專利名稱：一種生物可降解的聚合物及其制備方法以及核酸藥物運輸載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以一種生物可降解的聚合物及其制備方法以及相關(guān)的核酸藥物運輸載體，屬于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸類藥物因其獨有的高效性、特異性，已逐漸被發(fā)展成為新型的治療遺傳性或獲得性疾病包括病毒感染和癌癥等的基因治療手段，此外，其在基因功能研究方面也發(fā)揮著重要作用。但由于核酸類藥物巨大的分子量及自身所攜帶的大量負電荷使其不能自主穿越細胞膜進入細胞發(fā)揮作用，在系統(tǒng)運輸時易引起非特異性的脫靶效應(yīng)和免疫應(yīng)答，同時還面臨被核酸酶降解等障礙，所以核酸類藥物的轉(zhuǎn)染問題成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸。設(shè)計和合成安全有效的核酸藥物載體已經(jīng)成為目前核酸藥物研發(fā)的重要方向。雖然病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但其潛在的安全性問題及高成本等缺點，使其應(yīng)用受到極大的限制。 所以安全性高、副作用小、生產(chǎn)成本低的非病毒載體越來越受到人們的青睞。目前用于核酸藥物非病毒載體遞送的手段主要有以下兩種化學(xué)修飾法和合成載體法。第一，對其進行化學(xué)修飾，如核糖2位甲基化、用磷硫酰鍵連接鏈的3末端和5末端、用氟原子取代核糖的2 位羥基等；或鏈接一些功能性基團如膽固醇、脂質(zhì)體、細胞敏感多肽(CPP)等改善其轉(zhuǎn)染效果。第二是化學(xué)合成一些轉(zhuǎn)染試劑作為載體與核酸藥物自組裝形成納米顆粒從而提高其轉(zhuǎn)染效果。合成型的轉(zhuǎn)染試劑主要包括兩大類。第一類是脂質(zhì)體和類脂，如穩(wěn)定的核酸脂肪微滴(SNALP)、Oligofectamine、脂醇和脂醇98附2_5 (1)，其運輸效果已得到證實。雖然脂質(zhì)體和某些陽離子類脂在體內(nèi)和體外的安全性和毒性已有報道，但將脂質(zhì)體用于臨床還是很有希望，因為FDA已經(jīng)批準(zhǔn)將聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體用于阿霉素和兩性霉素B的運輸。第二類是陽離子聚合物。陽離子聚合物因能與大量的核酸分子自組裝成穩(wěn)定的納米粒子而成為有效的轉(zhuǎn)染試劑。簡而言之，負載核酸藥物分子的納米粒子通過核酸分子磷酸基團的負電荷與陽離子聚合物的正電荷之間的靜電相互作用結(jié)合形成聚合電解質(zhì)絡(luò)合物，然后該絡(luò)合物通過刺激非特異性的細胞內(nèi)吞和“質(zhì)子海綿”效應(yīng)介導(dǎo)的內(nèi)涵體逃逸而發(fā)揮作用。目前用于自組裝的材料如聚乙烯亞胺(PEI)、聚左旋賴氨酸(PLL)、樹狀分子， 殼聚糖等，他們形成的聚合物類型主要有以下幾種聚合物叢(Polyplexes)、聚合物膠束 (Polymer micelles)、納米叢(Nanoplexes)、納米膠囊(Nanocapsules)、藻酸鹽納米粒子 (Alginate nanogels)、水凝膠(hydrogel)。聚合物叢是由核酸藥物與一些合成和天然的聚合物陽離子(如聚乙烯亞胺、殼聚糖、膠原、環(huán)糊精等)自組裝形成，雖然其對核酸藥物有較高的負載率，高轉(zhuǎn)染效率，但也有較高的細胞毒性。聚合物膠束是由兩嵌段(AB)或三嵌段(ABC或ABA)的共聚物組成，其中A部分是陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺、聚賴氨酸等； B部分是高親水聚合物，如聚乙二醇、葡聚糖、或聚氮-(2-羥丙基)異丁烯酰胺(PHPMA) 等。這些膠束的內(nèi)核能提供不同的環(huán)境，如膠狀的、非晶的和晶狀的；此外，他們的這種核殼結(jié)構(gòu)和尺寸與天然病毒的非常相似，又因其尺寸比聚合物叢的小而比聚合物叢更穩(wěn)定。但它仍擺脫不了由陽離子聚合物帶來的潛在毒性，所以其應(yīng)用仍受到限制。納米叢是由相關(guān)單體通過乳液聚合、陰離子聚合、或自由基聚合反應(yīng)，然后經(jīng)表面活性劑(如溴代十六烷基三甲基銨硝酸鹽DTAB、CTAB)或殼聚糖等改變其表面電荷形成(如聚烷基氰酸丙烯酸酯PACA)；或是用戊二醛將去溶劑化處理的明膠納米粒子網(wǎng)狀化，然后再用乙醇胺等季胺分子錨定在其表面形成，最后通過離子之間相互作用或抗生素與生物素相互作用與核酸分子結(jié)合；由于戊二醛及陽離子聚合物帶來的毒性，要將該類型載體應(yīng)用于臨床還必須開發(fā)新型的網(wǎng)狀化試劑并減少陽離子聚合物的使用。納米膠囊作為一種囊泡狀聚合物載體是由一層薄的陽離子聚合物外膜包裹一個水溶性的內(nèi)核形成。核酸藥物被包入內(nèi)核中直到外膜降解后才釋放出來，因此這種方式能較好的保護核酸藥物抵抗機體的代謝，但因共包封的陽離子聚合物的毒性及其制備過程中需使用有毒的氯化試劑，而且制備困難，大大限制了該類載體的臨床運用。藻酸鹽納米膠是新近出現(xiàn)的一種，它是在藻酸鹽水溶液中用氯化鈣 (CaCl2)使多糖鏈之間發(fā)生離子交聯(lián)而凝膠化形成的。盡管藻酸鹽具有較多負電荷、低毒、 低致免役性，藻酸鹽納米膠對核酸藥物具有較高的負載率，但這類載體因其在與核酸分子結(jié)合過程中涉及到陽離子聚合物(如聚賴氨酸等)的使用而使其臨床應(yīng)用仍受限制。水凝膠是新近報道的一種運載工具，它是一種可注射、可生物降解的生物聚合物結(jié)構(gòu)，可實現(xiàn)核酸藥物的可控遞送，允許長期抑制特定位點基因的表達，而且核酸藥物被釋放6天后仍能保持其生物活性并具有較強的干擾效應(yīng)；又因其可注射，使得其可以最低限度侵害機體的方式給藥；而且由于它的高親水性及高氣體通透性可以把多種細胞摻合其中，從而可實現(xiàn)它遞送核酸藥物和細胞移植的雙重功能。盡管針對核酸藥物的載體研究取得了一定的突破和進展，但要使核酸藥物成功應(yīng)用于生物體內(nèi)，并成為常規(guī)途徑，仍有一些關(guān)鍵性問題需要解決，如毒性、特異性、靶向性、免疫刺激、轉(zhuǎn)染效率低等。由此，具有較好生物相容性、快速去質(zhì)子化能力的可生物降解的高分子載體因具有靶向傳遞的潛能、具有更好的穩(wěn)定性、 能增強細胞對運輸分子的吸收、能提高核酸藥物對生理環(huán)境的耐受性并能使核酸藥物有效釋放，實現(xiàn)治療目的，而使得這類載體在核酸藥物給藥中具有更好的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。聚羥基脂肪酸酯(PHA)是原核生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的情況下，作為碳源和能源貯存而合成的一類熱塑性聚酯，是一種天然的高分子生物材料。脂肪酸可以是丁酸、戊酸或己酸等，其具有的數(shù)均分子量(Mn)范圍是約50，000道爾頓至約20，000，000道爾頓。因其同時具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性能，并同時可作為生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料，已經(jīng)成為近年來生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點，在藥物緩釋體系中也發(fā)揮著越來越重要的作用，而且已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用作手術(shù)的縫合線。目前已經(jīng)商品化生產(chǎn)的PHA產(chǎn)品如聚羥基丁酸酯(PHB)、聚羥基戊酸酯(PHV)、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯(PHBV)、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯(P3/4HB)、聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)，均已經(jīng)證明具有生物相容性和生物可降解性。在理想情況下，最佳的非病毒載體應(yīng)該是具有低毒性和高基因遞送效率的聚合物。本發(fā)明將這種具有良好的生物相容性和生物可降解性的聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物聚合，作為核酸藥物的運輸載體，結(jié)合兩者的優(yōu)勢，希望在實現(xiàn)有效運輸核酸藥物的同時，可降低載體的毒副作用，并且選用這種可生物降解的材料作為載體，還可實現(xiàn)核酸藥物的緩慢釋放，達到長效的目的，從而減少用藥劑量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種生物可降解的聚合物。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種生物可降解的聚合物，其為聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[A;B/L]，其中A來源于聚羥基脂肪酸酯、B來源于陽離子化合物、L為連接體部分；所述陽離子化合物為陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、陽離子聚合物或其組合。本發(fā)明的另一目的是提供一種轉(zhuǎn)染效率高、靶向性強、低毒、安全性好的核酸藥物運輸載體。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種核酸藥物的運輸載體，其是活性成分為上述生物可降解的聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑可為30-600nm(優(yōu)選的粒徑為30-500nm)，其表面電勢(即zeta電勢)可為2_60mV?！唉　被蚴絀的聚羥基脂肪酸其中η= 1，2，3，或4;當(dāng)η = 1，即為PHB。m表示聚合度，決定分子量的大小。R 是可變基團，可為飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈即取代基的烷基。進一步地，聚羥基脂肪酸酯(PHA)包括聚羥基丁酸酯(PHB)、聚羥基戊酸酯(PHV)、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯(PHBV)、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯 (P3/4HB)、聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯(PHBHHx)。實施方案中，式I化合物中的聚羥基脂肪酸酯可以是以上的任一類，不同分子量、不同組成的聚酯。最優(yōu)選的是聚羥基丁酸酯 (PHB)。上述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量(Mn)范圍可以是是約200道爾頓至約 2，000, 000道爾頓，更優(yōu)選是約200道爾頓至約60，000道爾頓，更優(yōu)選200道爾頓至5000
道爾頓?！癇”或式I化合物中的陽離子化合物包括陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、陽離子聚合物或其組合，但不限于此。所述陽離子肽包括但不限于賴氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸 (KALA)、聚左旋賴氨酸(PLL)、或魚精蛋白；所述陽離子脂質(zhì)包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、膽固醇二油酰卵磷脂、或胺乙基胺基甲?；懝檀?CAEC)；所述陽離子聚合物包括但不限于聚乙烯亞胺(PEI)、精胺、亞精胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺、殼聚糖、聚丙烯亞胺樹狀分子、或聚甲基丙烯酸N，N- 二甲氨基乙酯樹狀分子。更優(yōu)選的式I化合物中的陽離子肽是聚左旋賴氨酸(PLL)；優(yōu)選的式I的陽離子酯質(zhì)是胺乙基胺基甲酰基膽固醇(CAEC)；優(yōu)選的式I的陽離子聚合物是聚乙烯亞胺(PEI)， 且更優(yōu)選式I的陽離子聚合物是低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)。式I的陽離子化合物可以任選具有相同重復(fù)單元或不同重復(fù)單元組合的陽離子化合物。“L”或式I的連接體部分包括但不限于酰氨基連接體部分、氨基甲酸酯連接體部分、脲連接體部分、醚連接體部分、琥珀酰氨基連接體部分、氨基酯連接體部分、酯連接體部分及其組合。L優(yōu)選是脲連接體部分或氨基酯連接體部分。連接體部分結(jié)合到陽離子化合物的氨基和聚羥基脂肪酸酯的羥基、羧基或丙烯基上。主要包括酰胺鍵、酯鍵、酐鍵、雙鍵、二硫鍵、生物可降解的連接或酶可裂解的連接。本發(fā)明的另一目的是提供了上述生物可降解的聚合物的合成方法。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案具體如下.一種上述生物可降解的聚合物的合成方法，所述式I化合物的合成方法是一端或兩端為羥基、羧基或丙烯基的聚羥基脂肪酸酯在催化劑和連接劑的作用下，與陽離子化合物反應(yīng)得到；所述連接劑為能活化氨基、羥基或羧基的試劑或丙烯酸酯單體、或甲基丙烯酸酯單體。在優(yōu)選的實施方案中，連接劑是能活化氨基、羥基或羧基的試劑如六亞甲基二異氰酸酯(HDI)、羰基二咪唑(⑶I)、異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)U-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)等，在另一實施方案中是用丙烯酸酯單體、甲基丙烯酸酯單體為連接劑，包含但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、丙烯酰氯等將聚羥基脂肪酸酯的端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鍵，然后通過邁克爾加成與陽離子化合物的氨基反應(yīng)，優(yōu)選的是丙烯酰氯。聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物的反應(yīng)可以發(fā)生在陽離子化合物的伯胺或仲胺上面。聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物的質(zhì)量比是1-50，優(yōu)選的是1-30，更優(yōu)選是1-10，同時聚羥基脂肪酸酯與連接試劑的摩爾比可以根據(jù)所用試劑而變化，并可以從100-1。在一優(yōu)選的實施方案中式I化合物是通過一端或兩端為羥基的聚羥基脂肪酸酯， 以辛酸亞錫(Sn(Oct)2)為催化劑，HDI/⑶I/IPDI為連接劑，與陽離子化合物上的氨基聚合得到；上述聚合反應(yīng)可以發(fā)生在陽離子化合物的伯胺或仲胺上面。在另一優(yōu)選的實施方案中式I化合物是通過一端或兩端為羧基的聚羥基脂肪酸酯，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，DCC/EDC為縮合劑，與陽離子化合物的氨基縮合得到；另一優(yōu)選的實施方案中式I化合物是通過一端或兩端為丙烯基的聚羥基脂肪酸酯的末端雙鍵與陽離子化合物的氨基通過邁克爾加成反應(yīng)得到；本發(fā)明提供的式I化合物包括三大類聚羥基脂肪酸酯與陽離子肽的共聚物、聚羥基脂肪酸酯與陽離子脂質(zhì)的共聚物、聚羥基脂肪酸酯與陽離子聚合物的共聚物。本發(fā)明得到的核酸藥物運輸載體(共聚物載體)具有良好的生物相容性和生物可降解性，其物理、化學(xué)性能可以通過調(diào)節(jié)聚合物的分子量或各組分的組成而調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供的生物相容性共聚物，在水溶液中自組裝成納米顆粒，具有良好的穩(wěn)定性、制備方法簡單、可重復(fù)性高，作為載體能很好的保護核酸藥物。本發(fā)明提供的聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物的共聚物可以形成帶有正電荷的納米顆粒，這種納米顆粒的粒徑可為30-600nm，優(yōu)選是30_500nm，表面電勢可為2_60mV。本發(fā)明中各共聚物制備的納米顆粒能夠與siRNA完全結(jié)合形成穩(wěn)定的負載siRNA分子的納米顆粒。使用聚羥基脂肪酸酯作為本發(fā)明聚合物的一部分，具有如下優(yōu)點與作用①可生物降解；②生物相容；③相對疏水性，因此通過聚合物鏈之間的親水-疏水相互作用可促進共聚物自組裝；④原料廉價，節(jié)約成本。使用陽離子化合物作為本發(fā)明聚合物的陽離子部分，主要是利用其氨基官能團，在略酸或略堿性環(huán)境下帶有的大量正電荷可以與帶負電荷的核酸藥物靜電結(jié)合，實現(xiàn)對核酸藥物的運輸。同時其具有的親水性或靶向性可增強共聚物在水溶液中的溶解度，更利于核酸藥物的運輸。


圖1是實施例1、2中相關(guān)化合物的合成示意圖，其中A-F為mPHA_0H和PHA-diol 的合成及相應(yīng)端基修飾路線、G-J為各類材料的合成示意圖。圖2是實施例1、2中相關(guān)化合物的核磁共振氫譜(1H NMR)圖，其中A、B、C分別為 mP3/4HB-0H、PHB-diol 和材料 24 的 1H 匪R 譜。圖3是實施例3中納米顆粒的物理表征及穩(wěn)定性測試結(jié)果，其中圖A、B分別為納米顆粒的粒徑及表面電勢(zeta電勢)的結(jié)果；圖C為材料的血清穩(wěn)定性測試結(jié)果，其中T 表示時間、N和F分別代表材料9、15的納米顆粒與siRNA的復(fù)合物。圖4是實施例4中納米顆粒與siRNA復(fù)合物的物理表征結(jié)果，其中圖A、B分別為納米顆粒與siRNA復(fù)合物的粒徑及kta電勢的結(jié)果。圖5是實施例5中凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果，其中A-D分別為材料3、9、15、24的凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果，圖中每一條泳道下方標(biāo)記的數(shù)字表示該泳道中復(fù)合物的載體/siRNA 質(zhì)量比。圖6是實施例6中，材料3、9、15、對在徹1&細胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后，綠色熒光蛋白(GFP)的表達結(jié)果，其中縱坐標(biāo)是GFP蛋白表達百分率，橫坐標(biāo)是材料的編號。圖7是實施例7中材料9納米顆粒與siRNA復(fù)合物的細胞吞噬實驗結(jié)果，其中圖 A為DAPI染色，顯示的是細胞核；B為熒光染料CY3標(biāo)記的siRNA ；C為A、B的疊加圖；D為對照組。圖8是實施例7中材料15納米顆粒與siRNA復(fù)合物的細胞吞噬實驗結(jié)果。其中圖 A為DAPI染色，顯示的是細胞核；B為CY3標(biāo)記的siRNA ；C為A、B的疊加圖；D為對照組。圖9是實施例7中材料M納米顆粒與siRNA復(fù)合物的細胞吞噬實驗結(jié)果。其中圖 A為DAPI染色，顯示的是細胞核；B為CY3標(biāo)記的siRNA ；C為A、B的疊加圖；D為對照組。圖10是實施例8中體外轉(zhuǎn)染細胞實驗以及熒光素酶活性檢測實驗結(jié)果。其中A、 B分別為材料3和材料12在A549-1UC細胞中轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的結(jié)果；C、D分別為各載體材料在A549-1UC細胞和MCF-7-luc細胞中的實驗結(jié)果；1-27為材料編號；觀為陽性對照組J9 為對照1。圖11是實施例9相關(guān)實驗的激光共聚焦結(jié)果，顯示的是不同條件下SD大鼠關(guān)節(jié)腔不同部位的熒光信號分布情況。其中A和B、C和D分別為對照1和陽性對照組的膝關(guān)節(jié)不同部位的熒光分布情況；E和F、G和H分別為材料M轉(zhuǎn)染24h和后膝關(guān)節(jié)不同部位的熒光分布情況；其中圖1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1為在488nm激發(fā)光下激光共聚焦的照片，顯示的是熒光標(biāo)記的Cy3-siRNA ；圖1_2、2-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8_2為在 346nm激發(fā)光下激光共聚焦的照片，顯示的是細胞核；圖1_3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3、7_3、 8-3 分別為圖 1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1 和對應(yīng)的圖 1-2、2-2、3-2、4-2、5-2、6_2、 7-2,8-2的疊加結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一類核酸藥物的運輸載體，它的活性成分是聚合物形成的，可生物降解的帶正電荷的納米顆粒。上述聚合物(以下或稱為共聚物)為聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物反應(yīng)而成。1、與式I化合物結(jié)合的核酸藥物本發(fā)明提供的式I化合物可以與核酸藥物結(jié)合形成復(fù)合物，因此可作為載體將核酸藥物運輸進細胞。核酸藥物的實例包括DNA藥物、反義核酸antisense、核酶ribozymes、 三鏈核酸、DECOY核酸/aptamers、干擾RNA(siRNA)。優(yōu)選的是DNA和siRNA。式I化合物與核酸藥物形成的復(fù)合物，可以通過將共聚物溶液與核酸藥物的溶液混合形成，也可通過將共聚物制備成納米顆粒，然后再與核酸藥物結(jié)合形成，更優(yōu)選是通過以下實施事例中的方法形成。2、式I化合物與核酸藥物的結(jié)合方式本發(fā)明提供的具有較好生物相容性和生物可降解性的式I化合物，在水溶液中通過自組裝形成納米顆粒，這類納米顆粒在水溶液中具有疏水的聚羥基脂肪酸酯內(nèi)核和親水的陽離子聚合物外殼，而且顆粒的尺寸與共聚物的組成有關(guān)，可以調(diào)控。在略酸性或略堿性的環(huán)境中形成的納米顆粒表面帶有可觀的正電荷，在合適的電荷比(N/P)情況下，通過靜電作用可與帶負電荷的核酸藥物完全結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，起到運輸核酸藥物的作用。 采用這種納米顆粒作為載體可實現(xiàn)載體/核酸藥物復(fù)合物的細胞內(nèi)吞，納米顆粒將核酸藥物運輸進病灶部位后，并與核酸藥物分離，將核酸藥物釋放出來，使其發(fā)揮作用以達到治療的目的。由于該共聚物載體具有兩親性，還可將其制備成不同結(jié)構(gòu)的納米顆粒，既可以將核酸藥物包裹在其中，也可以將核酸藥物錨定在其表面。3、式I化合物納米顆粒的制備及其穩(wěn)定性測試可通過常規(guī)方法將兩親性的共聚物在水溶液中制備成納米顆粒，比如溶劑揮發(fā)法和透析法。溶劑揮發(fā)法將共聚物溶于四氫呋喃中，于攪拌下滴入超純水得到相應(yīng)的終濃度， 攪拌兩小時后，于減壓下除去有機溶劑，再定容至合適的體積。透析法將共聚物溶于良溶劑如二甲基亞砜(DMSO)中，于攪拌下滴入超純水得到相應(yīng)的終濃度，攪拌兩小時后，于透析袋中透析除去有機溶劑。本發(fā)明提供的各載體材料的納米顆粒是采用溶劑揮發(fā)法制備，同時測定了納米顆粒的粒徑分布及其表面電勢大小，結(jié)果表明，各載體材料的納米顆粒因其種類和組成的不同，導(dǎo)致其粒徑分布和表面電勢大小不同。然后將納米顆粒與核酸藥物結(jié)合后，在25 %牛血清中，對其穩(wěn)定性進行了測定。優(yōu)選的核酸藥物是siRNA，實驗結(jié)果表明載體材料的納米顆粒與siRNA結(jié)合后，未發(fā)現(xiàn)納米顆粒聚集現(xiàn)象，siRNA與之結(jié)合一定時間后，經(jīng)檢測siRNA 能保持其完整性未被降解。由此說明載體材料的納米顆粒能提高siRNA在牛血清中的穩(wěn)定性。此外，將納米顆粒與siRNA結(jié)合形成復(fù)合物后，通過動態(tài)光散射和^ta電勢測定了復(fù)合物的粒徑分布及表面電勢(即zeta電勢)大小，結(jié)果表明，各載體材料因所含陽離子化合物的種類及含量不同，導(dǎo)致他們與siRNA形成的復(fù)合物的粒徑分布與表面電勢大小有差異，與未結(jié)合siRNA之前的納米顆粒相比，有的材料與siRNA形成的復(fù)合物其粒徑變大，電勢變小，這說明siRNA可能是通過靜電作用結(jié)合在納米顆粒的表面；而有的材料與siRNA形成的復(fù)合物其粒徑變小，電勢變大，這說明SiRNA可能被納米顆粒通過靜電作用包裹在其內(nèi)部，同時原處于納米顆粒內(nèi)部的部分正電荷被暴露了出來，所以導(dǎo)致表面電勢變大。由此證明，本發(fā)明的載體材料可制備成不同結(jié)構(gòu)的納米顆粒，既可實現(xiàn)對SiRNA的包裹，也可將 siRNA錨定在其表面。4、式I化合物對核酸藥物運輸?shù)膽?yīng)用研究本發(fā)明提供了式I化合物作為載體對核酸藥物運輸?shù)膽?yīng)用研究，包括其對核酸藥物的包裝能力測定、轉(zhuǎn)染能力的測定、以及其對核酸藥物治療效果的影響?；蛑委煹男ЧQ于多種因素。一般而言，在基因轉(zhuǎn)染實驗中，沒有被有效包裝起來的核酸藥物，基本不具備轉(zhuǎn)染效果。而利用非病毒運輸載體時，只有當(dāng)核酸藥物與載體材料結(jié)合，形成的復(fù)合物顆粒才可能具有較高的轉(zhuǎn)染活性。因此，能否將核酸藥物有效包裝是運輸載體的重要性能之一。所以必須通過實驗獲知，載體/核酸藥物的比例為多少時，核酸藥物能夠被充分包裝起來。這一比例，可以是載體/核酸藥物的質(zhì)量比，也可以是電荷比，即氮/磷(N/P)比，其中N代表載體中的氨基，可以產(chǎn)生一單位正電荷；P為核酸藥物分子中的磷酸基團，可以產(chǎn)生一單位負電荷。N/P比反應(yīng)了載體與核酸藥物的電荷比情況，一般認為用于核酸藥物轉(zhuǎn)染的載體材料，與核酸藥物都是通過正負電荷相互吸引而組裝在一起。在本發(fā)明中，我們采用了較為簡單和直觀的質(zhì)量比來表示載體/核酸藥物的比例，這種方式也在實際應(yīng)用中更為精確，文中若沒有特殊說明，載體/核酸藥物的比例均指兩者的質(zhì)量比。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明通過凝膠阻滯實驗測定了本發(fā)明制備的各種載體材料對siRNA的包載能力，實驗結(jié)果表明每種載體材料均能與siRNA完全結(jié)合，而且由于每種載體材料中陽離子化合物含量的不同而導(dǎo)致每種載體材料與siRNA完全結(jié)合時兩者的比例各異。另一方面，核酸藥物能否發(fā)揮療效，其中最主要的一個原因是運輸載體能否將核酸藥物轉(zhuǎn)染進細胞并發(fā)揮作用，本發(fā)明通過細胞轉(zhuǎn)染實驗測定了自制的各類載體材料對核酸藥物的轉(zhuǎn)染能力及其對核酸藥物治療效果的影響。其中，優(yōu)選的核酸藥物是質(zhì)粒DNA，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的各類載體材料能將質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)進細胞，但各類載體材料對質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)染效率因其分子量，組成比例，所帶電荷的不同而有差異。而當(dāng)載體材料相同，其與 DNA的比例不同時，轉(zhuǎn)染效果的差異也因材料種類的不同而呈現(xiàn)出不同的趨勢。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明通過細胞吞噬實驗測定了自制的各種載體材料對 siRNA的轉(zhuǎn)染能力。實驗結(jié)果表明各種材料均能將帶熒光的siRNA轉(zhuǎn)進細胞，而且每個細胞的細胞核周圍都分布著siRNA，但轉(zhuǎn)染效果因材料不同而有所差異。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明用體外轉(zhuǎn)染細胞實驗以及熒光素酶活性檢測實驗，在能穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶的細胞即人肺腺癌細胞(AM9-1UC細胞)中測定了自制的各種載體材料在不同緩沖條件、不同轉(zhuǎn)染時間下對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果的影響，以此優(yōu)化各載體材料的最佳轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)選的兩種載體材料是材料3和材料12。實驗結(jié)果表明在不同PH值、不同種類的緩沖鹽、不同緩沖鹽濃度、不同轉(zhuǎn)染時間下，各載體材料因組成的不同，而對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果的影響有所不同，材料3在50毫摩爾每升(mM)N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸(HEPES) (PH = 6. 5)的緩沖液中能有效降低siRNA 的表達，而材料12在HBG(20mM HEPES+5%葡萄糖(glucose)PH= 7.4)的緩沖液中能有效降低siRNA的表達。此外，在不同的緩沖條件下，各載體材料對siRNA的沉默效果都隨著轉(zhuǎn)染時間的延長而明顯增加。在進一步的實施方案中，本發(fā)明用體外轉(zhuǎn)染細胞實驗以及熒光素酶活性檢測實驗，結(jié)合各載體材料的轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化結(jié)果，在兩種不同的能穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶的細胞中測定了自制的各種載體材料對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果的影響。優(yōu)選的兩種細胞是人肺腺癌細胞(AM9-1UC細胞)和人乳腺癌細胞(MCF-7-luc細胞)。實驗結(jié)果表明 在兩種細胞中不同載體材料對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果影響不同，有的材料能顯著增加siRNA的沉默效果，降低熒光素酶的表達，有的材料卻對siRNA的沉默效果影響不大。而且各載體材料在兩種細胞中對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果的影響趨勢基本相同，由此說明各載體材料對siRNA的轉(zhuǎn)染效果及沉默效果的影響幾乎沒有細胞特異性，不會因細胞種類的不同而有所差異。進一步的實施方案中，本發(fā)明通過動物實驗測定了不同時間段，各載體材料對核酸藥物的緩慢釋放能力。優(yōu)選的實施方案中，選用本實驗室自建的SD大鼠關(guān)節(jié)炎模型為動物模型，優(yōu)選的載體材料為材料M，優(yōu)選的核酸藥物為帶Cy3熒光標(biāo)記的干擾 RNA(Cy3-siRNA)，優(yōu)選的時間段為24h和96h。具體實驗內(nèi)容見實施例9。實驗結(jié)果表明與對照組1和lipo2000轉(zhuǎn)染Cy3-siRNA對照組相比，用材料M制備的納米顆粒包裹 Cy3-siRNA形成的復(fù)合物局部注射24h后，朝向關(guān)節(jié)腔的滑膜層及網(wǎng)狀結(jié)締組織有明顯的熒光信號，但滑膜下的關(guān)節(jié)軟骨層基本無紅色熒光；而局部注射后，表面滑膜層熒光較 Mh時略減弱，關(guān)節(jié)軟骨層、近髓質(zhì)區(qū)域均出現(xiàn)明顯核染，顯示了復(fù)合物由表面向內(nèi)部骨組織的擴散。由此說明，材料M成功轉(zhuǎn)進了大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，而且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，復(fù)合物逐步的從表面滑膜層向內(nèi)部骨組織擴散，Cy3-siRNA被逐漸的釋放出來， 從而實現(xiàn)了載體材料對核酸藥物的緩慢釋放。本發(fā)明通過細胞和動物實驗證明本發(fā)明提供的這類載體材料對核酸藥物具有較高的包載能力和轉(zhuǎn)染效率，基本不影響核酸藥物的療效，而且毒副作用小，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可實現(xiàn)核酸藥物的緩釋，同時其納米顆粒具有很好的穩(wěn)定性和易于制備等特點，使得這類載體在siRNA運輸和其他核酸藥物的運輸中具有很好的應(yīng)用前
旦
ο本發(fā)明中的聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)中，羥基丁酸(HB)所占的比例范圍是 5-95%，優(yōu)選是 5-60%。本發(fā)明中的聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯(P3/4HB)中，4_羥基丁酸0ΗΒ)所占的比例范圍是3-70 %，優(yōu)選是3-40 %。本發(fā)明中的聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯(PHBHHx)中，3_羥基丁酸(HB)所占的比例范圍是2-90 %，優(yōu)選是2-70 %。下述實施例旨在更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實施例1、單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯的合成及其端基修飾a、單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的合成與表征各類單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的合成，均是在對甲苯磺酸 (PTSA)的催化下，與甲醇或二醇通過酯交換反應(yīng)制備，其中二醇可以是乙二醇、1，3_丙二醇、1，4_ 丁二醇、1，6_己二醇。本發(fā)明中的各類聚羥基脂肪酸酯原料均是購自于深圳意可曼生物科技有限公司。下面以單甲基聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯(mP3/4HB-0H)和聚羥基丁酸酯的二醇(PHB-diol)為例說明此類反應(yīng)的操作步驟。mP3/4HB-0H的合成路線如圖1㈧所示。mP3/4HB_0H是在對甲苯磺酸的催化下， 將P3/4HB與甲醇通過酯交換反應(yīng)制備。具體步驟為將原料P3/4HB (IOg)溶于250ml氯仿中回流30min后，再加入2g對甲苯磺酸和5ml甲醇回流，通過控制反應(yīng)時間可得到不同分子量的mP3/4HB-0H。反應(yīng)完畢，用水萃取3次，收集有機相，將其濃縮后倒入大量水中沉淀； 過濾后，真空干燥，及得產(chǎn)物(產(chǎn)率83%)。PHB-diol的合成路線如圖1⑶所示。PHB-diol是在對甲苯磺酸的催化下，將PHB 與1，4 丁二醇通過酯交換反應(yīng)制備。具體步驟為將原料PHB(IOg)溶于250ml氯仿中回流 30min后，再加入3g對甲苯磺酸和IOml 1，4 丁二醇回流，通過控制反應(yīng)時間可得到不同分子量的PHB-diol。反應(yīng)完畢，用水萃取3次，收集有機相，將其濃縮后倒入大量水中沉淀； 過濾后，真空干燥，及得產(chǎn)物(產(chǎn)率80%)。對mP3/4HB-0H和PHB-diol進行核磁共振氫譜分析(1H NMR)分析，1H NMR見圖 2 (A)和(B)。由圖2㈧和⑶可見，各種質(zhì)子均得到相應(yīng)歸屬，積分比例吻合。b、對單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)的端基修飾1)羧基修飾(mPHA-C00H/PHA-diacid)各類單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯均可通過適當(dāng)方法如將單/雙羥基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-OH/PHA-diol)與丁二酸/ 丁二酸酐、DCC、DMAP反應(yīng)，可得到相應(yīng)的單/雙羧基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-COOH/PHA-diacid)。合成路線如圖1 (C)、(D)。2)丙烯基修飾(mPHA-mA/PHA-DA)各類單/雙丙烯基聚羥基脂肪酸酯(mPHA-mA/PHA-DA)均可通過mPHA_0H/ PHA-diol與三乙胺和丙烯酰氯/丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯/乙二醇二丙烯酸酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯Λ，6-己二醇二丙烯酸酯反應(yīng)得到。合成路線如圖1 (E)、(F)。上述方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)。實施例2、聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物共聚物的合成與表征各種不同種類、不同分子量的聚羥基脂肪酸酯與陽離子肽、陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物的共聚物是以相應(yīng)種類及相應(yīng)分子量的單/雙羥基、單/雙羧基、單/雙丙烯基的聚羥基脂肪酸酯與陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、陽離子聚合物，以HDI/CDI/IPDI/DCC/EDC為連接劑或縮合劑，在辛酸亞錫(Sn(Oct)2)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，采用溶液聚合、縮合或邁克爾加成等方法合成；通過調(diào)節(jié)聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物的分子量及兩者的投料比例可以得到不同分子量、不同組成的共聚物。辛酸亞錫因其高催化活性及無毒性，是被最廣泛應(yīng)用的聚合反應(yīng)催化劑，已被FDA批準(zhǔn)用作食品添加劑。a、聚羥基脂肪酸酯與陽離子肽共聚物的合成與表征以聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)與陽離子肽聚左旋賴氨酸(PLL)聚合制備 mPHBV-PLL共聚物為例，說明各類聚羥基脂肪酸酯與陽離子肽類共聚物的合成步驟。合成路線如圖I(G)所示以單羧基的聚羥基丁酸戊酸共聚酯(mPHBV-C00H)為預(yù)聚體，4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，雙環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)為縮合劑(即連接劑)，與聚左旋賴氨酸(PLL)以不同投料比通過縮合反應(yīng)制備不同分子量、不同組成的
12mPHBV-PLL共聚物?？s合劑還可以是EDC、HOBt。具體操作步驟如下將0. 2-lg mPHBV-COOH 與 0. 05_6g PLL 置于 250ml 圓底燒瓶中，加入 5-1 IOml CHCl3溶解，然后加入計算量DCC和DMAP，于25°C _90°C反應(yīng)6_48小時。反應(yīng)完畢，透析， 冷凍干燥，即得產(chǎn)物(產(chǎn)率51% -85% )。不同分子量、不同投料比可得到不同的產(chǎn)物，如此得到了一系列mPHBV-PLL共聚物載體材料1-9，見表1。表1不同分子量、不同投料比(質(zhì)量比)合成mPHBV-PLL共聚物
權(quán)利要求
1.一種生物可降解的聚合物，其特征是，它為聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[A;B/L]，其中A來源于聚羥基脂肪酸酯、B來源于陽離子化合物、L為連接體部分；所述陽離子化合物為陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、陽離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)通式如下其中η = 1，2，3，或4 ;m表示聚合度；R是飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈的烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯是聚羥基丁酸酯、聚羥基戊酸酯、聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯、聚3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯、聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯是聚羥基丁酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量范圍是200道爾頓至600，000道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量范圍是200道爾頓至5000道爾頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述陽離子肽為賴氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸、聚左旋賴氨酸、或魚精蛋白；所述陽離子脂質(zhì)為二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇二油酰卵磷脂、或胺乙基胺基甲?；懝檀?；所述陽離子聚合物為聚乙烯亞胺、精胺、亞精胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺、殼聚糖、聚丙烯亞胺樹狀分子、或聚甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯樹狀分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述陽離子肽是聚左旋賴氨酸；所述陽離子脂質(zhì)是胺乙基胺基甲?；懝檀?；所述陽離子聚合物是聚乙烯亞胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物可降解的聚合物，其特征是，所述連接體部分為酰氨基連接體部分、氨基甲酸酯連接體部分、脲連接體部分、醚連接體部分、琥珀酰氨基連接體部分、氨基酯連接體部分、或酯連接體部分。
10.一種權(quán)利要求1-9任一項所述生物可降解的聚合物的合成方法，其特征是，一端或兩端為羥基、羧基的聚羥基脂肪酸酯在催化劑和連接劑的作用下，與陽離子化合物反應(yīng)；所述連接劑為能活化氨基、羥基或羧基的試劑或丙烯酸酯單體、或甲基丙烯酸酯單體；或一端或兩端為丙烯基的聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物通過邁克爾加成反應(yīng)，得到生物可降解的聚合物；上述陽離子化合物為陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、或陽離子聚合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，所述聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物的質(zhì)量比是1-30。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，所述能活化氨基、羥基或羧基的試劑為六亞甲基二異氰酸酯、羰基二咪唑、異佛爾酮二異氰酸酯、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺、或N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺；所述丙烯酸酯單體為丙烯酰氯。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，一端或兩端為羥基的聚羥基脂肪酸酯，以辛酸亞錫為催化劑，六亞甲基二異氰酸酯、羰基二咪唑、或異佛爾酮二異氰酸酯為連接劑，與陽離子化合物上的氨基聚合，得到生物可降解的聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的合成方法，其特征是，一端或兩端為羧基的聚羥基脂肪酸酯，以4-二甲氨基吡啶為催化劑，N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺為連接劑，與陽離子化合物的氨基縮合，得到生物可降解的聚合物。
15.一種核酸藥物運輸載體，其特征是，其是活性成分為權(quán)利要求1-9任一項所述生物可降解的聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑為30-600nm，其zeta電勢為 2-60mVo
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述核酸藥物運輸載體，其特征是，所述生物可降解的聚合物為聚羥基丁酸酯與聚乙烯亞胺按質(zhì)量比為16的反應(yīng)得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物可降解的聚合物及其制備方法，它為聚羥基脂肪酸酯與陽離子化合物共聚形成的聚合物，其結(jié)構(gòu)通式I為[A；B/L]，其中A來源于聚羥基脂肪酸酯、B來源于陽離子化合物、L為連接體部分；所述陽離子化合物為陽離子肽、陽離子酯質(zhì)、陽離子聚合物。本發(fā)明還公開了一種核酸藥物運輸載體，其是活性成分為上述生物可降解的聚合物的帶正電荷的納米顆粒，所述納米顆粒的粒徑為30-600nm，其zeta電勢為2-60mV。本發(fā)明所述的聚合物具有可生物降解；生物相容；相對疏水性，因此通過聚合物鏈之間的親水-疏水相互作用可促進共聚物自組裝；原料廉價，節(jié)約成本等優(yōu)點。
文檔編號A61K48/00GK102174184SQ20111000777
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者周麗, 張必良 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院