專利名稱：抑制rna干擾脫靶效應的特異性修飾的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸技術領域，具體涉及一種具有降低正義鏈脫靶效應的化學修飾的雙鏈小干擾RNA (SiRNA)分子及其制備方法，以及該種修飾的SiRNA分子在制備藥物組合物中的應用。
背景技術：
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA 分子(double-stranded RNA,dsRNA)在mRNA水平降低同源基因表達的現(xiàn)象。RNA干擾技術又被形象地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing),是一種轉錄后基因表達調(diào)控方法，因此又被稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。最早有關RNA干擾的報道出現(xiàn)在1990年左右，由兩個不同的研究小組同時報道了在轉基因植物中發(fā)現(xiàn)的RNA 干擾現(xiàn)象，隨后又在線蟲、果蠅、斑馬魚以及小鼠等幾乎所有后生生物中觀察到RNA干擾現(xiàn)象。1999年，Hamilton和Baulcombe在發(fā)生RNA干擾現(xiàn)象的植物中檢測到長度為21-25個核苷酸的雙鏈RNA片段，這些雙鏈RNA片斷被證明是產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象所必需的，被稱作小干擾核酸(small interfering RNA, siRNA)。雙鏈siRNA與細胞源性的相關酶和蛋白質形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)是RNA干擾的效應分子。通常認為，在RNA干擾過程中，雙鏈siRNA中的正義鏈(過客鏈)被RISC復合體排出，反義鏈指導RISC復合體結合到目標mRNA上的同源位點，然后由復合物中的核糖核酸酶111降解目標mRNA，從而關閉靶基因的表達。事實上，對于一個標準的雙鏈siRNA，它的兩條鏈均能參與RISC復合體的結合，也就是說，除了 siRNA的反義鏈(引導鏈)能夠介導同源基因的表達沉默外，siRNA的正義鏈(過客鏈)也能介導其同源基因的表達沉默，引發(fā)由正義鏈介導的脫靶效應。在基因功能研究中，siRNA正義鏈的這種脫靶效應可能會導致錯誤解讀siRNA的抑制活性；而在小核酸制藥中，則有可能引發(fā)siRNA藥物的毒副作用等一系列后果，這些都將嚴重影響RNA干擾技術的應用。因此，降低siRNA分子正義鏈的脫靶效應，提高RNA干擾的特異性是目前迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下按順序編號的段落中定義的主題I、分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。2、分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA (siRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第16位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。3、分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA (siRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點和第16位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。4、根據(jù)段落1-3任一項所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾選自以下修飾方式中的一種或幾種(I)對核苷酸中核糖的化學修飾；(2)對核苷酸中堿基的化學修飾；(3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。5、根據(jù)段落4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為對核苷酸中核糖2’ -OH的修飾。
6、根據(jù)段落5所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。7、根據(jù)段落4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代。8、根據(jù)段落4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸的堿基被非RNA堿基取代。9、根據(jù)段落8所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述非RNA堿基選自胸腺卩密唳(thymine)、5_甲基胞卩密唳(5-methylcytosine)、異胞卩密唳(isocytosine)、假異胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙塊基尿喃唳(5-propynyluracil)、5-丙塊基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-fIuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密唳(5-methylthiazoleuracil)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2_ 氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脫氮腺嘌呤(7-propyne-7-deazaadenine)、7_丙炔基_7_脫氮鳥嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。10、根據(jù)段落8所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸的堿基被DNA堿基取代。11、根據(jù)段落1-10任一項所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為15-35個核苷酸。12、根據(jù)段落11所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為19-23個核苷酸。13、根據(jù)段落12所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為21個核苷酸。14、根據(jù)段落1-14任一項所述的化學修飾的siRNA分子,其特征在于所述siRNA分子為平末端的siRNA分子。15、根據(jù)段落1-14任一項所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子為3’突出末端的siRNA分子。16、根據(jù)段落15所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子為具有1-6個3’突出末端的siRNA分子。17、根據(jù)段落16所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子為具有2-4個3’突出末端的siRNA分子。
18、一種藥物組合物，其特征在于含有段落1-17任一項所述的化學修飾的siRNA分子及藥學上可接受的載體。19、段落1-17任一項所述的化學修飾的siRNA分子在制備藥物組合物中的應用。20、一種降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于對所述siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點的核苷酸進行化學修飾。21、一種降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于對所述siRNA分子的正義鏈自5’端起第16位點的核苷酸進行化學修飾。22、一種降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于對所述siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點和第16位點的核苷酸進行化學修飾。23、根據(jù)段落20-22任一項所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征 在于所述化學修飾選自以下修飾方式中的一種或幾種(I)對核苷酸中核糖的化學修飾；(2)對核苷酸中堿基的化學修飾；(3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。24、根據(jù)段落23所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述化學修飾為對核苷酸中核糖2’ -OH的修飾。25、根據(jù)段落24所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述化學修飾為核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。26、根據(jù)段落23所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述化學修飾為核苷酸之間磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代。27、根據(jù)段落23所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述化學修飾為核苷酸中堿基被非RNA堿基取代。28、根據(jù)段落27所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述非RNA堿基選自胸腺卩密唳(thymine)、5_甲基胞卩密唳(5_methylcytosine)、異胞卩密唳(isocytosine)、假異胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_ 溴尿卩密唳(5-bromouracil)、5-丙塊基尿卩密唳(5-propynyluracil)、5-丙塊基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-fIuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密卩定(5-methylthiazoleuracil)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脫氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脫氮鳥嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。29、根據(jù)段落27所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述化學修飾為核苷酸中堿基被DNA堿基取代。30、根據(jù)段落20-29任一項所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為15-35個核苷酸。31、根據(jù)段落30所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為19-23個核苷酸。32、根據(jù)段落31所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子的正義鏈和反義鏈的長度為21個核苷酸。33、根據(jù)段落20-32任一項所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子為平末端的siRNA分子。34、根據(jù)段落20-32任一項所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子為3’突出末端的siRNA分子。35、根據(jù)段落34所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子為具有1-6個3’突出末端的siRNA分子。36、根據(jù)段落35所述的降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法，其特征在于所述siRNA分子為具有2-4個3’突出末端的siRNA分子。本發(fā)明要解決的技術問題是siRNA分子正義鏈介導其互補基因轉錄本的表達沉默，從而引發(fā)由正義鏈介導的脫靶效應的問題。本發(fā)明的目的是提供一種具有降低正義鏈引起的脫靶效應的化學修飾的siRNA分子及降低siRNA分子正義鏈脫靶效應的方法。
為解決上述問題，本發(fā)明一方面提供了一種分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點或第16位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。本發(fā)明還提供了一種分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點和第16位點的核苷酸均為化學修飾的核苷酸。本發(fā)明中所述的化學修飾，選自以下修飾方式中的一種或幾種(I)對核苷酸中核糖的化學修飾；(2)對核苷酸中堿基的化學修飾；(3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。在一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為對核苷酸中核糖2’ -OH的修飾；更優(yōu)選地，所述化學修飾為核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。在另一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為核苷酸之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代。在另一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為核苷酸的堿基被非RNA堿基取代；優(yōu)選地，所述非RNA堿基選自胸腺卩密唆(thymine)、5_甲基胞卩密唳(5-methylcytosine)、異胞卩密唳(isocytosine)、假異胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙塊基尿喃唳(5-propynyluracil)、5-丙塊基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-fIuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密卩定(5-methylthiazoleuracil)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脫氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脫氮鳥嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2_ 氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。優(yōu)選地，所述化學修飾為核苷酸中堿基被DNA堿基取代。上述任一種化學修飾的siRNA分子，其正義鏈和反義鏈的長度可以為15-35個核苷酸，優(yōu)選長度為19-23個核苷酸，更優(yōu)選長度為21個核苷酸。上述任一種經(jīng)過化學修飾的siRNA分子，其可以為平末端，也可以帶有3’突出末端，3’突出末端可以為1-6個核苷酸，優(yōu)選為2-4個核苷酸，更優(yōu)選為2個核苷酸。
本發(fā)明另一方面提供了一種藥物組合物，該組合物可包含上述任一種化學修飾的siRNA分子及藥學上可接受的載體。本發(fā)明所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發(fā)明藥物組合物中的小干擾RNA(SiRNA)分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物在抑制基因表達方面的效果。這類給藥載體包括但不限于各種可用于核酸給藥的載體，如脂質體、可降解的高分子化合物、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。
本發(fā)明的藥物組合物可以制成各種醫(yī)學上可接受的劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。本發(fā)明所述制劑是指口服液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當?shù)馁x形劑制備成片劑、膠囊劑等多種其他劑型。本發(fā)明還提供了上述任一種化學修飾的siRNA分子在制備藥物組合物中的應用。本發(fā)明的第三方面，提供了一種降低siRNA分子正義鏈引起的脫靶效應的方法。通過對siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點或第16位點的核苷酸進行化學修飾,或者對siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點和第16位點的核苷酸同時進行化學修飾，能夠顯著降低修飾后的siRNA分子的正義鏈引起的脫靶效應。本發(fā)明中所述的化學修飾，選自以下修飾方式中的一種或幾種(1)對核苷酸中核糖的化學修飾；(2)對核苷酸中堿基的化學修飾；(3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。在一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為對核苷酸中核糖2’ -OH的修飾；更優(yōu)選地，所述化學修飾為核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。在另一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為核苷酸之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代。在再一種優(yōu)選情況下，所述化學修飾為核苷酸的堿基被非RNA堿基取代；優(yōu)選地，所述非RNA堿基選自胸腺卩密唆(thymine)、5_甲基胞卩密唳(5-methylcytosine)、異胞卩密唳(isocytosine)、假異胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙塊基尿喃唳(5-propynyluracil)、5-丙塊基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-fIuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密唳(5-methylthiazoleuracil)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine) >2- M基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脫氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脫氮鳥嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2_ 氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。優(yōu)選地，所述化學修飾為核苷酸中堿基被DNA堿基取代。上述任一種化學修飾的siRNA分子，其正義鏈和反義鏈的長度可以為15-35個核苷酸，優(yōu)選長度為lg-23個核苷酸,更有選長度為21個核苷酸。上述任一種化學修飾的siRNA分子，其可以為平末端，也可以帶有3’突出末端，3’突出末端可以為1-6個核苷酸，優(yōu)選為2-4個核苷酸，更優(yōu)選為2個核苷酸。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的化學修飾的siRNA分子，能夠顯著降低siRNA分子正義鏈引起的脫靶效應，提高siRNA對靶基因表達沉默的特異性。
具體實施例方式在通常情況下，研究人員將一個siRNA分子導入細胞中，由反義鏈(引導鏈)介導的基因沉默是研究人員所期望的；而由正義鏈(過客鏈)介導的基因沉默是RNA干擾過程中的副作用，被稱為正義鏈引起的脫靶效應。針對如何降低siRNA分子正義鏈引起的脫靶效應的問題，發(fā)明人對siRNA正義鏈的不同位點的核苷酸的化學修飾與脫靶效應之間的相關性進行了細致的研究。發(fā)現(xiàn)對siRNA正義鏈從5’端起第14位點或第16位點的核苷酸進行化學修飾，能顯著降低正義鏈對與其互補的基因轉錄本的表達抑制活性，即抑制siRNA正義鏈引起的脫靶效應；同時該化學修飾不影響siRNA分子未修飾的反義鏈的基因沉默活性。在此基礎上，發(fā)明人完成本發(fā)明。 本發(fā)明中，術語“反義鏈(引導鏈)”是指雙鏈siRNA分子中與目標基因轉錄本中的目標位點序列互補的siRNA組成鏈?！罢x鏈(過客鏈)”是指與siRNA分子反義鏈序列互補的siRNA分子的另一條組成鏈?！罢x鏈靶序列”是指與siRNA分子中正義鏈(過客鏈)互補的基因序列或該基因序列的同源序列。“反義鏈靶序列”是指與siRNA分子中反義鏈(引導鏈)互補的基因序列或該基因序列的同源序列。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾RNA(SiRNA)分子可以由核糖核苷酸組成，也可以包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。本發(fā)明中，可以應用各種常規(guī)的核酸合成方法完成本發(fā)明所涉及的核酸分子的合成，或者委托專門從事核酸合成服務的生物技術公司完成核酸分子的合成，如委托廣州銳 博生物科技有限公司或英駿生物技術有限公司(invitrogen)進行合成。一般來說，寡聚核酸分子的合成方法包括以下四個步驟(I)寡聚核糖核苷酸的合成；⑵脫保護；⑶純化分離；⑷脫鹽。例如，具有SEQ ID NO : I所示核苷酸序列的siRNA的化學合成步驟如下(I) siRNA組成鏈的合成在自動DNA/RNA合成儀(例如，Applied BiosystemsEXPEDITE8909)上設定合成I毫摩爾量的siRNA的正義鏈或反義鏈寡聚核苷酸序列，設定每個循環(huán)的偶聯(lián)時間為10-15分鐘，起始物為固相連接的5’-0_對二甲氧基-胸苷支持物，第一個循環(huán)在固相支持物上連接一個堿基，然后在第n次(2 SnS 35)循環(huán)中，在第n_l次循環(huán)所連接的堿基上連接一個堿基，重復此循環(huán)直至完成全部核酸序列的合成。(2)脫保護將連接有寡聚核苷酸的固相支持物加入到試管中，并在此試管中加入I毫升的乙醇/乙胺(體積比為I : 3)，然后密封，置于55-70°C溫箱中，孵育2-30小時；取出連接有寡聚核苷酸的固相支持物，用雙蒸水淋洗2次(每次I毫升)，收集洗脫液；室溫下干燥30分鐘后，加入I毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(IM)，室溫放置4-12小時；再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到合成的寡聚核苷酸的粗產(chǎn)物。(3)純化分離將得到的寡聚核苷酸的粗產(chǎn)物溶解于2毫升濃度為I摩爾/毫升的乙酸銨水溶液中，然后通過C18高壓液相色譜進行分離，得到純化的寡聚核苷酸產(chǎn)物。(4)脫鹽用濃度為75重量％的乙醇水溶液洗滌純化的寡聚核苷酸產(chǎn)物2-4次(每次2毫升)，除去鹽份，室溫下干燥；將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的緩沖液中(IOmM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，將此溶液加熱至95°C，然后緩緩將此溶液冷卻至室溫，并維持在室溫條件下16-22小時，即得到siRNA溶液。本發(fā)明中，所述化學修飾的方式為本領域技術人員所公知。例如，本發(fā)明對所述核酸分子進行的化學修飾為以下修飾方式中的一種或幾種(I)對核苷酸中核糖的化學修飾；(2)對核苷酸中堿基的化學修飾；
(3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。所述對磷酸二酯鍵的修飾包括但不限于對磷酸二酯鍵中的氧進行修飾，例如硫代磷酸修飾(Phosphorthioate)和硼燒化磷酸鹽修飾(Boranophosphate),分別用硫和硼燒置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩(wěn)定siRNA分子的結構，保持堿基配對的特異性和親和力。硼烷化磷酸鹽修飾的siRNA疏水性強，易于在血漿中形成水合蛋白，對人體的毒副作用低于硫代磷酸酯修飾的siRNA。
權利要求
1.分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(siRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。
2.分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第16位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。
3.分離的化學修飾的雙鏈小干擾RNA(SiRNA)分子，包含正義鏈(過客鏈)和反義鏈(引導鏈)，其特征在于所述修飾的siRNA分子的正義鏈自5’端起第14位點和第16位點的核苷酸為化學修飾的核苷酸。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾選自以下修飾方式中的一種或幾種 (1)對核苷酸中核糖的化學修飾； (2)對核苷酸中堿基的化學修飾； (3)對核苷酸之間磷酸二酯鍵的化學修飾。
5.根據(jù)權利要求4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為對核苷酸中核糖2’ -OH的修飾。
6.根據(jù)權利要求5所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。
7.根據(jù)權利要求4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代。
8.根據(jù)權利要求4所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸的堿基被非RNA堿基取代。
9.根據(jù)權利要求8所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述非RNA堿基選自胸腺卩密唳(thymine)、5_甲基胞卩密唳(5-methylcytosine)、異胞卩密唳(isocytosine)、假異胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙塊基尿喃唳(5-propynyluracil)、5-丙塊基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-f Iuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密唳(5-methylthiazoleuracil)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2_ 氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脫氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脫氮鳥嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。
10.根據(jù)權利要求8所述的化學修飾的siRNA分子，其特征在于所述化學修飾為核苷酸的堿基被DNA堿基取代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種化學修飾的雙鏈小干擾RNA(siRNA)分子及其制備和應用方法。通過在siRNA分子正義鏈從5’端起第14位點或/和第16位點引入化學修飾的核苷酸，從而降低修飾的siRNA分子正義鏈引起的脫靶效應，增強修飾的siRNA分子對靶基因表達沉默的特異性。
文檔編號C12N15/10GK102719434SQ20111007897
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權日2011年3月31日
發(fā)明者杜權, 梁子才 申請人:百奧邁科生物技術有限公司