_丙二醇的細(xì)菌轉(zhuǎn)化子。S12培養(yǎng)基含有 IOmM 硫酸銨、50mM 磷酸鉀緩沖液，pH7. 0、2mM MgCl2、0. 7mM CaCl2、50uM MnCl2UuM FeCl3, IuM ZnCl2U. 7uM CuSO4,2. 5uM CoCl2、2. 4uM Na2MoO4 和 2uM 鹽酸硫胺素。
培養(yǎng)基A用于生長和發(fā)酵，它包含10mM硫酸銨、50mMM0PS/K0H緩沖液，pH7. 5、5mM 磷酸鉀緩沖液，pH7.5、2mM MgCl2、0. 7mM CaCl2、50uM MnCl2UuM FeCl3UuM ZnCl2U. 72uM CuSO4,2. 53uM CoCl2,2. 4uM Na2Mo04、2uM 鹽酸硫胺素、0. 01%酵母抽提物、0. 01%酪蛋白氨基酸、0. 8ug/mL維生素B12和50amp。根據(jù)需要，培養(yǎng)基A可補加0. 2 %的甘油或0. 2 %的甘油加0.2%的D-葡萄糖。細(xì)胞肺炎克雷伯氏菌ECL2106 (Ruch等，《細(xì)菌學(xué)雜志》IM卷，348頁(1975))在文獻(xiàn)中也被稱為產(chǎn)氣克雷伯氏菌或產(chǎn)氣氣桿菌。該菌獲自E. C. C. Lin(Harvard Medical School, Cambridge, MA)，并作為實驗室培養(yǎng)物保藏。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville MD)。大腸桿菌DH5a購自Gibco/BRL，并用分離自肺炎克雷伯氏菌ATCC25955、含有編碼甘油或二醇脫水酶的基因的粘粒DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。含有甘油脫水酶的粘粒被確定為pKPl 和pKP2，含有二醇脫水酶的粘粒被確定為pKP4。轉(zhuǎn)化后的DH5 α細(xì)胞被確定為DH5 a -pKPl、 DH5 a -pKP2 禾口 DH5 a -pKP4。大腸桿菌ECL707(Sprenger等，《普通微生物學(xué)雜志》135卷，1255頁(1989))獲自 E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, ΜΑ)，并轉(zhuǎn)化有相同的來自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA。含有甘油脫水酶基因的轉(zhuǎn)化子被確定為ECL707-pKPl和ELC707_pKP2，含有二醇脫水酶基因的轉(zhuǎn)化子被確定為ECL707-pKP4。大腸桿菌AA200 (Anderson等，《普通微生物學(xué)雜志》62卷，3 頁(1970))購自 Genetic Stock Center, Yale University (New Haven, CT),這個菌株在 tpi 基因上有一個突變。用克雷伯氏菌粘粒DNA轉(zhuǎn)化該菌株得到含有甘油脫水酶基因的ΑΑ200-ρΚΡ1和 AA200-pKP2重組有機(jī)體，和含二醇脫水酶基因的AA200-pKP4重組有機(jī)體。DH5a用肺炎克雷伯氏菌DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLl-Blue MR，選取約含1000個菌落的六個轉(zhuǎn)化平板，用5mL LB培養(yǎng)基洗滌平板并離心。收集菌體并重新懸浮在5mL LB培養(yǎng)基+甘油中。取一份(50uL)接種到裝有S12合成培養(yǎng)基并含有0.2%甘油+400ng/毫升的維生素B12+0. 001%酵母抽提物+50amp的15mL試管中。試管中裝滿培養(yǎng)基直至頂部，用封口膜封好并在30°C保溫。48小時后觀察到輕微的渾濁。按上面所述方法分別在78小時和132 小時取一份培養(yǎng)物來分析產(chǎn)物的分布。各份培養(yǎng)物均為1，3_丙二醇陽性，時間點越后，產(chǎn)生的1，3-丙二醇越多。將檢測為1，3-丙二醇生成陽性的細(xì)菌系列稀釋后涂布到LB-50amp平板上來分離單個的菌落。共分離到48個單菌落并再次檢測它們能否產(chǎn)生1，3-丙二醇。從6個獨立克隆中分離粘粒DNA并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中。再次檢測轉(zhuǎn)化子能否產(chǎn)生1，3_丙二醇。對兩個轉(zhuǎn)化子做了進(jìn)一步的分析，并將它們命名為DH5 a -pKPl和DH5 a -pKP2。將pKPl 中一段 12. Ikb 的 EcoRI-SalI 片段亞克隆到 pIBI31(IBI Biosystem, New Haven, CN)中，對這段序列做序列分析并將其命名為ρΗΙ^8_26 (SEQ ID NO :1)。測序結(jié)果揭示了編碼甘油脫水酶的dhaT操縱子的相關(guān)開放閱讀框和必需調(diào)節(jié)基因的位置，參見SEQ ID NO :1，在堿基1-399上發(fā)現(xiàn)了一個編碼二羥基丙酮激酶的開放閱讀框dhaK;在堿基983-2107上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫氫酶的開放閱讀框dhaD ；在堿基2209-4134上發(fā)現(xiàn)了編碼抑制子的開放閱讀框dhaR ；在堿基5017-6180上發(fā)現(xiàn)了編碼1，3_丙二醇氧化還原酶的開放閱讀框dhaT;在堿基7044-8711上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶α亞單位的開放閱讀框 dhaBl ；在堿基87M-9308上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶β亞單位的開放閱讀框dhaB2 ；在堿基 9311-9736上發(fā)現(xiàn)了編碼甘油脫水酶Y亞單位的開放閱讀框dhaB3 ；并在堿基9749-11572 上發(fā)現(xiàn)了編碼未知功能蛋白的開放閱讀框dhaBX。用來自肺炎克雷伯氏菌的包裝好的粘粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLl-BlueMR，挑取單個菌落接種到含有200uL S15培養(yǎng)基(硫酸銨，10mM、磷酸鉀緩沖液，pH7. 0，ImM.MOPS/KOH, pH7. 0、 50mM、MgCl2, 2mM、CaCl2,0. 7mM、MnCl2, 50uM、FeCl3, luM、ZnCl2, luM、CuSO4,1. 72uM、CoCl2, 2. 53uM,Na2MoO4, 2. 42uM和鹽酸硫胺素，2uM) +0. 2%甘油+400ng/mL 維生素 B12+0. 001%酵母抽提物+50ug/mL氨芐青霉素的微滴定孔中。除了接種微滴定孔外，還接種一個含LB-50amp 的主平板，96小時后，取出IOOuL,在一個含0. 2微米尼龍纖維膜的Rainin微離心管中離心，細(xì)菌留在膜上，將膜處理后做HLPC分析。在篩選了 240個克隆后，鑒定到了證明能產(chǎn)生 1，3_丙二醇的陽性克隆。共鑒定到了三個陽性克隆，其中兩個能在LB-50amp上生長，另一個不能。從兩個能在LB-50amp上生長的陽性克隆的一個中分離了一個單菌落，并證實這個菌落能產(chǎn)生1，3-丙二醇。這個菌落被命名為pKP4。從含有ρΚΡ4的大腸桿菌菌株中分離粘粒DNA，并用它來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，將一個獨立的轉(zhuǎn)化子命名為DH5 α -ρΚΡ4。這個轉(zhuǎn)化子證實能產(chǎn)生1，3-丙二醇。ECL707用對應(yīng)于ρΚΡ1、ρΚΡ2、ρΚΡ4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌ECL707菌株，所獲得的轉(zhuǎn)化子分別命名為ECL707-pKPl、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4 和ECL707-pKP-sc。ECL707含有缺陷的glpK、gld和ptsD，這三個基因分別編碼ATP依賴的甘油激酶、NAD+相連的甘油脫氫酶和磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的催化磷酸二羥基丙酮的酶II。在LB-50amp平板上，從每次粘粒轉(zhuǎn)化中分離20個單菌落，并從Supercos空載體 (陰性對照)轉(zhuǎn)化中分離5個單菌落，將它們轉(zhuǎn)入一個LB-50amp主平板。同樣檢測這些菌落將甘油轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的能力，從而確定它們是否含有脫水酶活性。用無菌牙簽將這些轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入微滴定板。微滴定板中含有200uL的培養(yǎng)基A，并補加有0. 2%甘油或0. 2% 甘油+0. 2% D-葡萄糖，再30°C保溫48小時后，將微滴定板小孔中的內(nèi)容物濾過一個0. 45u 的尼龍濾器，然后用HLPC進(jìn)行層析。這些檢測的結(jié)果在表1中給出。表1轉(zhuǎn)化的ECL707將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇陽件菌落的數(shù)目/檢測菌落的數(shù)目轉(zhuǎn)化子甘油甘油+葡萄糖
ECL707-pKPl19/2019/20
ECL707-pKP218/2020/20
ECL707-pKP40 /2020/20
ECL707-SC0/50/5AA200
用對應(yīng)于pKPl、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空載體轉(zhuǎn)化大 腸桿菌AA200菌株，所獲得的轉(zhuǎn)化子分別命名為AA200-pKPl、AA200_pKP2、AA200-pKP4和 AA200-pKP-sc。菌株AA200在磷酸丙糖異構(gòu)酶上有缺陷，(tpi_)。按在大腸桿菌ECL707中介紹的方法，從每次粘粒轉(zhuǎn)化中分離20個單菌落，并從 Supercos空載體轉(zhuǎn)化中分離5個單菌落，檢測這些菌落將甘油轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的能力， 這些檢測的結(jié)果見表2。表2轉(zhuǎn)仆,的AA200將甘油轉(zhuǎn)仆,為1,3- 二醇陽丨牛菌落的數(shù)目/檢測丨菌落的數(shù)目
轉(zhuǎn)化子甘油甘油+葡萄糖
AA200-pKPl17/2017/20
AA200-pKP217/2017/20
AA200-pKP42/2016/20
AA200-SC0/50/5實施例2轉(zhuǎn)化有含脫水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大腸桿菌AA200菌株將D-葡萄糖 轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇從含有肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子粘粒pKPl或pKP2、肺炎克雷伯氏菌pdu操縱 子粘粒pKP4或Supercos空載體的大腸桿菌菌株AA200中挑取單菌落，接種到裝滿培養(yǎng)基 (約14mL實施例1中介紹的培養(yǎng)基A，并補加有10ug/mL的卡那霉素和0. 2%的D-葡萄糖， 加上或減去0. 5-1. OmM的環(huán)腺苷酸-2‘ 3'單磷酸(cAMP))的玻璃血清瓶中。為避免與 甘油接觸，接種可用一個LB-50amp瓊脂)平板或用相同培養(yǎng)基制備的液體培養(yǎng)物來進(jìn)行。 整個反應(yīng)可在30°C保溫約72小時并250rpm振蕩。細(xì)菌的生長用600nM處的光吸收值的變 化來測定，起始0D_為0.020AU。葡萄糖減少和產(chǎn)物分布的量用HLPC來測定。單菌落用編 號的后綴“-X”來表示。例如，AA200-pKPl-x。積累的結(jié)果見表3和表4。表3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌AA200菌株將0. 2%的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇無cAMP
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)1，3_丙二醇的生物轉(zhuǎn)化方法，包括在合適的條件下，使甘油與具有至少一個能表達(dá)脫水酶的基因的單一微生物接觸，所述微生物選自曲霉屬、糖酵母屬、接合糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、德巴利氏酵母屬、毛霉屬、 球擬酵母屬、甲基細(xì)菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬的成員。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用單一微生物將可發(fā)酵碳源生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。具體地，本發(fā)明提供一種用單一微生物將一種碳底物生物轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的方法，所使用的微生物含有編碼一種活性甘油脫水酶或二醇脫水酶的基因，本方法通過將這類微生物與一種碳底物在合適的發(fā)酵條件下接觸來進(jìn)行。
文檔編號C12N9/88GK102304551SQ201110093628
公開日2012年1月4日 申請日期1996年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月12日
發(fā)明者C·E·納卡穆拉, L·A·拉芬德, V·納加拉杰安 申請人:納幕爾杜邦公司, 詹倫卡國際有限公司