專利名稱：用于減少RNAi中的脫靶表型效應的siRNA的不依賴于序列的修飾形式和其穩(wěn)定形式的制作方法
用于減少RNAi中的脫靶表型效應的s i RNA的不依賴于序列 的修飾形式和其穩(wěn)定形式領(lǐng)域本教導總地來說涉及用于減少RNA干擾中不依賴于序列的脫靶表型效應 (off-target phenotypic effect)的組合物、方法和試劑盒。引言短干擾RNA (siRNA)有效地誘導互補mRNA的切割，從而使mRNA無功能，且在細胞 中導致功能性蛋白質(zhì)的喪失。此類分子借以發(fā)揮作用的機制已得到部分表征。簡而言之， siRNA的2條RNA鏈中的一條被整合入稱為RISC的酶復合物中，然后該復合物能夠結(jié)合并 且切割含有互補序列的mRNA，從而消除成熟mRNA使之不能翻譯成蛋白質(zhì)。siRNA的兩條鏈 中的每一條都可被整合入R I SC復合物。然而，在其5'末端具有較弱的堿基配對的鏈優(yōu) 先用于整合。因此，任何siRNA都將導致產(chǎn)生激活的RISC復合物的混合物(其可切割預期 的靶RNA和非靶向的RNA)。在生物學應用中，期望絕大部分，優(yōu)選所有的激活的RISC復合 物包含與期望的靶互補的siRNA鏈。本教導提供了不僅可用于減少mRNA被非期望的siRNA 鏈切割而且還可用于減少內(nèi)源基因的干擾的脫靶效應的方法、組合物和試劑盒。概述出人意料地，增加或維持鏈偏向性(strand bias)，雖然是維持內(nèi)源RNA干擾的 效力所必需的，但不足以在細胞生物學測定中減少脫靶效應。本文中研究了在其中外源提 供靶mRNA以及其中靶mRNA是內(nèi)源mRNA的條件下，在其中將不同類型的修飾核苷酸引入 siRNA的條件下以及在其中將不同修飾形式引入siRNA的條件下，減少或使脫靶效應降至 最低同時維持效力的能力。此外，針對許多靶RNA中的每一個靶RNA，研究了多種siRNA修 飾形式。因此，減少或使脫靶事件降至最低并且維持高效siRNA的效力(如在表型和細胞 生物學水平上觀察到的)的修飾的核苷酸和修飾形式可用于任何siRNA序列，并且不依賴 于siRNA的堿基序列。即，本文中提供的修飾形式是不依賴于序列的修飾。在一些實施方案中，提供了化學合成的過客(passenger)(有義)寡核苷酸，其具 有15至30個核苷酸的長度并且包含如下的不依賴于序列的修飾形式(1)、不依賴于序列的 修飾形式(2)和不依 賴于序列的修飾形式(3)中的一個(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 為 0 或 1 ;x 為 7、8、9、10 或 11 ;r 為 0、1 或 2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+x+r+4)的整數(shù)；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ 為 0或 l;y 為 7、8 或 9 并且 ζ 為 1 ；或 y為7并且ζ為2或3 為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+4)的整 數(shù)；(3)5' m-Nfm-Nx-m-m-Nq-nJ'，其中 χ 為 8、9 或 10 ;r 為 0、1 或 2 ；以及 q 為表示 過客鏈的長度減去(x+r+5)的整數(shù)；其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸或三環(huán)核苷酸；各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核 苷酸或核糖核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸，以及 當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外的核苷酸。
在一些實施方案中，提供了化學合成的短干擾RNA，其包含上述過客(有義)寡核苷酸和引導(反義)寡核苷酸，所述引導寡核苷酸具有15至30個核苷酸，與至少12個核 苷酸的過客(有義)寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域；引導鏈還與靶mRNA的至少一部分具有互補 性。在一些實施方案中，提供了短干擾RNA，其包含過客(有義)寡核苷酸和引導(反 義)寡核苷酸，所述過客寡核苷酸具有17至30個核苷酸的長度并且包含不依賴于序列的 修飾形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一個，所述引導寡核苷酸具有17至30個核苷酸，與 至少12個核苷酸的過客(有義)寡核苷酸連續(xù)互補的的區(qū)域；引導鏈還與靶mRNA的至少 一部分具有互補性，(4)5' mp-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中當 ρ 為 0 時，χ 為 12 ；當 ρ 為 1 時，χ 為 11 ；當 ρ 為 2時，χ為10 ；當ρ為3時，χ為9 ；當ρ為4時，χ為8 ;r為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈 的長度減去(p+x+r+2)的整數(shù)；(5)5' m-m-Nx-m-Nq-n，，其中χ為ll;r為0、1或2;以及q是表示過客鏈的長 度減去(x+r+3)的整數(shù)；(6)5' mp-Ny-m-Nz-m-Nrnr3'，其中ρ為 3 ;y 為9并且ζ 為 1 ;r 為0、1 或2 ；以及 q為表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+2)的整數(shù)；其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸、三環(huán)核苷酸或2' _修飾的核苷酸；各η獨立地是 脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸并且為懸突核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨 立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸，當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外 的核苷酸，以及當m是2'-修飾的核苷酸時，各N獨立地是除了 2'-修飾的核苷酸外的 核苷酸。在短干擾RNA的實施方案中，過客(有義)寡核苷酸具有不依賴于序列的修飾形 式(4)，ρ為2，χ為10，r為2，各η是懸突核苷酸，并且各η獨立地是修飾的核苷酸；引導 (反義)寡核苷酸包含2個3' _懸突修飾的核苷酸；并且各修飾的核苷酸獨立地是二環(huán) 核苷酸、三環(huán)核苷酸或2'-修飾的核苷酸。在一個實施方案中，過客寡核苷酸的3'倒數(shù) 第三個位點和3'倒數(shù)第四個位點中的至少一個是修飾的核苷酸。3'倒數(shù)第三個位點是 從最后一個位點算起的第三個位點，即在倒數(shù)第二個位點之前的位點(例如，圖IH的形式 DH47)。3'倒數(shù)第四個位點是從最后一個位點算起的第四個位點，即，倒數(shù)第三個位點之前 的位點(例如，圖IH的形式DH29)。這樣的siRNA例如在血清或血漿存在的情況下對于核 酸酶是特別穩(wěn)定的。在短干擾RNA的一些實施方案中，當長度為17個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2 和3中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為18個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3和 4中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為19個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3、4和5 中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為20個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3、4、5和 6中的至少一個是修飾的核苷酸；以及當長度為21至30個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點 2、3、4、5、6和7中的至少一個是修飾的核苷酸。圖IK的形式DHl和形式DH39-DH43提供了 具有21個核苷酸的長度并且引導寡核苷酸的位點2、3、4、5、6和7中的至少一個是修飾的 核苷酸的siRNA修飾形式的實例。在一些實施方案中，引導寡核苷酸的位點2、3、4、5、6和 7(取決于上文引述的長度)中只有一個是修飾的核苷酸。這樣的siRNA例如在血清存在的情況下對核酸酶也是特別穩(wěn)定的。提供了減少或使關(guān)于通過RNA干擾抑制靶基因的表達的脫靶事件減少至最少的 方法，該方法包括將含有靶基因的細胞與足以減少脫靶事件同時保持效力的量的上述化學 合成的短干擾RNA接觸，其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸或三環(huán)核苷酸。短語“同時保持效 力”在本文中用于使用足夠量的siRNA以減少脫靶事件同時保持效力的背景中。在該背景 中，所述短語是指減少脫靶事件時對于減少siRNA的抑制(knockdown)活性的耐受性，其由 減少的抑制活性是否引起基因相關(guān)表型來指示。一般而言，“同時保持效力”是指抑制減少 至正常抑制水平的80%是可接受的。然而，對特定基因的減少的抑制的耐受性可在正常抑 制的50%至95%的范圍內(nèi)。在另外的實施方案中，提供了在通過RNA干擾抑制外源提供的靶基因的表達中減 少或使由過客鏈導致的切割降至最低的方法，該方法包括將含有靶基因的細胞與足以減少 或使由過客鏈導致的切割降至最低同時保持引導鏈的效力的量的化學合成的短干擾RNA 接觸，短干擾RNA的過客鏈包含不依賴于序列的修飾形式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)中 的一個，其中各m獨立地是2 ‘-修飾的核苷酸；各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核苷酸 或核糖核苷酸；并且各N獨立地是未修飾的核苷酸。將切割的減少與未修飾的siRNA的切 割的減少相比較。在一些實施方案中，接觸是含有細胞的細胞培養(yǎng)物或含有細胞的組織與化學合成 的短干擾RNA的體外接觸。在另外的實施方案中，接觸是含有細胞的組織、含有細胞的體液 或含有細胞的器官與化學合成的短干擾RNA的離體接觸。在其他實施方案中，接觸是含有 細胞的器官或動物與化學合成的短干擾RNA的體內(nèi)接觸。在一些實施方案中，接觸是具有 賦予其核酸酶穩(wěn)定性的修飾形式的短干擾RNA至有此需要的受試者的體內(nèi)血管內(nèi)施用。如 實施例8的數(shù)據(jù)所顯示的，當與在相同的施用后時間點上存在于體內(nèi)的缺乏修飾核苷酸的 對照短干擾RNA的量相比時，在施用后體內(nèi)存在更大量的穩(wěn)定的短干擾RNA。由本文中的實施方案提供的和在外源提供的基因上進行的RNA干擾測定顯示不 同修飾形式中許多類型的修飾核苷酸提供了增強的鏈偏向性同時保持效力。參見圖4Α和 圖4Β中關(guān)于使用二環(huán)核苷酸的形式Η、Κ和0的數(shù)據(jù)以及圖6Α和圖6Β中關(guān)于使用2 ‘ -0-甲 基核苷酸的形式H、K和0的數(shù)據(jù)。出人意料地，此類修飾的核苷酸和修飾形式在內(nèi)源基因的RNA干擾中減少或使脫 靶事件減少至最少的能力不同。進行微陣列分析以測定差異表達的基因的數(shù)目，其是由引 入的siRNA導致的脫靶效應的量度。差異表達的基因定義為由于RNA干擾而具有至少2倍 變化(P值小于0.001)的基因。與由具有相同siRNA序列的未修飾形式A siRNA導致的差 異表達的基因的數(shù)目相比，LNA 核苷酸修飾形式H siRNA產(chǎn)生減少38%至68%的差異表 達的基因。相比之下，當與未修飾形式AsiRNA比較時，2' -0-甲基修飾形式HsiRNA產(chǎn)生 減少0%至22%的差異表達的基因。因此，LNA 核苷酸修飾的siRNA在減少脫靶效應上 比2' -0-甲基修飾的siRNA更有效，如通過全基因特征 譜分析所確定的。參見圖9Α至圖 9C。使用實施例6舉例說明的細胞生物學研究確認這些出人意料的發(fā)現(xiàn)。當就內(nèi)源基 因的siRNA干擾分析結(jié)果的集合時，很明顯，圖IlC中顯示的各種修飾形式中2' -0-甲基 修飾的核苷酸與未修飾形式相比，未將“脫靶”表型消除至統(tǒng)計學上顯著的程度。這些結(jié)果與圖IOE的結(jié)果相反，這顯示具有形式H的siRNA消除脫靶效應的統(tǒng)計學上顯著的能力，如通過與未修飾形式A相比更低的細胞凋亡信號所證明的。在一些實施方案中，化學合成的短干擾RNA還與下文中進一步描述的靶向細胞的 ΚΙΦ (cell-targeting ligand)結(jié)本文中的實施方案涉及包含過客寡核苷酸、引導寡核苷酸或化學合成的短干擾 RNA以及生物學上可接受的載體的組合物。此外，本文中的實施方案還涉及例如包含過客寡 核苷酸、引導寡核苷酸或化學合成的短干擾RNA以及轉(zhuǎn)染劑的試劑盒。實施方案的具有含 有修飾核苷酸的修飾形式的短干擾RNA提供了提高的功效從而節(jié)省了設計和測試siRNA的 時間，提供了提高的特異性從而節(jié)省了花費在虛假結(jié)果上的時間和金錢，提供了提高的效 力從而允許使用更少的材料獲得期望的效果。提高的功效和特異性還允許每基因使用更少 的siRNA進行單個基因和文庫篩選研究。在另一個實施方案中，減少RNA干擾的脫靶效應的方法包括獲得具有過客有義鏈 (其包含與靶轉(zhuǎn)錄的RNA同源的區(qū)域)且具有與所述有義鏈互補的引導反義鏈的siRNA，所 述 siRNA 具有修飾形式 H、Q、V-2、Y、Y+l、JB1、JB2、JB 3、JB4 或 JB5，和將所述 siRNA 與細 胞接觸。通過與由未修飾的siRNA(其具有與修飾形式化的(modificat ion-formatted) siRNA相同的序列)引起的脫靶效應相比，測量脫靶效應的降低。在另外的實施方案中，增加SiRNA在富含核酸酶的環(huán)境中的穩(wěn)定性的方法包括獲 得具有過客有義鏈(其包含與靶轉(zhuǎn)錄的RNA同源的區(qū)域)、具有與所述有義鏈互補的引導 反義鏈且具有3'懸突核苷酸的siRNA，所述siRNA具有修飾形式DH47、DH29、DHl、DH 39、 DH40、DH41、DH42或DH43，和將所述siRNA與富含核酸酶的環(huán)境相接觸。通過與具有形式 F，具有相同類型的修飾核苷酸并且具有相同序列的siRNA的穩(wěn)定性相比，測量siRNA的增 加的穩(wěn)定性。另外的實施方案包括具有本文中提供的修飾形式的siRNA，其在體外、離體或體內(nèi) 應用中用于RNA干擾以抑制靶基因的表達。當已知靶基因的表達與疾病相關(guān)時，本文中的 siRNA可用于所述疾病的篩查、診斷或治療。本文中描述的SiRNA性能研究的出人意料的方面是，基于報告子的鏈型測定 (reporter-based strandedness assay)不能在細胞表型水平上預測修飾形式化的siRNA 的性能。使用下文中描述的微陣列全基因特征譜或基于細胞的測定來觀察表型水平上的性 能的差異。根據(jù)本文中的描述，本教導的這些和其他特征將變得更顯然。附圖本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下述附圖僅用于舉例說明的目的。附圖無意以任何方式 限定本教導的范圍。圖IA至圖IK提供了用于siRNA研究的修飾形式。位于核苷酸上面的數(shù)字表示核 苷酸在siRNA中相對于形式的5'末端的位置。m=修飾的核苷酸，N=核苷酸或具有除了 m的修飾外的修飾的修飾的核苷酸，η =核苷酸或修飾的核苷酸，P =磷酸基團。圖2Α至圖2Β提供了用于不同工作實例的表達報告載體的示意圖。圖2Α顯示 包含螢火蟲螢光素酶報告基因的pMIR-REPORT miRNA表達報告載體(Ambion/Applied Biosystems)的圖譜。將不同目的基因(GOI)的編碼區(qū)插入位于螢光素酶基因的3'末端的多克隆位點(MCS)中的HindIII (核苷酸位點463)與SpeI (核苷酸位點525)限制性內(nèi) 切核酸酶位點之間。圖2B顯示包含β -半乳糖苷酶報告基因的pMIR-REP0RT i3 -gal對 照載體(Ambion/Applied Biosystems)的圖譜。將對照載體與攜帶GOI的pMIR-REPORT miRNA表達報告載體進行共轉(zhuǎn)染，所述對照載體用作轉(zhuǎn)染標準化對照。圖3A至圖3B提供了描述pMI R-REP0RT mi RNA表達載體中克隆的GOI的mi RNA與螢光素酶基因的mRNA之間的方向關(guān)系的示意圖。圖3A提供了正向定向(forward orientation)，即GOI mRNA的5'-末端與fLuc mRNA的3'-末端緊鄰。圖3B提供了反 向定向，即GOI mRNA的5 ‘-末端遠離fLuc mRNA的3 ‘-末端。圖4A至圖4E提供了針對具有未修飾形式A和指定的修飾形式的siRNA進行的實 施例2和3中描述的鏈測定的結(jié)果。圖4A提供了在進行具有指定的修飾形式的siRNA的RNAi研究后存在的標準化的 報告蛋白的量。深色條塊表示引導鏈的抑制活性，淺色條塊表示過客鏈的抑制活性。為了 展示修飾的siRNA鏈的鏈型結(jié)果的分布，以箱線圖(box plot)形式(也稱為“箱須”圖)提 供圖4B至圖4E的數(shù)據(jù)。“箱須”圖的深色水平條表示數(shù)據(jù)集的中值，箱表示數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)集 的下四分位數(shù)和上四分位數(shù)上的分布，虛線(須)表示數(shù)據(jù)集的最小和最大值，橢圓形表示 各修飾形式的數(shù)據(jù)集中的異常值。圖4B提供了通過下式測量的siRNA過客鏈的抑制活性過客鏈活性P =(來 自用測試siRNA處理的反向克隆的剩余的fLUC活性/ β gal活性)/(來自用Neg對照 siRNA處理的反向克隆的剩余的fLUC活性/ β gal活性)。將各修飾形式與未修飾形式進 行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0. 1434 ；形式F，0. 1011 ；形式G， 0. 0002052 ；形式 H, 0. 0001755 ；形式 J, 0. 0002052 ；形式 K, 0. 006516 ；形式 M, 0. 002246 ；形 式 0,0.0009626。圖4C提供了通過下式測量的引導鏈的抑制活性引導鏈活性G =(來自用測 試siRNA處理的正向克隆的剩余的fLUC活性/β gal活性)/(來自用Neg對照siRNA處 理的正向克隆的剩余的fLUC活性/iigal活性)。將各修飾形式與未修飾形式進行比 較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0. 0001271 ；形式F，0. 8774 ；形式G， 0. 0006498 ；形式 H，0.8115 ；形式 J，0. 000006557 ；形式 K，0.01051 ；形式 M，0. 7898 ；形式 0， 0.8774。圖4D提供了圖4B和圖4C的siRNA的過客鏈與弓|導鏈之間的fLUC活性的差異。通 過將標準化的正向fLUC活性減去標準化的反向fLUC活性來計算活性差異，或差異=P-G。 因此，如果過客鏈活性小于(較低的抑制，即，較高的螢光素酶活性)引導鏈(較高的抑制， 艮口，較低的螢光素酶活性)，則活性差異的值預期大于0。低于0的值表示過客鏈比引導鏈 更具活性。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下 形式 E, 0. 00792 ；形式 F, 0. 06043 ；形式 G, 0. 9664 ；形式 H, 0. 0014 ；形式 J, 0. 008715 ；形式， 0. 6634 ；形式 M, 0. 002516 ；形式 0，0. 0006498。圖4E顯示計算為(10&(P)-10&(G))的活性倍數(shù)變化，其提供了與修飾形式對圖 4D的s i RNA的過客鏈的影響相比，所述修飾形式對引導鏈的影響的量度。因此，活性倍數(shù) 變化越大，siRNA的引導 鏈偏向性越大。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon 檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0.0002781 ；形式F，0.08937 ；形式G，0.2076 ；形式H，0. 01944 ；形式 J, 0. 0003223 ；形式 K, 0. 8553 ；形式 Μ, 0.002516 ；形式 0，0. 003504。圖5Α至圖5C提供了實施例3中描述的關(guān)于其中修飾形式進行鏈轉(zhuǎn)換(與圖4Α 至圖4Ε的研究相比)的研究的結(jié)果。即，例如對于修飾F，將過客(有義)鏈的1、20、21修 飾引入引導(反義)鏈并且將引導(反義)鏈的20、21修飾引入過客(有義)鏈。圖5Α提供了在對12個不同的具有鏈轉(zhuǎn)換修飾的SiRNA進行RNAi研究后存在的 標準化的報告蛋白的量。深色條塊表示引導鏈的抑制活性，淺色條塊表示過客鏈的抑制活 性。圖5Β以箱線圖形式提供了圖5Α的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性的差異。 將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilc0x0n檢驗(成對的)的結(jié)果對于所有形式都 是相同的，0. 03125。圖5C提供了圖5B的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性的倍數(shù)變化。將各修飾 形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果對于所有形式都是相同的， 0.03125。圖6A至圖6C提供了實施例3中描述的關(guān)于其中修飾形式的修飾核苷酸被2‘ _0 甲基化的研究的鏈測定的結(jié)果。圖6A提供了在對6個不同的具有指定的修飾形式的siRNA進行RNAi研究后存在 的標準化的報告蛋白的量。深色條塊表示引導鏈的抑制活性，淺色條塊表示過客鏈的抑制 活性。圖6B以箱線圖形式提供了圖6A的siRNA組和實施例3中描述的額外的18個不 同siRNA的組的過客鏈與引導鏈之間的fLUC活性的差異。將各修飾形式與未修飾形式進 行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H-1，0.001918 ；形式H，0. 00001574 ； 形式 H+1,0. 001091 ；形式 V-2,0. 0002131 ；形式 Κ，0· 0003619 ；形式 0,0. 406。圖6C提供了圖6Β的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性的倍數(shù)變化。將各修飾 形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式Η-1，0. 02514; 形式 Η，0· 00001574 ；形式 Η+1，0. 007443 ；形式 V_2，0. 0001464 ；形式 K，0. 0003619 ；形式 0， 0.5446。圖7Α至圖7Β提供了實施例3中描述的關(guān)于其中修飾形式的修飾核苷酸是2‘， 5'-連接的核苷酸的研究的鏈測定的結(jié)果。圖7Α提供了具有未修飾形式A的siRNA和具有修飾形式H_l、H、H+l、V_2、K和 0的siRNA的引導鏈與過客鏈的抑制活性的差異。將各修飾形式與未修飾形式進行比較 的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H-1，0. 3594 ；形式H，0. 07422 ；形式H+1， 0. 5703 ；形式 V-2，0. 4258 ；形式 K，0. 2031 ；形式 0，0. 01953。圖7Β提供了圖7Α的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的抑制活性的倍數(shù)變化。將 各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H-1， 0. 3008 ；形式 H，0. 01953 ；形式 H+1，0. 2031 ；形式 V_2，0. 4961 ；形式 K，0. 1921 ；形式 0， 0.00909。圖8提供了 8個內(nèi)源靶的每一個的6個siRNA的抑制活性數(shù)據(jù)。48個siRNA 中的每一個具有指定的修飾形式，所述修飾形式摻入了實施例4中描述的二環(huán)修飾的核 苷酸。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式 E，O. 000000008657 ；形式 F，0. 4631 ；形式 G，0.000009698 ；形式 H，0.5569 ；形式 J， 0. 00000000191 ；形式 K, 0. 00001336 ；形式 M, 0. 7269 ；形式 0，0. 0593。圖9A至圖9C提供了通過微陣列分析確定的和實施例5描述的未修飾的siRNA、 2' -0-甲基-siRNA或二環(huán)修飾的siRNA之間的2倍差異表達的基因的交集的維恩圖。對 于各圖，左下組(如果有顏色的話為紅色)表示在未修飾的siRNA處理的樣品中變化2倍 或更大倍數(shù)的基因，上方組(如果有顏色的話為藍色)表示在2' -0-甲基形式H修飾的 siRNA處理的樣品中變化2倍或更大倍數(shù)的基因，右下組(如果有顏色的話為綠色)表示在 二環(huán)修飾的核苷酸(LNA )形式H修飾的siRNA處理的樣品中變化2倍或更大倍數(shù)的基因。 圖IOA至圖IOE提供關(guān)于LNA 修飾形式在細胞生物學研究中對中靶(on-target)和脫靶 表型的影響的數(shù)據(jù)。陰性對照(Neg)是混雜的(scrambled)非靶向性siRNA，對于所述混 雜的非靶向性siRNA，有絲分裂或細胞凋亡的定量被標準化為1.0的值。參見實施例6。圖 IOA提供了由于具有LNA 修飾形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA沉默一組基因靶而引 起的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所述基因靶的一個亞組的抑制預期增加有絲分裂， 所述基因靶的一個亞組的抑制預期對有絲分裂沒有作用，以及所述基因靶的一個亞組的抑 制預期減少有絲分裂，如實施例6所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較 的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0.805 ；形式F，0. 5483 ；形式G，0. 3215 ；形 式 H, 0. 004561 ；形式 J, 0. 000952 ；形式 K, 0. 01974 ；形式 M, 0. 1007 ；形式 0，0. 9438。圖IOB如圖IOA —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期減少 有絲分裂。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié) 果如下形式 E，0. 3247 ；形式 F，0. 4683 ；形式 G，0. 1815 ；形式 H，0. 03423 ；形式 J，0. 01387 ； 形式 K, 0. 09874 ；形式 M, 0. 5509 ；形式 0，0. 6705。圖IOC提供了由于具有LNA 修飾形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA沉默一組 基因靶而引起的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述基因靶的一個亞組的抑制預期增加 細胞凋亡，所述基因靶的一個亞組的抑制預期對細胞凋亡沒有作用，如實施例6中所描述 的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下 形式 Ε，0· 2641 ；形式 F，0. 5366 ；形式 G，0. 0001888 ；形式 H，0. 0000102 ；形式 J，0. 00000263 ； 形式 K, 0. 000000553 ；形式 M, 0. 5366 ；形式 0，0. 05753。圖IOD如圖IOC —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期增加 細胞凋亡，如實施例6中所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon 檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0. 2188 ；形式F，0. 4375 ；形式G，0. 3125 ；形式H， 0.2188 ；形式 J，0. 03125 ；形式 K，0. 03125 ；形式 M，1 ；形式 0，0.2188。圖IOE如圖IOC —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期對細 胞凋亡沒有作用，如實施例6中所描述的。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶 效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效 應。siRNA具有脫靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有增加的中 值和更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon 檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式E，0. 5303 ；形式F，0. 804 ；形式G，0. 00005488 ；形式H， 0. 00001347 ；形式 J，0. 0001253 ；形式 Κ，0· 00003023 ；形式 Μ，0. 441 ；形式 0,0. 1551。圖IlA至圖IlF提供了關(guān)于2' _0_甲基化修飾形式在細胞生物學研究中對中靶和脫靶表型的影響的數(shù)據(jù)。陰性對照(Neg)是混雜的非靶向性siRNA，對于所述混雜的非靶 向性siRNA，有絲分裂或細胞凋亡的定量被標準化為1. O的值。參見實施例6。圖IlA提供了由于具有未修飾形式A和具有2' _0_甲基修飾形式H和K的siRNA 沉默一組基因靶而引起的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所述基因靶的一個亞組的抑制 預期增加有絲分裂，所述基因靶的一個亞組的抑制預期對有絲分裂沒有作用，如實施例6 所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié) 果如下形式Η，0· 3529 ；形式Κ，0· 3289。圖IlB如圖IlA —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期增加 有絲分裂。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié) 果如下形式Η，0. 3125 ；形式Κ，0. 5469。圖IlC如圖IlA —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期對有 絲分裂沒有作用。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂脫靶效應的siRNA來進行研 究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效 可應通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。將 各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H， 0. 9102 ；形式 Κ，0· 4961.圖IlD提供了由于具有2' -0-甲基修飾形式H和K的siRNA沉默一組基因靶 而引起的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述基因靶的一個亞組的抑制預期增加細胞凋 亡，所述基因靶的一個亞組預期對細胞凋亡沒有作用，如實施例6所描述的。將各修飾形式 與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0.3529 ；形 式 Κ，0· 3529。圖IlE如圖IlD —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期增加 細胞凋亡，如實施例6中所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon 檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0.3125 ；形式K，0.5469。圖IlF如圖IlD —樣提供了基因的亞組的箱線圖，所述基因亞組的抑制預期對細 胞凋亡沒有作用，如實施例6所描述的。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶 效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效 應。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下 形式 Η，0. 9102 ；形式 Κ，0. 7344。圖12Α-1提供了計算為P-G的過客鏈與引導鏈之間的活性的差異，其中如圖4Β和 圖4C 一樣針對未修飾形式A和針對測試形式H、H+l、H-l、Η-2、V、V_l、V_2、K和Q (其中修 飾是LNA 殘基)定義P和G。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成 對的)的結(jié)果如下形式H，0.04199 ；形式Η+1，0. 123 ；形式Η_1，0. 1748 ；形式Η_2，0. 2402 ； 形式 V，0. 06738 ；形式 V-1，0. 05371 ；形式 V_2，0. 5771 ；形式 K，0. 4648 ；形式 Q，0. 1016。圖12A-2提供了圖12A-1的siRNA的過客鏈 和引導鏈之間的活性的倍數(shù)變化。 將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H， 0. 3652 ；形式 H+1,0. 2783 ；形式 Η_1，0· 2402 ；形式 Η_2，0· 4131 ；形式 V,0. 2061 ；形式 V-I, 0. 1016 ；形式 V-2,0. 7002 ；形式 K, 0. 6377 ；形式 Q, 0. 7002。圖12B提供了具有未修飾形式A的siRNA和具有LNA 修飾形式H、H_2、H_l、H+l、Q、K、V、V-I和V-2的siRNA對內(nèi)源靶的抑制活性的數(shù)據(jù)，如實施例6中所描述的。 將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H， 0. 029598160 ；形式 Η_2，0· 004296849 ；形式 Η_1，0· 000833165 ；形式 Η+1,0. 052779900 ；形 式 Q，0. 011454170 ；形式 Κ，0· 745852000 ；形式 V，0. 005660834 ；形式 V-1,0. 998100800 ；形 式 V-2,0. 374661100。圖12(提供了由于具有未修飾形式々和具有1^人 修飾形式11、!1+1、！1-1、!1-2、 K、Q、V、V-I和V-2的SiRNA沉默一組基因靶而引起的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所 述基因靶的抑制預期增加有絲分裂，如實施例6所描述的。陰性對照(Neg)是混雜的非靶 向性siRNA，對于所述混雜的非靶向性siRNA，有絲分裂的定量被標準化為1. 0的值。將各 修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H， 0. 01563 ；形式 Η+1,0. 1953 ；形式 Η_1，0· 07813 ；形式 Η_2，0· 07813 ；形式 V,0. 05469 ；形式 V-1,0. 1953 ；形式 V-2，l ；形式 K，0. 1953 ；形式 Q，0. 1953。圖120提供了由于具有未修飾形式々和具有1^人<^修飾形式11、!1+1、!1-1、!1-2、1(、 Q、V、V-I和V-2的siRNA沉默一組基因靶而引起的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述 基因靶的抑制預期對細胞凋亡沒有作用。陰性對照(Neg)是混雜的非靶向性siRNA，對于所 述混雜的非靶向性siRNA，細胞凋亡的定量被標準化為1. 0的值。然而，特別地選擇已在經(jīng) 驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時， 是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對 照相比，其具有增加的中值和更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。比較未修飾形式A對照與各個修 飾形式的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果(針對標準化的細胞凋亡 片段計算為對照的百分比)是形式Η，0· 04199 ；形式H+l，0. 2061 ；形式Η_1，0. 2783 ；形式 Η-2,0. 6377 ；形式 V，0. 05371 ；形式 V_1，0. 4648 ；形式 V_2，0. 006836 ；形式K，0. 01855 ；形式 Q，0. 024。圖13A-1提供了計算為P-G的過客鏈與引導鏈之間的活性的差異，其中如圖4B和圖4C 一樣針對具有未修飾形式A和修飾形式H、H+1、H-1、V-2、K和0 (其中修飾是2 ‘ -0-甲 基修飾核苷酸)的siRNA定義P和G。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢 驗(成對的)的結(jié)果如下形式Η，0. 00001574 ；形式Η+1，0. 001091 ；形式Η_1，0. 001918 ；形 式 V-2，0. 0002131 ；形式 Κ，0. 0003619 ；形式 0，0. 406。圖13Α-2提供了圖13Α-1的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性的倍數(shù)變 化。將各修飾形式與未修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形 式 Η，0· 00001574 ；形式 Η+1，0. 007443 ；形式 Η_1，0. 02514 ；形式 V-2,0. 0001464 ；形式 K, 0. 0003619 ；形式 0,0. 5446。圖13B提供了具有未修飾形式A和修飾形式H、H+l、H_l、K、V-2和0(其中修飾 是2' -0-甲基修飾的核苷酸)的siRNA對內(nèi)源靶的抑制活性的數(shù)據(jù)。將各修飾形式與未 修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，3.47E-06 ；形式H+1， 0. 001957517 ；形式 H_l，8. 79E-09 ；形式 K，0. 005446013 ；形式 V-2，1. 95Ε-09 ；和形式 0， 0.9972392。圖13C提供了由于具有未修飾形式A和具有修飾形式H、H-l、K和V(具有 2' -0-甲基修飾核苷酸)的siRNA沉默一組基因靶而產(chǎn)生的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所述基因靶的抑制預期增加有絲分裂，如實施例6所描述的。將各修飾形式與未修飾 形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0. 1953 ；形式H-1，0.6406 ； 形式 V，0. 1953 ；形式 K, 0. 6406。圖13D提供由于具有未修飾形式A和具有修飾形式H、H_1、V和K (具有2 ‘ _0_甲 基修飾核苷酸)的siRNA沉默一組基因靶而產(chǎn)生的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述 基因靶的抑制預期對細胞凋亡沒有作用，如實施例6中所描述的。然而，特別地選擇已在經(jīng) 驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時， 是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照 相比，其具有更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。將未修飾形式A與各修飾形式進行比較的Wi 1 coxon 檢驗(成對的)的結(jié)果是形式H，0.9102 ；形式H-1，0. 25 ；形式V，0.6523 ；形式K，0. 7344。圖14Α提供了具有未修飾形式A和具有LNΑ 修飾形式H、Μ、W、W+l、W-1、Y、Υ+1 和Y-I的SiRNA對內(nèi)源靶的mRNA抑制活性的箱線圖。將未修飾形式A與各修飾形式進行 比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式H，0. 005302 ；形式Μ， 0. 02475 ；形式 W，1 ；形式 W+1，0. 8423 ；形式 W_1，0. 5096 ；形式 Y，0. 932 ；形式 Υ+1，0. 887 ；形 式 Υ-Ι,ο. 5891。圖14Β提供了具有未修飾形式A和具有LNA 修飾形式H、M、JBU JB2、JB3、JB4 和JB5的siRNA對內(nèi)源靶的mRNA抑制活性的箱線圖。將未修飾形式A與各修飾形式進行 比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式Η，0. 005302 ；形式Μ， 0. 02475 ；形式 JBl,0. 009613 ；形式 JB2，0. 7259 ；形式 JB 3,0. 4213 ；形式 JB4，0. 04904 ；形 式 JB5，0. 972。圖15A至圖15D提供了關(guān)于具有未修飾形式A和具有LNA 修飾形式H、M、W、W+1、 W-1、Y、Y+1和Y-I的SiRNA在細胞生物學研究中對中靶和脫靶表型的影響的數(shù)據(jù)。參見實 施例6。圖15A提供了實施例6中描述的關(guān)于一組基因靶的標準化的有絲分裂細胞的箱線 圖，所述基因靶的抑制預期減少有絲分裂，如實施例6中所描述的。陰性對照(Neg)是混 雜的非靶向性siRNA，對于所述混雜的非靶向性siRNA，有絲分裂的定量被標準化為1. 0的 值。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下 形式 Η，0· 4961 ；形式 M，1 ；形式 W，0. 01953 ；形式 W+1，0. 5703 ；形式 W_1，0. 07422 ；形式 Y， 0. 03906 ；形式 Y+1，0. 4961 ；形式 Υ_1，0. 09766。圖15Β如圖15Α —樣提供了一組基因靶的箱線圖，所述基因靶的抑制預期不影響 有絲分裂。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂脫靶效應的siRNA來進行研究以確 定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可通 過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大約0.7的中值)來證明。將未修飾 形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié) 果是形式 H，0. 5 ；形式 M，0. 75 ；形式 W，0. 25 ；形式 W+1，0. 25 ；形式 W_1，0. 25 ；形式 Y，0. 25 ； 形式 Υ+1，0. 25 ；形式 Y-l，l。圖15C提供了關(guān)于一組基因靶的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述基因靶的 抑制預期增加細胞凋亡，如實施例6中所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行 比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0.75 ；形式Μ，0.25 ；形式W，0.25 ；形式 w-l,l ；形式 W+1，0. 25 ；形式 Y，0. 25 ；形式 Υ_1，0. 25 ；形式 Υ+1，0. 25。圖15D如圖15C —樣提供了基因靶的亞組的箱線圖，所述基因靶亞組的抑制預期 對細胞凋亡沒有作用。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進 行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫 靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大于3. 5的中值和更大的 數(shù)據(jù)分布)來證明。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對 的)的結(jié)果如下形式H，0. 01221 ；形式M，0. 8501 ；形式W，0. 07715 ；形式W+1，0. 06396 ；形 式 W-1，0. 1763 ；形式 Y，0. 03418 ；形式 Υ+1，0. 021 ；形式 Υ_1，0. 2036。圖16Α至圖16D提供了關(guān)于具有未修飾形式A和具有LNA 修飾形式H、M、JBl、 JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA在細胞生物學研究中對中靶和脫靶表型的影響的數(shù)據(jù)。參 見實施例6。圖16A提供了關(guān)于一組基因靶的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所述基因靶的 抑制預期減少有絲分裂。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成 對的)的結(jié)果如下形式H，0.4961 ；形式M，1 ；形式JB 1，0.3594 ；形式JB2，0. 6523 ；形式 JB3，0. 02734 ；形式 JB4，0. 1641 ；形式 JB5，0. 2031。圖16B如圖16A —樣提供了一組基因靶的箱線圖，所述基因靶的抑制預期不影響 有絲分裂。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂脫靶效應的siRNA來進行研究以確 定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可通 過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大約0. 65的中值，從而展示有絲分裂 的減少)來證明。將未修飾形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的) 的結(jié)果如下形式H，0. 5 ；形式M，0. 75 ；形式JB1，0. 25 ；形式JB2，0. 25 ；形式JB 3,0. 75 ；形 式 JB4，0. 25 ；形式 JB5，0. 25。圖16C提供了由于沉默一組基因靶而引起的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所 述基因靶的抑制預期增加細胞凋亡，如實施例6中所描述的。將各修飾形式與未修飾siRNA 形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0.75 ；形式M，0.25 ；形式 JBl, 0. 25 ；形式 JB2，0.25 ；形式 JB 3，0.25 ；形式 JB4，0. 5 ；形式 JB5，0.75。圖16D如圖16C —樣提供了一組基因靶的箱線圖，所述基因靶的抑制預期對細胞 凋亡沒有作用。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究 以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應 可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照處理的樣品相比，其具有增加的大于3的中值 和更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。將各修飾形式與未修飾siRNA形式進行比較的Wilcoxon檢 驗(成對的)的結(jié)果如下形式H，0. 01221 ；形式M，0. 8501 ；形式JB1，0. 0009766 ；形式JB2， 0. 0004883 ；形式 JB 3,0. 0004883 ；形式 JB4，0. 003418 ；形式 JB5，0. 003418。圖17提供了作為未修飾siRNA在37°C下于90%血清中的時間的函數(shù)的血清穩(wěn)定 性的測定。顯示了在0、5、10、15、30、60、120分鐘的溫育時8個不同siRNA的剩余全長siRNA 雙鏈體的百分比。圖18A提供了當在實施例7中描述的條件下用90%的 血清處理時，保持全長的 siRNA的百分比的箱線圖。提供了關(guān)于未修飾形式AsiRNA、siRNA修飾形式F(該形式被 Elmen 等人(Nucleic AcidsResearch 33 1，439-447，2005)引述為 siLNA5 并且在本文中用作穩(wěn)定性的參照對照)和具有修飾形式H、DH21、DH20、DH3、DH30、DH35、DH6、DH34和DH2的siRNA(其中修飾是LNA 殘基)的數(shù)據(jù)。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢 驗(成對的)的結(jié)果是形式H，0. 007813 ；形式DH21，0. 007813 ；形式DH20，0. 007813 ；形式 DH3，0. 007813 ；形式 DH30，0. 007813 ；形式 DH35，0. 01563 ；形式 DH6，0. 007813 ；形式 DH34， 0. 02488 ；形式 DH2，0. 2049。圖 18B 提供了相對于 Neg 對照 siRNA，由以形式 A、F、H、DH21、DH20、DH3、DH30、 DH35、DH6、DH34、DH2 (如實施例7中所描述的)存在的LNA 修飾的siRNA產(chǎn)生的mRNA抑 制的分數(shù)的箱線圖。將未修飾形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對 的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式F，0. 05469 ；形式H，0. 3828 ；形式DH21，0. 007813 ； 形式 DH20，0. 007813 ；形式 DH 3,0. 007813 ；形式 DH30，0. 007813 ；形式 DH 35，0.01563 ；形 式 DH6，0. 007813 ；形式 DH34，0. 03906 ；形式 DH2，0. 6406。圖19A提供了當在實施例7中描述的條件下用90%的血清處理時，保持全長的 siRNA的百分比的箱線圖。提供了關(guān)于修飾形式F、DH2、DH19、DH4、DH31、DH27和DH25的數(shù) 據(jù)，其中修飾是LNA 殘基。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的) 的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH 19，0. 1953 ；形式DH4，0. 02249 ； 形式 DH31，0. 01563 ；形式 DH27，0. 1094 ；形式 DH25，0. 1094。圖 19B 提供了相對于 Neg 對照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH19、DH4、DH31、DH27 禾口 DH25(如由實施例7所描述的)存在的LNA 修飾的siRNA產(chǎn)生的mRNA抑制的分數(shù)的箱 線圖。將未修飾形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學 顯著性的計算結(jié)果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH19，0. 01563 ；形式DH4， 0. 007813 ；形式 DH31,0. 01563 ；形式 DH27，0. 01563 ；形式 DH25，0. 007813。圖20A提供了當在實施例7描述的條件下用血清處理時，保持全長的siRNA的百 分比的箱線圖。提供了關(guān)于修飾形式F、DH2、DH47、DH29、DH28和DH18的數(shù)據(jù)，其中修飾 是LNA 殘基。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯 著性的計算結(jié)果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH47，0. 03906 ；形式DH29，0. 07813 ；形式DH28， 0. 01415 ；形式 DH18，0. 06836。圖 20B提供了相對于Neg對照 siRNA，由以形式F、DH2、DH47、DH29、DH28和 DH18(如 實施例7所描述的)存在的LNA 修飾的siRNA產(chǎn)生的mRNA抑制的分數(shù)的箱線圖。將未修 飾形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算 結(jié)果是:F,0. 05469 ；形式 DH2，0. 6406 ；形式 DH47，0. 3125 ；形式 DH29，0. 02249 ；形式 DH28, 0. 01563 ；形式 DH18，0. 01563。)圖21A提供了當在實施例7中描述的條件下用血清處理時，保持全長的siRNA的 百分比的箱線圖。提供了關(guān)于修飾形式F、DH 36、DH2、DH9、DH46、DH 33和DHlO的數(shù)據(jù)，其 中所述修飾是LNA 殘基。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的) 的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式DH36，0. 1609 ；形式DH2，0. 2049 ；形式DH9，0. 5534 ；形 式 DH46，0. 02071 ；形式 DH33，0. 1508 ；形式 DH10，0. 05469。圖 21B 提供了相對于 Neg 對照 siRNA，由以形式 F、DH 36、DH2、DH9、DH46、DH33 和 DHlO (如實施例7所描述的)存在的LNA 修飾的SiRNA產(chǎn)生的mRNA抑制的分數(shù)的箱線圖。 將未修飾形式A對照與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式 F, 0. 05469 ；形式 DH 36，0. 01563 ；形式 DH2，0. 6406 ；形式 DH9，0. 1484 ； 形式 DH46，0. 1484 ；形式 DH 33,0. 007813 ；形式 DH10，0. 007813。
圖22A提供了當在實施例7中描述的條件下用血清處理時，保持全長的siRNA的 百分比的箱線圖。提供了關(guān)于修飾形式F、DH2、DH7、DH23、DH1、DH48、DH49、DH44和DH45的 數(shù)據(jù)，其中修飾是LNA 殘基。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的) 的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH7，0. 3828 ；形式DH23，0. 03461 ； 形式 DHl,0. 1484 ；形式 DH48，0. 6406 ；形式 DH49，0. 1410 ；形式 DH44，0. 3125 ；形式 DH45, 0.1052。圖 22B 提供了相對于 Neg 對照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH7、DH23、DHU DH48、 DH49、DH44和DH45 (如實施例7所描述的)存在的LNA 修飾的siRNA產(chǎn)生的mRNA抑制 的分數(shù)的箱線圖。將未修飾形式A與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)的 統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH7，0. 05469 ；形式 DH23，0. 007813 ；形式 DHl，0. 007813 ；形式 DH48，0. 1953 ；形式 DH49，0. 4609 ；形式 DH44， 0. 007813 ；形式 DH45，0. 01563。圖23A提供了當在實施例7中描述的條件下用血清處理時，保持全長的siRNA的 百分比的箱線圖。提供了關(guān)于修飾形式F、DH2、DH38、DH1、DH39、DH40、DH41、DH42和DH43 的數(shù)據(jù)，其中修飾是LNA 殘基。將形式F與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成 對的)的統(tǒng)計學顯著性的計算結(jié)果是形式DH2，0.2049 ；形式DH 38，0. 04206 ；形式DH1， 0. 1484 ；形式DH 39,0. 07813 ；形式DH40，0. 2500 ；形式DH41，0. 2620 ；形式DH42，0. 1094 ；形 式 DH43，0. 3621。圖 23B 提供了相對于 Neg 對照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH38、DHU DH 39、DH40、 DH41、DH42和DH43 (如實施例7所描述的)存在的LNA 修飾的siRNA產(chǎn)生的mRNA抑制 的分數(shù)的箱線圖。將未修飾形式A與各修飾形式進行比較的Wilcoxon檢驗(成對的)統(tǒng) 計學顯著性的計算結(jié)果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH38，0. 007813 ；形式 DHl, 0. 007813 ；形式 DH39，0. 007813 ；形式 DH40，0. 01563 ；形式 DH41，0. 007813 ；形式 DH42， 0. 007813 ；形式 DH43，0. 02344。圖24提供了體內(nèi)存在的穩(wěn)定的siRNA的定量。比較存在于加料的對照動物 (spiked control animal)的肝中的siRNA的量與存在于注射了未修飾形式A siRNA和具 有形式DHl或形式DH47的LNA⑩修飾形式化的穩(wěn)定的siRNA的測試動物的肝中的siRNA 的量。CT是循環(huán)閾值。各種實施方案的描述應理解，上述一般描述和下列詳細描述只是示例性和說明性的，無意限定本教導 的范圍。在本申請中，除非明確地指出，否則使用的單數(shù)包括復數(shù)。例如“至少一個”意指 可存在一個以上。同樣，使用的“包含”、“含有”和“包括”，或此類根詞的變體例如但不限于 “包含(comprises)”、“含有(contained) ”和“包括(including) ”無意是限定性的，其是指
“包括下列元素但不排除其他元素”。術(shù)語“基本上由......組成”或“基本上由......組
成的”，如本文中所使用的，不包括對組合具有任何實質(zhì)意義的其他元素。除非另外指出，否 則使用的“或”是指“和/或”。術(shù)語“和/或”是指其之前和之后的項可合在一起或分開。 為了舉例說明的目的，而非作為限制，“X和/或Y”可表示“X”或“Y”或“X和Y”。
當本文中提供值的范圍時，除非另外明確地指出，否則范圍包括起始值和終值以 及其間的任何值或值的范圍。例如，“0. 2至0. 5”是指0. 2,0. 3,0. 4,0. 5 ；其間的范圍例如 0. 2 至 0. 3、0· 3 至 0. 4、0· 2 至 0. 4 ；其間的增量(increment)例如 0. 25,0. 35,0. 225,0. 335、 0. 49 ；其間的增量范圍例如0. 26至0. 39等。本申請中引用的所有文獻和相似材料包括但不限于專利、專利申請、論文、書、專題論文(treatise)和國際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁，無論此類文獻和相似材料的形式，明確地以其全文 通過引用合并入本文用于任何目的。在一個或多個合并的文獻和相似材料以與本申請中的 術(shù)語的定義矛盾的方式定義或使用該術(shù)語時，以本申請的定義為準。當結(jié)合不同實施方案 描述本教導時，本教導不意欲限定于此類實施方案。相反，本教導包括各種改變、修飾和等 價物，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。術(shù)語“或其組合”，如本文中所使用的，是指該術(shù)語前面所列項的所有排列和組合。 例如“A、B、C或其組合”意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一個，并且如果順序在 特定背景中是重要的話，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。對于該示例，明確包 括的是含有一個或多個項目或項的重復的組合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除非根據(jù)上下文明顯地表現(xiàn)出來，否則通常對任何組合 中的項目或項的數(shù)目沒有限制。術(shù)語“替代物”，如本文中所使用的，意指表示另一種產(chǎn)物的 存在的產(chǎn)物。例如，擴增產(chǎn)物是已被擴增的核酸的替代物。如本文中所使用的，siRNA的“修飾形式(modification format) ”是指修飾的核 苷酸和“除了修飾的之外的(other-than modified) ”核苷酸的模式，如由圖IA至圖IK所 示的模式或形式舉例說明的。下面描述修飾的核苷酸。“除了修飾的之外的”是指未修飾的 核苷酸或具有除了特定形式中的修飾核苷酸的修飾之外的修飾的修飾核苷酸。如本文中所使用的，“不依賴于序列的修飾”是指實施方案提供的修飾核苷酸和修 飾形式可用于任何SiRNA序列而不考慮該SiRNA的具體序列?！爸邪?on-target)，，事件，如本文中所使用的，是指靶基因的mRNA受經(jīng)設計靶向 該基因的siRNA影響(即，抑制)，如通過減少的表達、降低的mRNA水平或特定表型的喪失 或獲得所證明的。例如，“中靶”事件可通過另一種方法例如使用已知影響該靶的藥物，或例 如通過引入來自直向同源物的靶mRNA拯救喪失的表型來驗證?！懊摪惺录保绫疚闹兴褂玫?，意指RNA干擾中除了期望的事件外的任何事件。 脫靶事件的實例是不被靶向的基因的mRNA受siRNA影響(S卩，抑制)。這樣的“脫靶事件” 不能通過提供來自適當?shù)南嚓P(guān)直向同源物的靶mRNA來拯救。“脫靶事件”可歸因于以改變 非靶的表達的方式與另一種mRNA、內(nèi)源RNA、DNA或蛋白質(zhì)的相互作用。這樣的脫靶事件可 歸因于例如整合入RI SC的核苷酸序列與非靶mRNA之間的錯配堿基配對或細胞環(huán)境中的 非特異性相互作用。不恰當?shù)腞ISC結(jié)合、不恰當?shù)腞ISC介導的相互作用和不恰當?shù)腞ISC 介導的切割可促成脫靶事件。脫靶事件還可歸因于細胞毒性應答、干擾素應答、microRNA作 用或與非編碼RNA的相互作用。最常見的脫靶事件可能是不期望的過客(有義)鏈至RISC 復合物內(nèi)的整合。然而，受siRNA影響的脫靶事件并非完全可預測的并且傾向于是非特異 性的。脫靶事件產(chǎn)生脫靶效應，所述術(shù)語在本文中可互換使用。術(shù)語“效力”，如本文中所使用的，是將其靶mRNA抑制至起始mRNA水平的50 %所 需的單個siRNA或siRNA的混合物的濃度的量度。通常，用IC50 (半最大(50% )mRNA抑制所需的siRNA的濃度)來描述效力。在本文中通過轉(zhuǎn)染一系列siRNA濃度(例如，在IOOnM 至IOpm范圍中的至少6個濃度)，然后對樣品進行qRT-PCR分析來測定效力。將結(jié)果作圖， 通過外推獲得50%的mRNA抑制時的濃度來測定IC50。使用曲線擬合程序來測定獲得50% 的mRNA靶的抑制所需的siRNA的濃度。如本文中所使用的，術(shù)語“效力”可與術(shù)語“抑制活 性”(其是與暴露于陰性對照siRNA后存在的mRNA的量相比，暴露于測試siRNA后mRNA的 減少的量的量度)互換使用。術(shù)語“功效”，如本文中所使用的，是產(chǎn)生最小閾值的mRNA抑制的siRNA的百分比。 術(shù)語功效通常用于siRNA的集合或用于siRNA設計算法的預測力。通過qRT-PCR或靶mRNA 的siRNA抑制的基于載體的測量來測量功效，其結(jié)果表示為產(chǎn)生最小閾值的抑制的siRNA 的百分比，例如，產(chǎn)生70%或更高水平的抑制的siRNA的百分比。術(shù)語“特異性”，如本文中所使用的，是siRNA在mRNA水平或蛋白質(zhì)水平上影響基 因調(diào)控的精確性的量度，或由于靶基因功能的抑制而展示的真實表型。通過測定作為siRNA 轉(zhuǎn)染的結(jié)果相對于某個閾值發(fā)生變化的基因的數(shù)目來測量特異性，所述基因不是期望的靶 并且已知不處于靶基因的信號轉(zhuǎn)導途徑中。工業(yè)標準閾值是2倍變化。在細胞生物學研究 中，針對特定靶的高特異性siRNA導致具有極少或沒有預料之外的表型的重疊表型。特異 性較差的siRNA導致由于脫靶效應而引起的表型?！疤岣叩摹毙Яκ侵冈谙嗤臐舛认屡c另一種siRNA相比具有更低的IC50或更 高的百分比抑制的siRNA，“提高的”特異性是指與另一種siRNA相比影響更少的基因的 siRNA，“提高的”功效是指使用算法產(chǎn)生的一組siRNA，其中與使用不同算法產(chǎn)生的另一 siRNA組相比，該siRNA組中更大百分比的siRNA產(chǎn)生最小指定量的抑制。為了進行本文中的研究，將測試結(jié)果與對照結(jié)果相比，并且將所有結(jié)果針對設計 為非靶向性的無義siRNA進行標準化。用于成對樣品的Wilc0x0n檢驗是成對樣品t檢驗 的非參數(shù)等價檢驗。Wilc0x0n檢驗排列樣品1和樣品2中的成對數(shù)據(jù)之間的差的絕對值并 且計算關(guān)于正差和負差(差計算為樣品2-樣品1)的數(shù)目的統(tǒng)計值。所使用的軟件是可免 費從 cran. org 獲得的"R Package，，。術(shù)語“核苷酸”通常指以單體形式存在的或存在于二核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸 中的核苷的磷酸酯。核苷通常是與核糖(核糖核苷)或脫氧核糖(脫氧核糖核苷)的C-I' 碳連接的嘌呤堿基或嘧啶堿基。天然發(fā)生的嘌呤堿基通常包括腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)。 天然發(fā)生的嘧啶堿基通常包括胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)。當核苷堿基是嘌呤 時，核糖或脫氧核糖在嘌呤的9位上連接至核堿基(nucleobase)，當核堿基是嘧啶時，核糖 或脫氧核糖在嘧啶的1位上連接至核堿基。核糖核苷酸是核糖核苷的磷酸酯，脫氧核糖核 苷酸是脫氧核糖核苷的磷酸酯。術(shù)語“核苷酸”是核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的統(tǒng)稱。二 核苷酸通常具有通過3' -5'磷酸二酯連接共價鍵合的兩個核苷酸。寡核苷酸通常具有2 個以上的核苷酸，多核苷酸通常是指核苷酸單體的聚合物。本申請者為了方便起見在本文 中可互換地使用術(shù)語“核苷酸”和“核苷”，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)術(shù)語出現(xiàn)的上下文，易 于理解可使用哪個術(shù)語。核苷酸單體通過“核苷間或核苷酸間的連接”例如 磷酸二酯連接(phosphodiester linkage)連接，其中，如本文中所用的，術(shù)語“磷酸二酯連接”是指磷酸二酯鍵 (phosphodiester bond)或包含其磷酸鹽/酯類似物(包括結(jié)合的抗衡離子例如H+、NH4\Na+，如果此類抗衡離子存在的話)的鍵。下文描述另外的核苷間或核苷酸間的連接。當寡 核苷酸由字母序列表示時，應理解，除非另外指出或根據(jù)上下文期望相反方向?qū)τ诒绢I(lǐng)域 技術(shù)人員來說是顯然的，否則核苷酸以5'至3'的順序從左至右排列。合成寡核苷酸的方 法的描述尤其可見于美國專利 4，373，071,4, 401，796,4, 415，732,4, 458，066,4, 500，707、 4，668，777,4, 973，679,5, 047，524,5, 132，418,5, 153，319 和 5，262，530。寡核苷酸可以是 任何長度?！皦A基配對”，如本文中所使用的，是指標準Watson-Crick堿基配對。常見于雙鏈 (雙鏈體)核酸中的堿基配對是G:C、A:T和A:U。此類堿基對稱為互補堿基對，一個堿基與 其配對的堿基互補。當與互補核苷酸或核苷酸類似物配對時，下文中描述的核苷酸類似物 也能夠形成氫鍵。如本文中所使用的，術(shù)語“互補”或“互補性，，不僅用于指堿基對而且還用于指通 過Watson-Crick堿基配對法則產(chǎn)生聯(lián)系的寡核苷酸的反向平行鏈，能夠按照標準互補法 則進行堿基配對的或能夠在相對嚴格條件下與特定核酸區(qū)段雜交的核酸序列。例如，序列 5' -AGTTC-3'與序列5' -GAACT-3'互補。術(shù)語“完全互補”或“100%互補”等是指反向 平行鏈之間的堿基完全配對(多核苷酸雙鏈體中無錯配)的互補序列。核酸聚合物可以只 在它們的完整序列的一部分上互補。術(shù)語“部分互補性”、“部分互補”、“不完全互補性”或 “不完全互補”等是指低于100%完全配對(例如在多核苷酸雙鏈體中存在至少一個錯配) 的反向平行多核苷酸鏈之間的堿基的任何比對。此外，兩個序列，如果在它們的比對中存在 一個或多個錯配、缺口或插入，那么它們被認為在它們的長度的一部分上是互補的。此外，靶多核苷酸的“互補物”是指可在反向平行締合中與靶多核苷酸的至少一部 分結(jié)合的多核苷酸。反向平行締合可以是分子內(nèi)的，例如以核酸分子內(nèi)的發(fā)夾環(huán)的形式存 在，或分子間的，例如當兩個或多個單鏈核酸分子彼此雜交時。術(shù)語“相應于”，當指核酸時， 意指特定序列足以與反向平行序列互補，這樣兩個序列在適當?shù)臈l件下將退火并且形成雙 鏈體。如本文中所使用的，“過客(有義)”鏈、區(qū)域或寡核苷酸是指具有與DNA的有義鏈 的至少一部分或mRNA的至少一部分的核苷酸序列相同的核苷酸序列的核苷酸序列。“過客 (有義)鏈”包括與另一個多核苷酸的互補引導(反義)區(qū)形成雙鏈體的多核苷酸的有義 區(qū)域。發(fā)夾單鏈寡核苷酸(shRNA)還可在相同分子內(nèi)包含過客(有義)區(qū)和引導(反義) 區(qū)，所述區(qū)域形成通過環(huán)序列或環(huán)連接體部分連接的雙鏈體結(jié)構(gòu)，如下面進一步描述的。發(fā) 夾可以為左手方向(即，5'-反義-環(huán)-有義-3')或右手方向(即，5'-有義-環(huán)-反 義-3')。如本文中所使用的，“siRNA”是指通過RNA干擾(RNAi)途徑誘導基因沉默的短干 擾RNA雙鏈體。短干擾RNA的長度可以變化，并且可在反義與有義區(qū)域之間以及反義區(qū)域 與靶mRNA序列之間包含至多一個或兩個錯配堿基對。各siRNA可包含15至30個堿基對， 或18至25個堿基對，或19至22個堿基對或21個堿基對或19個堿基對。在一些實施方案 中，siRNA在5'末端、3'末端或5'末端和3'末端上獨立地具有1、2、3、4或5個未配對 的懸突核苷酸。在一些實施方案中，siRNA具有平末端。此外，術(shù)語“siRNA”包括兩條分開 的鏈的雙鏈體以及可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈(shRNA)。shRNA可具有例如4至30個或6至20 個或7至15個核苷酸的核苷酸環(huán)序列，或可包含非核苷酸部分例如烴連接區(qū)(hydrocarbon
22linking region)，或其組合。shRNA可包含錯配或凸出(bulge)。在一些實施方案中，本教導包括修飾的核苷酸，其與非修飾的核苷酸相比具有增強的堿基配對的親和力或賦予核苷酸序列(所述修飾的核苷酸是該核苷酸序列的一部分) 增強的親和力。修飾的核苷酸，如本文中所涉及的，使RNA的構(gòu)象平衡移向與RNA雙鏈體的 A 型幾何形狀(A-form geometry) 一致的 nor thern (C3' -endo)構(gòu)象。DNA:RNA 雙鏈體也 可藉此來穩(wěn)定。在一些實施方案中，通過構(gòu)建具有二環(huán)核苷酸、三環(huán)核苷酸或2'-修飾的 核苷酸的過客(有義)寡核苷酸來獲得增強的堿基配對的親和力。在一些實施方案中，siRNA的修飾核苷酸獨立地包括修飾的糖部分、修飾的堿基部 分、修飾的核苷間部分或任何這些修飾部分的組合。在一些實施方案中，修飾的核苷酸包括修飾的糖部分，包括但不限于，2'-鹵代 (其中鹵代是氯代、氟代、溴代或碘代)；阿拉伯糖構(gòu)象中的阿糖基(arabino)或2'-氟代 (FANA) ；2' -H，-SH、_NH2、_CN、疊氮化合物；或-OR、-R、_SR、-NHR 或 _N(R)2，其中 R 是烷 基、烯基、炔基、烷氧基(alkoxy)、氧烷基(oxyalkyl)、烷氧基烷基、烷基胺，其中烷基部分 是 C1-C6。另外的2 ‘ 修飾包括2 ‘ -0-(CH2)4NH2 ； 2 ‘ -0-蒽醌基烷基 (anthraquinolylalkyl)，其中燒基包括甲基或乙基；2' _0_(CH2)2_0CH3、2‘ -0_(CH2CH20) n-CH3，其中 n 是 1-4 ;2‘ -0-CH2-CHR-X，其中 X = OH、F、CF3 或 0CH3 以及 R = H、CH3、CH20H 或CH20CH3Jt核酸單體或其衍生物(PNA) ;2'修飾，其中2'-位是烷氧基，例如，甲氧基、
乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基和苯氧基等。在一些實施方案中，修飾的核苷酸包括修飾的糖部分或假糖(pseudosugar)，包括 但不限于二環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(a)、三環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(b)或二環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(c) 其中R1和R2獨立地是0、S、CH2或NR，其中R是氫或C"-烷基；R3是CH2、CH2_0、 CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR，其中 R 是氫或 Ch-烷基；R4 和 R5 獨立地 是核苷間的連接、末端基團或保護基團；R4和R5中至少一個是核苷間的連接；B是核堿基、 核堿基衍生物或核堿基類似物。在一些實施方案中，R4和R5獨立地是H、0H、磷酸鹽/酯、 -烷基胺、q
-12 -烯基、-12
-炔基、Q
-12
-環(huán)烷基、q —12_方焼基、方基、 酰基、 甲硅烷基、寡核苷酸、通過核苷間的連接鍵合的核苷、或其組合；以及R4和R5中至少一個 是寡核苷酸，或通過核苷間的連接鍵合的核苷。可利用取代基例如磷酸鹽/酯、(V12-烷基、 (V12-烷基胺、(V12-烯基、Ci_12-炔基、Ci_12-環(huán)烷基、Ci_12-芳烷基、芳基、?；蚣坠柰榛M 一步衍生5'末端。在一些實施方案中，例如利用(12或(6取代基或利用磷酸鹽/酯衍生 5'末端。
二環(huán)核苷酸包括上文中對于結(jié)構(gòu)(a)和(C)所描述的二環(huán)核苷酸。結(jié)構(gòu)(a)的二 環(huán)核苷酸也稱為鎖核酸(locked nucleic acid)或LNA ,包括例如β-D，和α-L 二環(huán)核 苷酸、二環(huán)核苷酸例如木糖-鎖核酸(xylo-locked nucleic acid)(美國專利7，084，125)、 L-核糖-鎖核酸(美國專利7，053，207)、1' -2'鎖核酸(美國專利6，734，291和 6，639，059)以及3' -5'鎖核酸(美國專利6，083，482)。結(jié)構(gòu)(c)的二環(huán)核苷酸和含有此 類二環(huán)核苷酸的寡核苷酸的合成描述于例如Ma ier等人(Nucleic Acids Research 2004， 32 12，3642-3650)和Maderia等人(Nucleic Acids Research 2007，35 :6，1978-1991)中。 結(jié)構(gòu)(b)的三環(huán)核苷酸和含有此類三環(huán)核苷酸的寡核苷酸的合成描述于例如Ittig等人 (Nucleic Acids Research 2004，32 :1，346-353)中。 在一些實施方案中，核苷酸包括修飾的核苷間連接體部分，包括但不限 于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯 (phosphorodiselenoate) > phosphoroaniIothioate> phosphorani 1 idate> 氛基憐酸酉旨 (phosphoramidate)、boronophosphate> thioformacetal (-S-CH2-O-CH2-)、亞甲基(甲基 亞氨基)、二甲基胼基、磷?；B接的嗎啉代、-CH2-CO-NH-CH2-, -CH2-NH-CO-CH2-和磷酸酯 的任何類似物，其中磷原子為+5價氧化狀態(tài)，并且一個或多個氧原子用非氧部分例如硫取 代。肽核酸是其中主鏈包含合成的肽樣連接(酰胺鍵)(通常從N-(2-氨基-乙基)-甘氨 酸單位形成，導致無手性和不帶電荷的分子)的核酸類似物。示例性磷酸酯/鹽類似物包 含結(jié)合的抗衡離子例如H+、NH4\ Na+(如果此類抗衡離子存在的話)。在一些實施方案中，核苷酸包括修飾的堿基部分，包括但不限于嘧啶核堿基和嘌 呤核堿基以及其衍生物和類似物，包括但不限于用烷基、羧基烷基、氨基、羥基、鹵素(即， 氟、氯、溴或碘)、巰基或烷基巰基部分中的一個或多個取代的嘧啶和嘌呤。烷基(例如， 烷基、羧基烷基等)部分包含1至6個碳原子。本文中涉及的另外的修飾的核苷酸包括氧 雜環(huán)丁烷修飾的堿基(關(guān)于包含氧雜環(huán)丁烷修飾的堿基的論述，參見美國公開專利申請案 20040142946)。嘧啶、嘧啶衍生物和嘧啶類似物包括但不限于溴乙胺(bromothyminehl-甲基假 尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三 唑吡啶、3-甲基胞嘧啶、3-(3_氨基-3-羧基-丙基)尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、4-硫代尿嘧 啶、N4, N4-乙烯基胞嘧啶(ethanocytosine)、4-(6-氨基己基胞嘧啶)、5_甲基胞嘧啶、 5_乙基胞嘧啶、5-(C3，C6)_炔基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧 基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、 5_丙基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、硫代尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基氨基甲 基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧 啶、尿嘧啶-5-羥乙酸-甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-碘-2'-脫 氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、基于三環(huán)咔唑的嘧啶類似物、基于三環(huán)吩噁嗪的嘧 啶類似物、異胞嘧啶(isocytosine)、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、二氫尿嘧啶、假尿 嘧啶和通用核苷酸(universal nucleotide)。在一些實施方案中，嘌呤、嘌呤衍生物和嘌呤類似物包括但不限于氮雜嘌呤、氮 雜鳥嘌呤、氮雜腺嘌呤、脫氮嘌呤(deazapurine)、脫氮鳥嘌呤、脫氮腺嘌呤、1-甲基鳥嘌 呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基肌苷、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、2，2_ 二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、6-硫代腺嘌呤、6-硫代嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、 N，N-二甲基腺嘌呤、N6-異戊烯基腺嘌呤、N6，N6-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤、7-脫氮 黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤，7-鹵代-7-脫氮嘌呤，其中鹵代是溴代、氟代、碘 代或氯代、7-丙炔-7-脫氮嘌呤，8-溴腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-氯鳥嘌呤、 8_氨基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、8-甲基鳥嘌呤，8-硫代鳥嘌呤，8-氧-N6-甲基腺嘌呤、 N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)_氨甲?；?蘇氨酸、甲硫基腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌 呤、肌苷、wybutoxosine、wybutosine、異鳥嘌呤、Q 核苷(queuosine)、β -D-甘露糖基 Q 核 苷、β -D-半乳糖基Q核苷和通用核苷酸。通用堿基可以與一種類型以上的特定堿基或任何特定堿基堿基配對。在其他實 施方案中，通用堿基不與任何堿基特異性形成氫鍵而通過疏水堆積與相同核酸鏈上的相鄰 堿基相互作用。通用堿基包括但不限于吲哚例如7-氮雜吲哚、6-甲基-7-氮雜吲哚、丙炔 基-7-氮雜-吲哚、聯(lián)烯基-7-氮雜吲哚、異喹諾酮(isocarbostyril)、丙炔基異喹諾酮、咪 唑并口比唆(imidizopyridine)禾口 pyrrollpyrizine。在一些實施方案中，修飾的核苷酸以特定模式(在本文中稱為“形式”)存在于 siRNA中，如圖IA至圖IK所示的模式或形式所舉例說明的。在一些實施方案中，化學合成 的過客(有義)寡核苷酸具有15至30個核苷酸的長度并且包含不依賴于序列的修飾形式 (1)、不依賴于序列的修飾形式(2)和不依賴于序列的修飾形式(3)中的一個(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 為 0 或 1 ;x 為 7、8、9、10 或 11 ;r 為 0、1 或 2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+x+r+4)的整數(shù)；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ為 0或 l;y 為 7、8或 9 并且 ζ 為 1 ；或 y為7并且ζ為2或3 為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+4)的整 數(shù)；(3)5' m-Nfm-Nx-m-m-Nq-nJ'，其中 χ 為 8、9 或 10 ;r 為 0、1 或 2 ；以及 q 為表示 過客鏈的長度減去(x+r+5)的整數(shù)；其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸或三環(huán)核苷酸；各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核 苷酸或核糖核苷酸；且當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸；以 及當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外的核苷酸。在一些實施方案中，提供了化學合成的過客(有義)寡核苷酸，所述寡核苷酸基本 上由15至30個核苷酸的長度組成并且基本上由如下的不依賴于序列的修飾形式(1)、不依 賴于序列的修飾形式(2)和不依賴于序列的修飾形式(3)中的一個組成(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 為 0 或 1 ;x 為 7、8、9、10 或 11 ;r 為 0、1 或 2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+x+r+4)的整數(shù)；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ為 0或 l;y 為 7、8或 9 并且 ζ 為 1 ；或 y為7并且ζ為2或3 為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+4)的整 數(shù)；(3)5' m-Nrm-N.-m-m-N,-!!^'，其中 χ 為 8、9 或 10 ;r 為 0、1 或 2 ；以及 q 為表示 過客鏈的長度減去(x+r+5)的整數(shù)；其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸或三環(huán)核苷酸；各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸；以及 當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外的核苷酸。在一些實施方案中，引導(反義)寡核苷酸包含15至30個核苷酸，與至少12個 核苷酸的過客(有義)寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域，并且與靶mRNA的至少一部分具有互補 性。在一些實施方案中，引導(反義)寡核苷酸包含與至少13個核苷酸至相應于寡核苷酸 的全長的數(shù)目的核苷酸的過客(有義)寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域。在一些實施方案中，引 導(反義)寡核苷酸包含與過客(有義)寡核苷酸的全長(除了兩個3'核苷酸以外)連 續(xù)互補的區(qū)域。在一些實施方案中，引導(反義)寡核苷酸與靶mRNA的至少一部分具有至少12個 連續(xù)核苷酸的互補性。在一些實施方案中，引導(反義)寡核苷酸與靶mRNA的至少一部分 具有至少13個核苷酸至相應于引導寡核苷酸的全長的數(shù)目的核苷酸的互補性。在一些實 施方案中，引導寡核苷酸與靶mRNA的一部分具有完全互補性(除了 2個3'核苷酸以外)。在一些實施方案中，提供了包含過客(有義)寡核苷酸和引導(反義)寡核苷酸 的短干擾RNA，所述過客(有義)寡核苷酸具有17至30個核苷酸的長度并且包含不依賴于 序列的修飾形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一個，所述引導(反義)寡核苷酸具有17至 30個核苷酸，與至少12個核苷酸的過客(有義)寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域；引導鏈還與靶 mRNA的至少一部分具有互補性(4)5' mp-Nx-m-m-Nq-nr 3'，其中當 p 為 0 時，x 為 12 ；當 p 為 1 時，x 為 11 ；當 p 為2時，x為10;當p為3時，x為9;當p為4時，x為8;r為0、1或2;以及q是表示過客 鏈的長度減去(p+x+r+2)的整數(shù)；(5)5' m-m-Nx-m-Nq-n;V，其中x為ll;r為0、1或2;以及q是表示過客鏈的長 度減去(x+r+3)的整數(shù)；(6)5' mp-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3'，其中p為 3 ;y 為9并且z 為 1 ;r 為0、1 或2 ；以及 q為表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+2)的整數(shù)；其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸、三環(huán)核苷酸或2' _修飾的核苷酸；各n獨立地是 脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸，并且是懸突核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨 立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸，當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外 的核苷酸，以及當m是2'-修飾的核苷酸時，各N獨立地是除了 2'-修飾的核苷酸外的 核苷酸。在短干擾RNA的實施方案中，過客(有義)寡核苷酸具有不依賴于序列的修飾形 式(4)，p為2，x為10，r為2，各n是懸突核苷酸，并且各n獨立地是修飾的核苷酸，引導 (反義)寡核苷酸包含2個3'懸突修飾的核苷酸；各修飾的核苷酸獨立地是二環(huán)核苷酸、 三環(huán)核苷酸或2'修飾的核苷酸。在一個實施方案中，過客寡核苷酸的3'倒數(shù)第三個位點 和3'倒數(shù)第四個位點中的至少一個是修飾的核苷酸。3'倒數(shù)第三個位點是從最后一個位 點算起的第三個位點，即在倒數(shù)第二個位點之前的位點(例如，圖1H的形式DH47)。3'倒 數(shù)第四個位點是從最后一個位點算起的第四個位點，即，倒數(shù)第三個位點之前的位點(例 如，圖1H的形式DH29)。這樣的siRNA例如在血清存在的情況下對于核酸酶是特別穩(wěn)定的。在短干擾RNA的一些實施方案中，當長度為17個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2 和3中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為18個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3和4中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為19個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3、4和5 中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為20個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點2、3、4、5和 6中的至少一個是修飾的核苷酸；以及當長度為21至30個核苷酸時，引導寡核苷酸的位點 2、3、4、5、6和7中的至少一個是修飾的核苷酸。圖1K的形式DH1和形式DH39-DH43提供了 具有21個核苷酸的長度并且引導寡核苷酸的位點2、3、4、5、6和7中的至少一個是修飾的 核苷酸的siRNA修飾形式的實例。這樣的siRNA例如在血清或血漿存在的情況下對核酸酶 也是特別穩(wěn)定的。在一些實施方案中，過客(有義)寡核苷酸包含不依賴于序列的修飾形式(1)，其 中P為0，x為10并且r為2 (形式H，具有形式H的21聚體描述于圖1A)；或不依賴于序列 的修飾形式(1)，其中P為0，x為9或11，并且r為2 (形式H-1或形式H+1，具有這樣的形 式的21聚體描述于圖1B)；或不依賴于序列的修飾形式(2)，其中p為0，y為9，并且r為 2 (形式V，具有形式V的21聚體描述于圖1C)。在一些實施方案中，過客(有義)寡核苷酸包含不依賴于序列的修飾形式(1)，其 中P為l，x為9或10，r為2，(形式W或形式W+1，具有這樣的形式的21聚體描述于圖1D)， 并且各m具有結(jié)構(gòu)仏)，其中附是0，1 2是0，并且1 3是012。在一些實施方案中，過客(有 義)寡核苷酸包含不依賴于序列的修飾形式(3)，x為9或10，r為2，(形式Y(jié)或形式Y(jié)+1， 具有這樣的形式的21聚體描述于圖1D)，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中R1是0，R2是0，并 且R3是CH2。在另外的實施方案中，引導(反義)鏈的各N是除了二環(huán)核苷酸以外的核苷酸。在 一些實施方案中，引導(反義)鏈不具有修飾。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式H，其中修飾的核苷酸m在 所述形式的位點1、2、13和14上；各m是LNA ;各n是脫氧核苷酸；并且各N是核糖核苷 酸。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式H，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中 R1是0，R2是0，并且R3是CH2。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式V，其中修飾的核苷酸m在 所述形式的位點1、2、12和14上；各m是LNA ;各n是脫氧核苷酸；并且各N是核糖核苷 酸。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式V，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其 中R1是0，R2是0，并且R3是CH2。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式 V-2，其擁有形式(2)，其中p是0并且y是7。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式Q，其中修飾的核苷酸m在 所述形式的位點13和14上；各m是LNA ;各n是脫氧核苷酸；并且各N是核糖核苷酸。在 一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有修飾形式Q，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中R1是 0，R2是0，并且R3是CH2。在一些實施方案中，siRNA過客寡核苷酸具有形式(4)，其中當p為0時，x為12(形 式Q)；當P為1時，x為11(形式JB2)；當p為2時，x為10(形式H)；當p為3時，x為 9(形式JB5)，以及當p為4時，x為8(形式JB 3)并且r為2。在一些實施方案中，siRNA 過客寡核苷酸具有形式(5)，其中x為11(形式JB1)并且r為2。在另外的實施方案中， siRNA過客寡核苷酸具有形式(6)，其中p為3，y為9并且z為1 (形式JB4)，并且r為2。在一些實施方案中，化學合成的短干擾RNA包含通過核苷酸環(huán)或連接體環(huán)共價鍵合的過客(有義)寡核苷酸和引導(反義)寡核苷酸，其形成短發(fā)夾寡核苷酸。在一些實施方案中，siRNA的各3'末端獨立地具有1個、2個或3個核苷酸的懸 突，在一些實施方案中，各3'末端具有2個核苷酸的懸突，其中各懸突的核苷酸包括脫氧 核糖核苷酸。在一些實施方案中，至少一個懸突核苷酸是修飾的核苷酸。在一些實施方案 中，siRNA的各3'末端具有2個核苷酸的懸突，并且1、2、3或所有4個懸突核苷酸是修飾 的核苷酸。在一些實施方案中，至少一個核苷間的連接不是磷酸二酯核苷間連接?；瘜W合成按照標準方法進行干擾RNA寡核苷酸合成。合成方法的非限定性實例 包括使用二酯法、三酯法、多核苷酸磷酸化酶法和通過固相化學進行的體外化學合成。在下 面更詳細地論述此類方法。例如按照Imanishi在美國專利6，770，748和6，268，490中描述的；按照ffengel 在美國專利 7，084，125,7, 060，809,7, 053，207,7, 034，133,6, 794，499，和 6，670，461 和 美國公開申請案2005/0287566和2003/0224377中描述的；按照Kochkine在美國專利 6，734，291和6，639，059以及美國公開申請案2003/0092905中描述的；和按照Kauppinen 在美國公開申請案2004/0219565中描述的以及按照Srivastava，P.，等人(J.Am. Chem. Soc. 129，8362-8379，2007)合成具有二環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(包括結(jié)構(gòu)(a)的那些)的寡核苷酸。按照例如Ittig，D.等(Nucleic Acids Res. 32 :1，346-353，2004)合成具有三 環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(b)的寡核苷酸。按照例如Maier，M. A.等人(Nucleic Acids Res. 32 :12， 3642-3650,2004)合成具有二環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)(c)的寡核苷酸。按照Dowler等人(Nucleic Acids Res. 2006，34 :6，p 1669-1675)合成具有FANA取代基的寡核苷酸。寡核苷酸合成的二酯法是主要由Khorana等人(Science，203，614. 1979)開發(fā)成 可用狀態(tài)的第一個合成方法?；静襟E是將兩個適當保護的核苷酸連接起來，以形成包含 磷酸二酯鍵的二核苷酸。二酯法已良好地建立并且已被用于合成DNA分子。二酯法與三酯法之間的主要差異是在后者中在反應物和產(chǎn)物的磷酸鹽(酯)原子 (phosphate atom)上存在額外的保護基團(Itakura 等人，J. Biol. Chem.，250 :45921975)。 磷酸鹽(酯)保護基團通常是氯苯基，其使核苷酸和多核苷酸中間物溶解在有機溶劑中。因 此在氯仿溶液中進行純化。該方法的其他改進包括(i)三聚體或更大的寡聚體的嵌段偶聯(lián) (block coupling), (ii)廣泛使用高效液相色譜來純化中間物和終產(chǎn)物，和(iii)固相合 成。利用經(jīng)開發(fā)用于多肽的固相合成的技術(shù)，已能夠?qū)⑵鹗己塑账徇B接至固體支持材 料，然后進行核苷酸的逐個加入。簡化所有混合和清洗步驟，且該方法易于實現(xiàn)自動化?，F(xiàn) 可使用自動化核酸合成儀常規(guī)地進行此類合成。亞磷酰胺化學法(Beaucage,S. L.和 Iyer，R. P. Tetrahedron, 1993 (49) 6123 ； Tetrahedr on, 1992 (48) 2223)迄今已成為最廣泛使用的用于寡核苷酸的合成的偶聯(lián)化學 法(coupling chemistry)。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，寡核苷酸的亞磷酰胺合 成包括通過與活化劑反應來活化核苷亞磷酰胺單體前體以形成活化的中間物，然后將活化 的中間物順序加至正在生長的寡核苷酸鏈(通常一端錨定在合適的固體支持物上)以形成 寡核苷酸產(chǎn)物?？稍诜床拍考兓?reversed phase purification cartridge)、離子交換 HPLC、 瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、氯化銫離心梯度、含有結(jié)合核酸的試劑(例如玻璃纖維)的柱、過濾器或筒上或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法純化siRNA?？墒褂媚z電 泳來確定單鏈對雙鏈結(jié)構(gòu)，可使用離子交換HPLC來測定純度，可使用MALDI-MS來確定身份 (identity)，可使用UV光譜法來定量測定siRNA。含有內(nèi)源靶基因的細胞可來源于或包含于任何生物體(例如，真核生物例如植 物、動物、真菌；原核生物例如細菌)中。植物可以是單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物； 動物可以是脊椎動物或無脊椎動物。微生物可用于農(nóng)業(yè)或工業(yè)，或?qū)τ谥参锘騽游锟梢允?病原性的。真菌包括以霉菌和酵母形態(tài)學形式存在的生物。脊椎動物的實例包括魚和哺乳 動物(包括牛、山羊、豬、綿羊、倉鼠、小鼠、大鼠和人)；無脊椎動物包括線蟲、昆蟲、蜘蛛和 其他節(jié)肢動物。靶基因可以是來源于細胞的基因、內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因或外源基因例如感染后存在 于細胞中的病原體(例如病毒)的基因。具有靶基因的細胞可來自種系或體細胞、全能或 多能細胞、分裂或非分裂細胞、實質(zhì)或上皮細胞、永生化細胞或轉(zhuǎn)化細胞等。細胞可以是配 子或胚胎；如果是胚胎，其可以是單細胞胚胎或來自多細胞胚胎的組成細胞(constituent cell)。術(shù)語“胚胎”因此包括胎兒組織。具有靶基因的細胞可以是未分化的細胞例如 干細胞，或分化的細胞例如來自器官或組織包括胎兒組織的細胞或存在于生物體中的任 何其他細胞。分化的細胞類型包括脂肪細胞、成纖維細胞、肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞 (endothelium)、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血細胞、巨核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒 細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、白細胞、粒細胞、角質(zhì)形成細胞、軟骨細胞、 成骨細胞、破骨細胞、肝細胞以及內(nèi)分泌腺或外分泌腺的細胞。在一些實施方案中，靶RNA是轉(zhuǎn)錄的RNA，包括編碼RNA和非編碼RNA。如本文中所使用的，術(shù)語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”包括它們的后代，所 述后代是通過細胞分裂形成的任何和所有后代。應當理解，所有后代由于有意或無意的突 變而可能不完全相同。宿主細胞可以進行“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”，這是指利用其將外源核酸轉(zhuǎn)移 或引入宿主細胞的過程。轉(zhuǎn)化的細胞包括原代受試細胞和其后代。如本文中所使用的，術(shù) 語“工程改造的”和“重組”細胞或宿主細胞意欲指已向其中引入了外源核酸序列例如小干 擾RNA或編碼此類RNA的模板構(gòu)建體的細胞。因此，重組細胞與不包含重組引入的核酸的 天然存在的細胞是可區(qū)別的。在某些實施方案中，預期可將RNA或蛋白質(zhì)性質(zhì)的序列與其他選擇的RNA或蛋白 質(zhì)性質(zhì)的序列在相同宿主細胞中共表達?？赏ㄟ^用兩種或更多種不同的重組載體共轉(zhuǎn)染宿 主細胞來實現(xiàn)共表達。備選地，可構(gòu)建包含多個不同的RNA編碼區(qū)的單個重組載體，然后其 在用該單個載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞中進行表達。在一些實施方案中，含有內(nèi)源靶基因的組織是人組織。在某些實施方案中，組織包 括血液，例如但不限于紅細胞、白細胞、血小板、血漿、血清或全血。在某些實施方案中，組織 包括實體組織(solidtissue)。在某些實施方案中，組織包括病毒、細菌或真菌。在某些實 施方案中，組織包括離體組織。組織可包含待用核酸遞送組合物或另外的試劑轉(zhuǎn)化或接觸的宿主細胞。組織可以 是生物體的一部分或可從生物體分離。在某些實施方案中，組織和其組成細胞可包括但不 限于血液(例如，造血細胞(例如人造血祖細胞、人造血干細胞、⑶34+細胞、⑶4+細胞)、淋 巴細胞和其他血液譜系細胞)、骨髓、腦、干細胞、血管、肝、肺、骨、乳腺、軟骨、宮頸、結(jié)腸、角
29膜、胚胎、子宮內(nèi)膜、內(nèi)皮、上皮、食管、顏面(facia)、成纖維細胞、濾泡、神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)膠 質(zhì)細胞、杯狀細胞、腎、淋巴結(jié)、肌肉、神經(jīng)元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮膚、皮膚、小腸、 脾、胃、睪丸。在一些實施方案中，提供了對細胞內(nèi)和細胞外核酸酶穩(wěn)定的修飾形式化的siRNA。 在本文中證實，此類siRNA在生物學液體存在的情況下保持全長的時間比之已前已知的穩(wěn) 定的siRNA更長。將對核酸酶穩(wěn)定的siRNA用于含有特別高濃度的核酸酶的生物學液體和 組織(包括例如血清、血漿和特別血管化的器官和組織)中?？蓪iRNA與靶向細胞的配體結(jié)合。如本文中所使用的，“靶向細胞的配體”是 具有對于被靶向的位點例如細胞表面受體的特異性的細胞導向分子(ce 11-directing molecule)?！皩τ诒话邢虻奈稽c的特異性”是指在將靶向細胞的配體與細胞接觸后，在離子 強度、溫度、PH等的生理條件下，將發(fā)生特異性結(jié)合。細胞-配體相互作用可因配體的某些 殘基與細胞的特定殘基的特定靜電、疏水或其他相互作用而發(fā)生，從而在有效促進相互作 用的條件下形成穩(wěn)定的復合物。示例性靶向細胞的配體包括但不限于具有對于細胞受體、蛋白質(zhì)例如抗體、脂肪 酸、維生素、類黃酮、糖、抗原、受體、報告分子、報告酶、螯合劑、P卜啉、嵌入劑、類固醇和類 固醇衍生物、激素例如黃體酮(例如孕酮)、糖皮質(zhì)激素(例如，皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素(例 如，醛固酮)、雄激素(例如，睪酮)和雌激素(例如，雌二醇)、組胺、模擬激素(hormone mimics)例如嗎啡和大環(huán)化合物的親和力的多核苷酸、寡核苷酸、聚酰胺、肽。具有對于細胞 受體的親和力的肽可包括內(nèi)啡肽、腦啡肽、生長因子例如表皮生長因子、多聚L賴氨酸、激 素、胰島素、核糖核酸酶、血清白蛋白結(jié)合肽、能夠通過主動運輸或被動運輸穿過細胞膜的 蛋白質(zhì)的肽區(qū)域和其他分子。根據(jù)實施方案的用于siRNA遞送以影響RNAi的適當?shù)姆椒òㄍㄟ^其可將siRNA 引入細胞器、細胞、組織或生物體的任何方法，如本文中所描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知 的。此類方法包括但不限于，例如通過注射(包括顯微注射)進行的siRNA的直接遞送、電 穿孔、磷酸鈣沉淀、使用DEAE-葡聚糖然后使用聚乙二醇、直接的超聲加載(direct sonic loading)、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊、使用碳化硅纖維的攪動、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、PEG 介導的轉(zhuǎn)化、干燥/抑制介導的吸收(desiccation/inhibition-mediated uptake)等。通 過使用技術(shù)例如此類技術(shù)，可穩(wěn)定地或瞬時地轉(zhuǎn)化細胞器、細胞、組織或生物體。對于核酸 酶降解是穩(wěn)定的siRNA (本文中提供了其實施方案)特別適合用于直接注射，如實施例8的 數(shù)據(jù)所顯示的，其中血清穩(wěn)定的修飾形式化的siRNA以未修飾siRNA的400%的水平存在于 體內(nèi)。用于顯現(xiàn)或檢測siRNA的技術(shù)包括但不限于顯微鏡法、陣列、熒光測定法、light cycler或其他實時PCR儀、FACS分析、閃爍計數(shù)器、磷屏成像儀(phosphoimager)、Geiger 計數(shù)器、MRI、CAT、基于抗體的檢測方法(Western、免疫熒光、免疫組織化學)、組織化學技 術(shù)、HPLC、光譜法，質(zhì)譜法；放射學技術(shù)、毛細管凝膠電泳和質(zhì)量平衡技術(shù)。備選地，可標記核 酸或給核酸加標簽以允許它們有效分離。在本發(fā)明的其他實施方案中，對核酸進行生物素 化?！皹擞洝被颉皥蟾孀?r印orter)”是指允許檢測與其結(jié)合的物質(zhì)的部分或性質(zhì)。 可共價或非共價連接標記。標記的實例包括熒光標記(包括例如，猝滅劑或吸收劑)、比色標記(colorimetric label)、化學發(fā)光標記、生物發(fā)光標記，放射性標記、質(zhì)量修飾 (mass-modifying)基團、抗體、抗原、生物素、半抗原、酶(包括例如過氧化物酶、磷酸酶 等)等。熒光標記可包括帶負電荷的染料，例如熒光素家族的染料，包括例如FAM、HEX、 TET、JOE、NAN和Z0E ；或在電荷上是中性的染料例如羅丹明家族的染料，包括例如Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA ；或帶正電荷的染料，例如青色素家族的染料，包括例如Cy2、 Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G 和 TAMRA 可從例如 Perkin-Elmer，Inc. (ffellesley, MA)獲得；Texas Red 可從例如 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)獲得；以及 Cy2、Cy 3、Cy 3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7 可從例如 AmershamBiosciences Corp. (Piscataway,NJ)獲得。在某些實施方案中，熒光劑分子是熒 光素染料，猝滅劑分子是羅丹明染料。標記或報告子可包含熒光團和熒光猝滅劑。熒光猝滅劑可以是發(fā)熒光的熒光猝滅 劑例如熒光團TAMRA或不發(fā)熒光的熒光猝滅劑(NFQ)，例如，組合的NFQ-小溝結(jié)合劑(MGB) 例如由 Epoch Biosciences (Bothell,WA)提供并且與 TAQMAN 探針(Applied Biosystems, FosterCity, CA) 一起使用的MGB ECU PSE 小溝結(jié)合劑。熒光團可以是可被連接至核酸 的任何熒光團，例如，F(xiàn)AM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、Texas Red、ROX、R110、R6G、TAMRA、Cy2、 Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7 (如上文引用的)以及 VIC、NED、LIZ、ALEXA、Cy9 和 dR6G。標記的另外的實例包括黑洞猝滅劑(black hole quencher) (BHQ) (Biosearch)、 Iowa Black (DDT)、QSY 猝滅劑(Molecular Probes)以及 Dabsyl 和 Dabcel 磺酸酯(鹽)/ 羧酸酯(鹽)猝滅劑(Epoch)。標記還可包含熒光素染料的磺酸酯衍生物、熒光素的亞磷 酰胺形式、CY5的亞磷酰胺形式(可例如從Amersham獲得)、嵌入標記例如溴化乙錠以及 SYBR Green I 和 PIC0GREEN (Molecular Probes)。在不同實施方案中，熒光的檢測可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來進行， 并且可以是定性的或定量的?？梢岳缃柚跓晒庥嫬@得定量的結(jié)果。在一些實施方案 中，可使用微陣列和相關(guān)軟件例如使用Applied Biosystems 1700化學發(fā)光微陣列分析 儀的AppliedBiosystems Array System和其他可商購獲得的陣列系統(tǒng)(特別地，可從 Affymetrix,Agilent, 11 lumina和NimbleGen獲得的系統(tǒng))來進行檢測(也參見Gerry等 人，J.Mo 1. Biol. 292 :251-62，1999 ;De Bellis 等人，Minerva Biotec 14 :247_52，2002 ； 和 Stears 等人，Nat. Med. 9 140-45，包括補充材料，2003)。生物學可接受的載體是指提供適當?shù)姆栏饔?當需要時)，并且以均一的劑量 遞送一種或多種本文的實施方案的干擾RNA的載體。載體的類型可取決于siRNA是以固體、 液體還是氣溶膠的形式使用，以及取決于其對于施用途徑例如注射是否需要是無菌的?？?以將siRNA組合物以游離堿、中性或鹽形式配制入組合物。siRNA的鹽形式具有減少脫靶效 應并且維持抑制活性的特性(與本文中描述的siRNA相當)。鹽形式的實例包括有機酸加 成鹽和堿加成鹽?？梢砸钥稍诩毎麅?nèi)代謝成活性形式的前藥形式提供siRNA組合物；此類 前藥形式可包括保護基團例如S-乙酰硫代乙基(S-acetylthioethyl)或S_新戊酰硫代乙 基(S-pivaloylthioethyl)基團。在其中組合物以液體形式存在的實施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括 但不限于不含RNA酶的水、緩沖劑、鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二 醇等)、脂質(zhì)(例如，甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)、甘氨酸、可接受的防腐劑(例如，抗菌劑、
31抗真菌劑)、助溶劑(co-solvent)、表面活性劑、滲透促進劑(例如，crem印hor和TWEEN 80 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯(monolaureate)，Sigma Aldrich，St. Louis，Mo.))、 透明質(zhì)酸、甘露醇、氯化苯甲烴胺、粘度構(gòu)建劑(viscosity building agent)(例如，羥甲基 纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素)、包衣、表面活性 劑、抗氧化劑、等滲劑、吸收延遲劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、增甜劑、芳香劑、 染料和其組合。當期望時，通過將siRNA與上文列舉的各種其他成分一起摻入適當?shù)娜軇?然后過濾滅菌來制備無菌注射液。制劑包含與生物學可接受的載體混合的按重量計直至 99%的本文實施方案中的干擾RNA或其鹽?？梢砸匀芤?、懸浮液或乳劑的形式使用實施方 案中的干擾RNA。用于實施方案中的干擾RNA的可接受的載體包括基于脂質(zhì)的試劑siPORT NeoFX 轉(zhuǎn)染劑(Ambion Cat. #AM4510)、基于多胺的試劑siPORT Amine轉(zhuǎn)染劑 (Ambion Cat. #AM4502)、基于陽離子和中性脂質(zhì)的試劑siPORT Lipid轉(zhuǎn)染劑(Ambion Cat. #AM4504)、基于陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染劑Trails IT _TK0(Mirus Corporation,Madison, wis. )>Lipofectin ^ Lipofectamine > 01igofectamine (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)或 Dharmafect (Dharmacon，Lafayette, Colo.)、另外的多聚陽離子例如聚乙烯亞 胺、陽離子肽例如Tat、聚精氨酸或穿透蛋白(penetratin)、或脂質(zhì)體。例如，脂質(zhì)體可從標 準的形成小囊泡的脂質(zhì)和固醇例如膽固醇形成，并且可以包含靶向性分子例如具有對于細 胞表面抗原的結(jié)合親和力的單克隆抗體。此外，脂質(zhì)體可以是PEG化的脂質(zhì)體?？稍谌芤褐小腋∫褐谢蛏锟晌g解或生物不可蝕解遞送裝置中遞送干擾RNA?？?單獨地遞送干擾RNA或?qū)⑵渥鳛槔缗c聚乙二醇部分、膽固醇部分或與生長因子(用于受 體介導的內(nèi)吞作用)的確定的共價綴合物的組分來進行遞送。還可將干擾RNA與陽離子脂 質(zhì)、陽離子肽或陽離子聚合物復合；與具有核酸結(jié)合特性的蛋白質(zhì)、融合蛋白或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域(例如，魚精蛋白)復合；或封裝在納米顆?；蛑|(zhì)體中。可通過包含合適的靶向性部分 例如抗體或抗體片段來實現(xiàn)組織或細胞特異性遞送。除非其與siRNA不相容，否則本文中 的實施方案預期任何常規(guī)載體可用于組合物中或用作生物學載體。本文的實施方案中的干擾RNA可通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、損傷內(nèi) (intralesionally)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、心室內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰 道內(nèi)、子宮內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊泡內(nèi)(intravesicularlly)、 經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)(intr aumbilically)、眼內(nèi)、口服、局部(topically)、局部地 (locally)、吸入(例如，氣溶膠吸入)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接地局部灌注水浴靶細胞 (bathing targetcell)、通過導管、通過灌洗、在乳膏劑中、在脂質(zhì)組合物(例如，脂質(zhì)體) 中，或通過對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的其他方法或上述方法的任何組合來進行施用 (Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，Mack Publishing Co. 1990)。離體或體內(nèi)使用的劑量為0. 01 y g至lg/kg的體重，可每天、每周、每月或每年施 用一次或多次。通常，本文的實施方案中的具有修飾的核苷酸和修飾形式的干擾RNA的有 效量是這樣的量，其足以減少脫靶效應同時保持效力，并且在靶細胞表面上產(chǎn)生100pM至 1 y M，或InM至100nM，或2nM至大約25nM，或至大約10nM的細胞外濃度。獲得該局部濃度 所需的量可視許多因素(包括遞送方法、遞送位點、遞送位點與靶細胞或組織之間細胞層 的數(shù)目、遞送是局部的還是全身性的等)而變化。遞送位點上的濃度可以比靶細胞或組織的表面上的濃度高得多。制劑的pH為大約pH 4-9或pH 4. 5至pH 7. 4。在一些實施方案中，如下體外評估SiRNA抑制內(nèi)源靶基因表達水平的能力。使用 siPORT NeoFX 轉(zhuǎn)染劑(Ambion/Applied BiosystemsAustin, TX Ca t#AM4510)，利用廠 商描述的“反向”轉(zhuǎn)染方案轉(zhuǎn)染細胞。將未修飾對照或修飾形式化的siRNA涂板入96孔組 織培養(yǎng)板中以獲得例如InM或5nM的終濃度。將SiPORT NeoFX 轉(zhuǎn)染劑與siRNA復合，進 行至少10分鐘，然后將剛剛經(jīng)胰蛋白酶處理的細胞(大約4.0X103)覆蓋在siRNA/轉(zhuǎn)染 劑復合物上。將板在37°C下在組織培養(yǎng)條件下溫育48小時。 在收獲轉(zhuǎn)染的細胞后，按照廠商方案，使用MagMAX -96總RNA分離試劑盒 (Ambion, Inc. Austin TX Cat. #AM1830)分離總RNA。在50 μ 1不含核酸酶的水中洗脫 RNA。按照廠商方案，使用 HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc.，F(xiàn)oster City CA, Cat. #4368814)在 30 μ 1 反應體積中產(chǎn)生 cDNA。使用 2 μ 1 cDNA 在 10 μ 1 總 PCR 反應體積中進行TaqMan GeneExpression Assay (Applied Biosystems，Inc.，Cat. #4331182)。進行技術(shù)重復，計算每一個樣品的18S值。通過使用下 式計算ddCT來檢查預擴增的均一性ddCT = (siRNA 處理的 CtGQI_siRNA 處理的 Ct18s) - (Neg 對照 Ctroi-Neg 對照 Ct18s)GOI=內(nèi)源目的基因18S = 18S 核糖體 RNA 標準化者(normalizer)siRNA處理的=用siRNA處理的生物樣品Neg對照=用與任何已知的靶mRNA沒有同源性的siRNA處理的生物樣品使用下式計算剩余物的百分比剩余物％ = 100 X 2_(ddCT)。可以例如通過western印跡在轉(zhuǎn)染后大約72小時(實際時間取決于蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn) 率)估量靶蛋白質(zhì)水平。用于從培養(yǎng)的細胞分離RNA和/或蛋白質(zhì)的標準技術(shù)對于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是熟知的。用于顯現(xiàn)或檢測siRNA的技術(shù)包括上文中引述的那些?？蓸擞浐怂峄蚪o核酸加標 簽以使能夠有效地分離它們。因此，可通過許多本領(lǐng)域檢測方法中的任一個來研究任何給 定的siRNA的沉默能力?！霸噭┖小保绫疚闹兴褂玫?，是指用于在RNA干擾中減少脫靶效應的至少一些項 目的組合。試劑盒的實施方案包括例如至少一種在本文實施方案的修飾形式中具有修飾核 苷酸的siRNA。所述至少一種siRNA可以是定制的。在一些實施方案中，試劑盒包括與生 物學上可接受的載體例如緩沖劑一起的至少一種在修飾形式H、Q、V-2、Y、Y+1、JBl、JB2、JB 3、JB4或JB5中具有二環(huán)核苷酸的siRNA，和轉(zhuǎn)染劑或其他合適的遞送媒介物。試劑盒的實施方案還可包含靶向人、小鼠和大鼠的所有細胞類型中的持家基因的 已驗證的陽性對照siRNA。試劑盒的實施方案還可包括已驗證的陰性對照siRNA(其為非靶 向性的)。siRNA對照可以預先進行涂板，并且可用可檢測標志物進行標記。試劑盒的實施方案還可包括用于估量期望的靶基因的抑制的試劑，例如用于通過 免疫熒光或Western分析在蛋白質(zhì)水平上監(jiān)測抑制的抗體、用于估量酶促活性或報告蛋白 的存在的試劑或用于估量細胞活力的試劑?？砂≧T-PCR引物和探針以檢測靶或報告子 的mRNA。試劑盒的實施方案還可包含RNA酶抑制劑。
試劑盒的容器工具(container means)通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他包裝工具，可將組分置于所述容器中，以及在一些實施方案中，將組分適 當?shù)氐确钟谒鋈萜髦?。在試劑盒中包括一種以上的組分(可將它們包裝在一起)的情況 下，試劑盒通常還將包括至少一個可將另外的組分單獨置于其中的第二、第三或其他另外 的容器。然而，可將組分的不同組合包裝在容器工具中。本教導的試劑盒還通常包括用于 包含在本文所示的修飾形式中具有修飾核苷酸的siRNA的工具和密閉的任何其他試劑容 器(用于商業(yè)銷售)。此類容器可包括將期望的容器工具保留在其中的注射或吹塑塑料容 器。當以一種和/或多種液體溶液的形式提供試劑盒的組分時，液體溶液包括可以是無菌 水溶液的水溶液。在某些實施方案中，將至少一種試劑盒組分凍干并且以干粉的形式提供。當以干 粉的形式提供試劑和/或組分時，可通過加入合適的溶劑來重構(gòu)粉劑。在某些實施方案中， 在另一個容器工具中提供溶劑。試劑盒還可包括用于裝無菌的生物學上可接受的緩沖劑和 /或其他稀釋劑的另外的容器工具。試劑盒還可包括使用試劑盒組分以及使用未包括在試劑盒中的任何其他試劑的 說明書。說明書可包括可以執(zhí)行的變化。本方法和試劑盒的實施方案可用于高容量篩選(high volumescreening) 0可使 用本文中的實施方案構(gòu)建siRNA或候選siRNA的文庫。然后可將文庫用于高通量測定，包 括微陣列。特別預期的是基于芯片的核酸技術(shù)，其包括用于快速和精確地分析大量基因的 定量方法。通過使用固定的探針陣列，可以以高密度陣列的方式將芯片技術(shù)用于分離靶分 子并且基于雜交篩選這些分子。術(shù)語“陣列”，如本文中使用的，是指核酸的系統(tǒng)性排列。例 如，將代表期望的來源(例如，人成年大腦)的核酸群體劃分入最小數(shù)目的庫(其中可使用 期望的篩選方法檢測或耗盡靶基因以及其可分配入單個多孔板)。陣列可以是可從期望的 mRNA來源獲得的核酸群體的水性懸浮液的陣列，包括包含多個單獨的孔的多孔板，各單 獨的孔包含核酸群體的不同內(nèi)容物的水性懸浮液。陣列、其用途和其實施的實例可見于美 國專利 6，329，209,6, 329，140,6, 324，479,6, 322，971,6, 316，193,6,309，823,5,412，087、 5，445，934和5，744，305，其通過引用合并入本文。微陣列在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且由表面(序列上相應于基因產(chǎn)物(例如，cDNA、 mRNA、cRNA、多肽和其片段)的探針在已知的位置上與其特異性雜交或結(jié)合)組成。在一個 實施方案中，微陣列是其中各位點代表分開的由基因編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或RNA)的結(jié) 合位點，且其中結(jié)合位點針對生物體基因組中大部分或幾乎所有基因的產(chǎn)物的陣列(即， 矩陣)。在優(yōu)選實施方案中，“結(jié)合位點”是特定的相關(guān)cDNA可與其特異性雜交的核酸或 核酸類似物。結(jié)合位點的核酸或類似物可以是例如合成的寡聚物、全長cDNA、比全長短的 cDNA或基因片段。固體支持物可由玻璃、塑料(例如，聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維素或其 他材料制造。用于將核酸附著至表面的示例性方法包括在玻璃板上進行印制或通過掩蔽 (masking)。原則上，可使用任何類型的陣列，例如尼龍雜交膜上的斑點印跡，然而，如本領(lǐng) 域技術(shù)人員所公認的，非常小的陣列是優(yōu)選的，因為雜交體積將更小。根據(jù)下列實施例可進一步理解本教導的實施方案，所述實施例不應當解釋為以任 何方式限定本教導的范圍。
實施例1siRNA修飾形式 按照 Beaucage, S. L.禾口 Iyer，R. P. (Tet rahedron, 1993(49)6123 ；Tetrahedron, 1992(48)2223)，使用標準的基于亞磷酰胺的核苷單體和已建立的固相寡聚循環(huán)來化學合 tt RNA (siRNA) 。 $ BioAutomation MerMade 192 ☆ j^ft (BioAutomation Corp, Piano,TX)上進行寡核苷酸的合成。將活化劑的8個等價物用于LNA 亞磷酰胺的每一個 等價物以提供大于98% (每堿基加入)的令人滿意的逐步偶聯(lián)得率。使用一次性反相純化 筒或離子交換HPLC進行單個siRNA鏈的純化。凝膠電泳用于確定退火樣品的單鏈對雙鏈 的結(jié)構(gòu)，離子交換HPLC用于測定單鏈的純度，MALDI質(zhì)譜法用于測定單鏈身份，UV光譜法用 于定量測定單鏈寡核苷酸和siRNA。各siRNA的引導鏈和過客鏈的長度都為21個核苷酸， 每一個siRNA經(jīng)設計在兩個3'末端上都具有兩個堿基的懸突。各引導(反義)鏈的位點 1經(jīng)設計為“A核苷酸”或“U核苷酸”。當將胞嘧啶(C)核苷修飾為二環(huán)糖時，經(jīng)取代的核 堿基為5-甲基化胞嘧啶殘基。當尿嘧啶(U)核苷被修飾為二環(huán)糖時，經(jīng)取代的核堿基為胞 腺嘧啶(T)殘基。懸突核苷酸如圖IA至圖IK中所述，并且(獨立地)是脫氧核苷酸、修 飾的核苷酸或核糖核苷酸。在形式“O”的情況下，對引導鏈進行化學磷酸化。合成所有其 他3'末端和5'末端以包含羥基。引入siRNA分子的修飾的核苷酸包括鎖核酸(LNA 殘基)，特別是具有上述結(jié) 構(gòu)(a)的那些，其中Rl為0，R2為0，R 3為CH2 ；2' -0-甲基核苷酸衍生物；和2' -5' 連接的核苷酸。LNA amidites 購自 Proligo (Boulder，CO)和 Exiqon A/S(Vedbaek, Denmark) ,2 ‘ -O-甲基核苷酸衍生物以及3 ‘-和2 ‘ -TBDMS RNA amidite s購自 ChemgenesCorporation(Wilmington, ΜΑ)。引入siRNA的修飾形式包括圖IA (除了未修飾對照形式A以外，形式Ε、F、G、H、 J、K和0)、圖讓(形式1!1(重復的)、!1(-1)、!1(-2)、!1(+1)和Q)、圖IC(形式M(重復的)、 H(重復的)V、V(_1)、V(_2)、V(+1))、圖 ID(形式 W、W+1、W-1、Y、Y-1 和 Y+l)、圖 IE(形式 JB 1、JB2、JB 3、JB4和JB5)中所示的那些以及實施例7中進一步描述的圖IF至圖IK中所示 的那些。修飾形式包括只在過客(有義)鏈上的修飾(形式E、H、K、M、H-1、H_2、H+1、Q、V、 V-1、V-2、V+1、W、W+1、W-1、Y、Y-1、Y+1、JB1、JB2、JB3、JB4、JB5、DH3、DH30 和 DH28 (關(guān)于 DH 形式，參見實施例7))或在引導(反義)鏈和過客(有義)鏈上的修飾(形式F、G、J、0以 及除了 DH3、DH30和DH28外的所有DH形式(關(guān)于DH形式，參見實施例7))。下面進一步 描述圖IA至圖IE的修飾形式。形式修飾位點(從各鏈的5'末端開始編號)過客序列引導序列A，對照 無無E1,20,21無F1,20,2120，21G1，2，13，14 9，10，19，20H1，2，13，14 無J1,2,10,14 11,12,19,20
K1，2，10，14 無01,2 2+5'磷酸M1,2 無
H(-l)1，2，12，13 無H(-2)1,2,11,12 無H(+l)1，2，14，15 無Q13，14 無V1，2，12，14 無V(-l)1,2,11,13 無V(-2)1，2，10，12 無V(+l)1,2,13,15 無W2，3，13，14 無W+12，3，14，15 無W-I2，3，12，13 無Y1，3，13，14 無Y-I 1，3，12，13無Y+1 1，3，14，15無JBl 1,2,14無JB2 1,13,14無JB3 1，2，3，4，13，14 無JB4 1,2,3,13,15 無JB5 1,2,3,13,14 無之前Mook等人(Molecular Cancer Therapeut ics March，20076 :3，833—843) 艮 導了形式F。之前E 1 men等人(Nucleic Acids ResearchJanuary 14,2005. 33 1,439-447) 報導了形式 E 和 F。Jackson 等人(RNA May 8，200612 :71197_1205)描述了形式 0。實施例2SiRNA沉默效應的測定方法如下測定由給定的SiRNA的引導(反義)鏈和過客(有義)鏈介導的對外源提供 的基因的切割活性。使用DNA連接酶和標準克隆技術(shù)將來自目的基因(GOI)的cDNA片段以 正向或反向(相對于基因DNA的編碼鏈的方向)克隆入pMIR-REPORT miRNA表達報告載 體系統(tǒng)(Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat#AM5795)。對于下列 G0I，全長 cDNA 克隆購自 Open Biosystems (Huntsville, AL)。基因ID符號 描述983CDC2 細胞分裂周期21017CDK2 細胞周期蛋白依賴性激酶2701BUBlB 不受苯并咪唑1同源物β抑制的BUB1 出芽2222FDFTl 法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶13156HMGCR 3_羥基_2甲基戊二?；?輔酶A還原酶
7456 WEElWEEl 同源物(裂殖酵母(S. pombe))5347 PLKlPolo 樣激酶 11213 CLTC網(wǎng)格蛋白，重鏈(He) 836 CASP3胱天蛋白酶3，細胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶595 CCNDl細胞周期蛋白Dl1595 CYP51A1 細胞色素P450，家族51，亞家族A，多肽 1GOI編碼序列的長度的大小范圍在1. 2kb至大于6kb。將來自各GOI的cDNA片段 單獨地亞克隆入pMIR-REPORT miRNA表達報告載體的HindIII (核苷酸位點463)/SpeI (核 苷酸位點525)多克隆位點，所述載體包含在哺乳動物啟動子/終止子系統(tǒng)的控制下的螢火 蟲螢光素酶報告蛋白，如圖2A中所顯示的。標準的基于PCR的技術(shù)用于對HindIII和SpeI 限制性內(nèi)切核酸酶位點進行工程改造。產(chǎn)生表達mRNA轉(zhuǎn)錄物的報告載體，所述mRNA轉(zhuǎn)錄 物包含以正向或反向(相對于fLucmRNA，如圖3A和圖3B中所示的)融合至GOI的mRNA 的螢光素酶mRNA。fLuc-GOI融合mRNA在位于最靠近fLuc編碼序列的5’起始位點的CMV 啟動子的控制下表達。當將報告構(gòu)建體和與fLuc或cDNA GOI互補的siRNA共轉(zhuǎn)染入細胞 時，通過測量剩余的螢光素酶蛋白或通過剩余的fLuc-GOI融合mRNA來監(jiān)控作為RNA干擾 的結(jié)果的抑制。將來自各GOI的各方向的所有亞克隆片段的5'和3'末端500個核苷酸 經(jīng)歷核苷酸序列分析以確認載體內(nèi)包含的cDNA的身份和方向。因此，這些載體用作用于監(jiān) 控由引導鏈(正向克隆)或過客鏈(反向克隆)介導的siRNA切割的底物來源。按照廠商的方案，使用圖2B中描述的pMIR-REPORT β -半乳糖苷酶報告對照 載 體(Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat##AM5795)標準化轉(zhuǎn)染效率。β-gal 編 碼序列在CMV啟動子的控制下表達。將獲自fLuc報告基因的信號除以獲自各自的β-gal 報告基因的信號以計算各測定的標準化的螢光素酶活性。轉(zhuǎn)染將Hela 細胞(ATCC No. CCL-2，Manassas, VA)以大約 8. OXlO3 個細胞 / 孔 的密度涂板在96孔組織培養(yǎng)板中。24小時后，使用標準轉(zhuǎn)染方案，用siPORT Amine轉(zhuǎn) 染劑(Ambion/Applied BiosystemsAustin, TX Cat#AM4502)以及終濃度 30nM 的待研究的 siRNA、40ngpMIR-REP0RT 螢光素酶-GOI質(zhì)粒和4ng pMIR-REPORT 轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細 胞。轉(zhuǎn)染后24小時用完全培養(yǎng)基清洗細胞，在轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞以進行分析。對于每 一種質(zhì)粒對各個待研究的siRNA進行3個生物學重復實驗。平行地，為了計算由測試siRNA 的過客鏈和引導鏈產(chǎn)生的mRNA抑制的百分比，在相同的實驗條件下轉(zhuǎn)染Silencer 陰 性對照 siRNA (Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat#AM4636)以測量使用非靴向性 siRNA的表達的基線水平。Dual-Light 組合報告基因測定系統(tǒng)按照廠商推薦的方案，將Applied Biosystems Dual-Light 組合報告基因測定系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City CA Cat#T1003)用于同時檢測相同樣品中的螢光素酶和β-gal。使用BMG LABTECH POLARstar Optima 讀數(shù)器(BMG LABTECH, Durham, NC)進行發(fā)光讀數(shù)。在Dual- Light 測定系統(tǒng)中在加入熒光素底物后2至5秒進行螢光素酶測定。 在加入底物以進行半乳糖苷酶的檢測和測量之前，使板靜置至少45分鐘。使用適當?shù)摩?-gal讀數(shù)標準化各孔以獲得螢光素酶信號/β -gal信號的比。然后通過針對陰性對照 siRNA轉(zhuǎn)染的細胞標準化生物學樣品來計算抑制或剩余的螢光素酶表達％。實施例3SiRNA修飾形式的沉默效應可進行鏈轉(zhuǎn)換(Stra
nd-Switch)為了進行該研究，對于3個外源提供的靶mRNA中的每一個，以未修飾形式A和8 種不同測試修飾形式(E、F、G、H、J、K、M*0)中的每一種形式合成2個siRNA。因此，各測 試形式提供了 6個siRNA的數(shù)據(jù)。對于圖4A至圖4E的數(shù)據(jù)，由形式字母指定的并且參照 圖IA和圖IB的位點上的修飾核苷酸“m”是具有上述結(jié)構(gòu)(a)的LNA 殘基，其中Rl是0， R2是0，以及R3是CH2。通過實驗確定圖4A舉例說明的選擇用于本研究的siRNA序列對兩 條鏈的部分都具有鏈沉默活性。這樣的集合允許分析修飾具有的對引入鏈偏向性(即，削 弱一條鏈的沉默活性同時保持另一鏈的活性的能力)的影響。對于該siRNA集合，顯示了 由未修飾引導鏈介導的螢光素酶-GOI mRNA的平均大約70%的抑制，顯示了由未修飾過客 鏈介導的螢光素酶-GOI mRNA的平均大約58%的抑制(圖4A，形式A)。將在進行未修飾形式A和各測試修飾形式(E、F、G、H、J、K、M和0)的RNAi研究 后存在的標準化的報告蛋白的量繪制于圖4A中。深色條塊表示由于引導鏈產(chǎn)生的沉默導 致的剩余活性％，因為數(shù)據(jù)由具有正向定向的GOI的克隆產(chǎn)生。圖4A的淺色條塊表示由于 過客鏈的沉默而導致的剩余活性％，因為數(shù)據(jù)由具有反向定向的GOI的克隆產(chǎn)生。通過混 雜的(無義)siRNA的平行轉(zhuǎn)染進行標準化，所述混雜的siRNA的轉(zhuǎn)染導致兩條鏈的少量抑 制。該信號減少(大約20%)導致報告蛋白的明顯增加(對于所有標準化的結(jié)果)，因為 標準化基于無義siRNA的陰性值。該明顯增加對于修飾靶E、F、G、H、J、K、M和0的過客鏈 數(shù)據(jù)最為明顯。該模型報告系統(tǒng)用于檢測過客鏈和引導鏈的活性的變化。圖4A的數(shù)據(jù)顯示具有修飾形式E、F、H、K、M和0的siRNA的引導(反義)鏈獲得 基本上與對照形式A引導鏈相同的沉默活性。在修飾形式G和J存在的情況下，siRNA的 引導鏈沉默它們的靶的能力降低，在形式J的情況下，siRNA的引導鏈沉默它們的靶的能力 降低至低于20%的平均抑制活性。雖然大部分圖4A描述的修飾形式提供了與未修飾對照引導鏈相似的引導(反義) 鏈介導的切割，但所有測試修飾形式嚴重地削弱了過客鏈沉默它們的靶的能力，從而基本 上使過客鏈失去干擾活性。為了進一步檢查修飾形式對鏈活性的影響，將該用于鏈型測定的SiRNA的組擴展 至包括另外18種siRNA。圖4B至圖4E的數(shù)據(jù)以箱線圖形式(也稱為箱須圖)提供了更大 的siRNA集合的測定結(jié)果。對于各圖，深色水平條表示各修飾形式的數(shù)據(jù)集的中值。箱表 示數(shù)據(jù)在各修飾形式的數(shù)據(jù)集的下四分位數(shù)和上四分位數(shù)上的分布，而虛線(須)表示各 修飾形式的數(shù)據(jù)集的最小和最大值。圓圈表示各修飾形式的數(shù)據(jù)集中可能的異常值。圖4B提供了在該更大的siRNA組的siRNA轉(zhuǎn)染入Hela細胞后過客鏈的活性。使 用下式計算活性P(過客鏈的活性)=(來自用測試siRNA處理的反向克隆的剩余fLUC β -gal活性)/ (來自用Neg對照siRNA處理的反向克隆的剩余fLUC β -gal活性)。圖4B 的數(shù)據(jù)顯示修飾的siRNA形式的過客鏈的活性喪失，如通過中值過客鏈抑制活性的向上偏 移所看到的(與形式A的抑制活性相比)。修飾形式G、H、J、K、M和0的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上是 顯著的(P < 0. 05)，從而證明修飾形式在降低過客鏈的活性上是有效的。
圖4C提供了在圖4B中分析的siRNA組轉(zhuǎn)染Hela細胞后引導鏈的活性。使用下式 計算活性G(引導鏈的活性)=(來自用測試siRNA處理的正向克隆的剩余fLUC β-gal 活性)/(來自用Neg對照siRNA/處理的正向克隆的剩余fLUC β -gal活性)。形式Ε、F、 Η、Μ和0對引導鏈的活性沒有負影響(即，“無害”)。形式E似乎以統(tǒng)計學上顯著的方式增 加引導鏈減少螢光素酶信號的能力，如中值引導鏈活性的向下偏移所表明的(與未修飾形 式A相比)。修飾形式G、J和K降低引導鏈的活性，如此類形式的中值的向上偏移所證明 的(ρ < 0. 05)(與形式A的未修飾siRNA相比)。表4D的數(shù)據(jù)提供了使用下式獲得的圖4Β和圖4C的過客鏈與引導鏈之間的fLUC 活性差異活性差異=P-G(使用上文所示的P和G的定義)。因為fLUC報告測定測量細胞 中siRNA轉(zhuǎn)染后的螢火蟲螢光素酶的活性的量，因此更具活性的siRNA鏈抑制更多的fLUC 報告基因mRNA，且導致更低的螢光素酶活性的相對量。因此，如果過客鏈的活性低于引導 鏈，則該活性差異計算的值將大于0。如果過客鏈的活性大于引導鏈，則所述值將小于0。修 飾形式J減少測試siRNA的兩條鏈之間的活性差異。圖4E的數(shù)據(jù)提供了圖4B和圖4C的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性的倍數(shù) 變化。使用上文所示的P和G的定義，將活性倍數(shù)變化計算為log2(P)-log2(G)。O值描述 了各鏈具有相等沉默能力的siRNA?；钚员稊?shù)變化越大，siRNA的引導鏈偏向性越大。圖 4E的箱線圖的比較顯示，與對照未修飾siRNA形式A的鏈偏向性相比，修飾形式E、H、M和 0的過客鏈與引導鏈之間的鏈偏向性顯著增加(p<0.05)。因此，具有修飾形式Ε、H、M和 0的siRNA，與未修飾形式A相比，展示增加的鏈型。形式G、J和K顯示過客鏈和引導鏈之 間更低的倍數(shù)差異，但只有形式J顯著減小活性的倍數(shù)變化(與形式A相比)。形式H顯示 了最大的單獨的鏈偏向性。對于各修飾形式，通過鏈轉(zhuǎn)換(SW)修飾形式(從過客鏈至引導鏈以及從引導鏈至 過客鏈)來進行研究以檢測修飾形式影響高效力siRNA鏈的沉默活性的能力。S卩，例如，對 于圖5A的修飾形式Fsw，將形式F在過客(有義)鏈的位點1、20和21上的修飾(圖1A)引 入引導(反義)鏈，將形式F在引導(反義)鏈的位點20和21上的修飾(圖1A)引入過 客(有義)鏈。圖5A的數(shù)據(jù)提供了鏈測定的結(jié)果，其中對于具有未修飾siRNA形式A的12個 siRNA和具有轉(zhuǎn)換的鏈修飾(與圖4A的那些相比較)的相同的12個siRNA，將進行RNAi 研究后存在的標準化的報告蛋白的量作圖。圖5A數(shù)據(jù)所研究的siRNA的組與圖4A數(shù)據(jù)所 研究的組相異在于圖5A數(shù)據(jù)的siRNA具有鏈偏向性，如由未修飾形式A siRNA的引導鏈與 過客鏈之間剩余的fLUC信號的百分比的巨大差異所證明的。用于在該“鏈轉(zhuǎn)換”測定中測 量抑制的實驗條件與用于產(chǎn)生圖4A的數(shù)據(jù)的實驗條件相同。如圖5A的數(shù)據(jù)所提供的，引導鏈的沉默活性由于鏈轉(zhuǎn)換修飾而顯著降低。具有鏈 轉(zhuǎn)換的修飾形式的引導鏈獲得平均低于20%的抑制。對于該siRNA集合，鏈轉(zhuǎn)換的修飾形 式Hsw是使引導(反義)鏈失活的最有效修飾形式之一。具有鏈轉(zhuǎn)換的修飾形式的測試過客鏈提供了可變結(jié)果。然而，具有鏈轉(zhuǎn)換的修飾 形式的所有測試過客鏈在抑制上比圖5A中的未修飾siRNA形式A中的過客鏈更有效。然 而不希望受理論束縛，作為削弱引導鏈 的效力的結(jié)果，過客鏈的效力很可能間接或繼發(fā)地 被增強，如由鏈轉(zhuǎn)換修飾形式中的過客鏈獲得的增強的抑制所表明的。
圖5B以箱線圖的形式提供了圖5A的數(shù)據(jù)，所述形式如上文對于圖4D描述的。因此，如果過客鏈的活性低于引導鏈的活性，則預期差異將大于0，這通過修飾形式A來證明， 對于該修飾形式，該siRNA集合的中值活性差異為大約0. 65。鏈轉(zhuǎn)換的修飾形式具有小于 0的差異活性，表明形式HSW、MSW、FSW、ESW和Osw使鏈型發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而有利于過客鏈而非引導 鏈(與未修飾形式A相比)。對于鏈轉(zhuǎn)換的修飾形式Msw(其具有大約-0.5的中值活性差 異)觀察到最大的鏈型增強。在圖5C中，對于各修飾形式，提供了圖5B的siRNA的過客鏈與引導鏈之間的活性 的倍數(shù)變化(10&(P)-10&(G))。這些結(jié)果表明賦予引導鏈抑制活性并且基本上使過客鏈 失活的修飾形式，當進行鏈轉(zhuǎn)換時，可降低引導鏈的抑制活性并且增加過客鏈的抑制活性。 使用不同的修飾形式進行與圖4A和圖4D的研究(使用LNA 修飾核苷酸)相似的研究， 其中修飾的核苷酸被2' -0甲基化。為了進行該研究，對于3個靶mRNA中的每一個，以未 修飾形式A和各測試形式合成2個siRNA。因此，各測試形式提供了 6個siRNA的數(shù)據(jù)。如 圖4A的研究一樣，選擇用于該研究的特定siRNA序列是其未修飾形式AsiRNA的兩條鏈都 顯示沉默作用的siRNA。未修飾siRNA的引導(反義)鏈平均使靶mRNA減少70%，而過客 (有義)鏈使靶mRNA減少55 %。關(guān)于過客(有義)鏈的活性，圖6A的數(shù)據(jù)顯示，在與siRNA于培養(yǎng)物中溫育48小 時后，基本上所有mRNA產(chǎn)物可獲得用于螢光素酶測定。即，具有其中修飾的核苷酸被2' -0 甲基化的修飾形式的測試siRNA顯示了過客(有義)鏈的效力的顯著喪失，如這些樣品中 剩余基因表達％的增加所表明的。該過客鏈的抑制功能的失活與使用LNA 修飾核苷酸的 修飾形式的數(shù)據(jù)相符。還與LNA 修飾形式H、K和0的數(shù)據(jù)相符，與未修飾對照形式A相 比，具有擁有2' -0-甲基核苷酸的修飾形式H、K和0的引導鏈的效力基本上未改變。因 此，具有2' -0-甲基修飾的核苷酸的修飾形式似乎在這些鏈測定(對于所述測定，外源提 供了靶)中對于保持引導(反義)鏈的活性同時使過客(有義)鏈的切割活性失活是同樣 有效的。圖6B以箱線圖的形式提供了圖6A研究的siRNA (6siRNA)和另外18個siRNA序 列的數(shù)據(jù)。形式A的組的活性差異顯示大部分siRNA偏向于引導鏈(由大約0. 5的中值所 表明)。然而，與對照形式A相比，在指定的修飾形式中具有2' OMe的siRNA顯示過客鏈 與引導鏈之間的更大的差異。形式H和H+1誘導最大的鏈間差異。具有2' -OMe修飾堿基 的形式0不能增加鏈間的活性差異。圖6C中提供了過客鏈與引導鏈相比較的活性倍數(shù)變化，如之前所述進行計算。倍 數(shù)變化分析顯示與形式A的未修飾siRNA相比，形式H提供了最大的倍數(shù)變化。然而，對于 形式H-1、H、H+UV-2和K但非形式0，也觀察到鏈間活性的顯著倍數(shù)變化，如圖6C的附圖 說明中引用的Wi 1 coxon值確定的。在不同的修飾形式中研究了第三個類型的修飾核苷酸。圖7A提供了其中修飾形 式的修飾核苷酸是2' ,5'-連接的核苷酸的鏈測定的結(jié)果。對于未修飾形式A和測試形 式H-I、H、H+1、V-2、K和0，將來自以正向和反向克隆的GOI的pMIR-REPORT 研究的fLuc 信號的活性差異(從而表示引導鏈與過客鏈的功效和抑制活性的差異)作圖。未修飾對照 形式A的鏈型結(jié)果與含有2' ,5'-連接的堿基的測試形式的結(jié)果的比較表明，除了形式0 夕卜，通過包含2' ,5'-連接的堿基修飾未獲得siRNA的鏈型的統(tǒng)計學上顯著的變化。具有2' -5'-連接的堿基修飾的形式O減小了活性差異，從而表明引導鏈的抑制活性以統(tǒng) 計學上顯著的方式喪失。圖7B提供過客鏈與引導鏈之間的活性倍數(shù)變化(如之前所述進行計算)。倍數(shù) 變化分析顯示含有2' -5'連接的核酸的形式0在負方向上影響siRNA的鏈型，如過客鏈 與引導鏈之間的活性倍數(shù)變化的減少表明的。此外，來自以形式H-1、H+1、V-2和K存在的 2' -5'連接的核酸的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上是不顯著的，從而，這些形式不適合于提高siRNA的 鏈型。只有用2' -5'堿基修飾修飾的形式H顯示鏈型的統(tǒng)計學上顯著的增加，如圖7B的


中引用的Wi 1 coxon值所顯示的?；趫D4A和圖6A的數(shù)據(jù)，關(guān)于引導鏈對過客鏈的切割活性的差異的統(tǒng)計學分析 顯示鏈偏向 性的最大變化由修飾形式H中的LNA 和2' OMe修飾的核苷酸引入。鏈型 分析還顯示形式G、形式J和形式K以統(tǒng)計學上顯著的方式降低了引導鏈的活性，從而之后 不再考慮將它們用于增強siRNA特異性。具有LNA 修飾核苷酸的形式H誘導了引導鏈高 于過客鏈的切割活性的平均8倍的差異，如圖4A的數(shù)據(jù)所證明的。相比之下，未修飾對照 形式A顯示引導鏈高于過客鏈的平均4倍的增加的活性。因此，形式H修飾使通常存在于 最佳設計的siRNA中的鏈偏向性加倍。此外，這些數(shù)據(jù)證明具有LNA 修飾殘基的鏈轉(zhuǎn)換的形式能夠與它們使過客鏈失 活一樣有效地使引導鏈失活。圖12A-1和圖12A-2的數(shù)據(jù)表示在指定的形式中包含LNA⑩修飾核苷酸的12個 siRNA的抑制活性。測試組的鏈型表明大部分siRNA不對稱地偏向具有更高活性的引導 鏈(圖12A-1的形式A的0. 5的中值活性差異所表明的)。然而，產(chǎn)生的具有修飾形式和 LNA 殘基的siRNA顯示了與未修飾形式A相比，更大的過客鏈與引導鏈活性之間的差異。 形式H修飾形式以統(tǒng)計學上顯著的方式增加了鏈間的活性差異，但活性倍數(shù)變化不顯著， 如圖12A-2的數(shù)據(jù)所顯示的。圖13A-1和圖13A-2的數(shù)據(jù)表示在指定的形式中含有2 ‘ OMe修飾的核苷酸的 siRNA。測試組的鏈型表明大部分siRNA不對稱地偏向具有更高活性的引導鏈，如圖13A-1 的0. 5的中值活性差異表明的。然而，產(chǎn)生的具有2' OMe修飾的核苷酸的siRNA顯示了與 未修飾對照形式A相比，更大的過客鏈與引導鏈之間的倍數(shù)變化，如圖13A-2所顯示的。形 式H、K和V-2誘導了最大的且統(tǒng)計學上顯著的鏈間倍數(shù)變化(ρ <0.05)。除了形式0以 夕卜，所有形式的數(shù)據(jù)與未修飾siRNA相比，在統(tǒng)計學上都是顯著的。實施例4siRNA修飾形式對內(nèi)源基因的沉默的效應檢測修飾形式化的siRNA對內(nèi)源基因的沉默，以確定修飾形式是否改變siRNA抑 制其mRNA靶的功效。為了進行該研究，通過以低濃度將修飾形式化的siRNA轉(zhuǎn)染入Hela 細胞(ATCC No. CCL-2, Manassas, VA)、U20S 細胞(人骨肉瘤細胞系，ATCC No. HTB-96)和 HUH7 細胞(人肝細胞瘤細胞系，#JCRB 0403，Japanese Cancer Research ResourceBank, Tokyo, Japan)來檢測內(nèi)源基因的抑制。本文中論述了 Hela細胞的數(shù)據(jù)。使用廠商描述的“反向”轉(zhuǎn)染方案，利用SiP0RTTMNeoFXTM轉(zhuǎn)染劑(Ambion/Applied Biosystems Austin, TX Cat#AM4510)轉(zhuǎn)染Hela細胞。將未修飾對照或修飾形式化的siRNA 涂板至96-孔組織培養(yǎng)板中以獲得InM或5nM的終濃度。將SiP0RTTMNeoFXTM轉(zhuǎn)染劑與siRNA復合，進行至少10分鐘，然后將剛剛經(jīng)胰蛋白酶處理的Hela細胞(大約4. 0 X 103個細胞) 覆蓋在siRNA/轉(zhuǎn)染劑復合物上。將板在37°C下于組織培養(yǎng)條件下溫育48小時。使用廠商描述的“正向”轉(zhuǎn)染方案，利用HyPerFeC t 轉(zhuǎn)染劑(Qiagen， Gaithersberg，MD)轉(zhuǎn)染U20S細胞。將未修飾對照或修飾形式化的siRNA涂板至96-孔組 織培養(yǎng)板中以獲得3nM或30nM的終濃度。將HyPerFeC t 轉(zhuǎn)染劑與siRNA復合，進行 至少10分鐘，然后將復合物加入培養(yǎng)中的U20S細胞(大約4.0X103個細胞)中。將板在 37°C下于組織培養(yǎng)條件下溫育48小時。在收獲轉(zhuǎn)染的細胞后，按照廠商的方案使用MagMAX -96總RNA分離試劑盒 (Ambion, Inc. Austin TX Cat. #AM1830)分離總 RNA。將 RNA 洗脫在 50 ii 1 不含核酸 酶的水中。按照廠商的方案，在30iU反應體積中使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosys terns, Inc. Fos ter City CA, Cat. #4368814)產(chǎn)生 cDNA。在 10 i! 1 的總 PCR 反應體積中使用 2 u 1 cDNA 進行TaqMan Gene Expression Assays (App lied Biosystems, Inc.，Cat. #4331182)。進行技術(shù)重復，計算各樣品的 18S 值。通過使用上述公式計算ddCT來檢查預擴增的均一性。使用下列公式計算剩余% 剩余％ = 100 X 2_(ddCT)。使用下列公式計算mRNA抑制的分數(shù)mRNA 抑制的分數(shù)=l_(2_(ddCT))和mRNA抑制％ = mRNA抑制的分數(shù)*100。為了進行該抑制研究，針對8個內(nèi)源靶mRNA中的每一個，以未修飾形式A和8個 測試修飾形式E、F、G、H、J、K、M和0中的每一個形式合成6個siRNA。從而，各測試形式提 供了 48個siRNA的數(shù)據(jù)。關(guān)于圖8的數(shù)據(jù)，由形式字母指定的并且參照圖1A至圖1C的位 點上的修飾核苷酸“m”是具有上述結(jié)構(gòu)(a)的LNA 殘基，其中R1是0，R2是0，并且R 3
CH2 。圖8提供了關(guān)于5nM終濃度的修飾形式化的siRNA在Hela細胞中沉默內(nèi)源mRNA 靶以及在轉(zhuǎn)染后48小時使用TaqMan GeneExpression Assays測定靶的抑制％的數(shù)據(jù)。 這些研究的結(jié)果顯示與對于未修飾形式A的組觀察到的抑制活性相比，在形式G、J和K中 包含的修飾形式化的siRNA削弱了 siRNA的抑制活性，然而在形式E、F、H、M和0中 包含LNA 的修飾形式化的SiRNA保持或增加了抑制活性。因此，在不同位點上具有LNA 殘基的幾種修飾形式不負面影響SiRNA的抑制活性，但足以增強引導鏈對過客鏈的鏈型。 還在人肝細胞瘤細胞(HUH7)和人骨肉瘤細胞(U20S)中測定了該LNA 修飾的siRNA的集 合中siRNA的抑制活性。在這些細胞系中，通過考慮不同的轉(zhuǎn)染效率，各修飾形式的LNA 修飾的siRNA展示了與在HeLa細胞中觀察到的抑制活性相似的抑制活性(數(shù)據(jù)未顯示)。 因此，沉默性能不受使用的細胞系的類型影響。圖12B提供了關(guān)于使用LNA 修飾核苷酸的修飾形式H、H-2、H-1、H+1、Q、K、V、V_1 和V-2的另外的抑制活性數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集表示靶向4個不同內(nèi)源mRNA靶的24個不同的 siRNA。以各形式合成24個siRNA中的每一個，同樣地分析各組中siRNA的抑制活性。以 5nM的終濃度轉(zhuǎn)染Hela細胞，在轉(zhuǎn)染后48小時使用TaqMan GeneExpression Assay進行測定。結(jié)果顯示以形式K和V-2存在的SiRNA的抑制活性輕微減小(該減小與未修飾S RNA相比在統(tǒng)計學上不顯著)。修飾形式H、H-1、H-2、H+1、Q、V和V-1，與對于未修飾siRNA 的組觀察到的抑制活性相比，保持或增加了對mRNA靶的抑制活性。圖13B的數(shù)據(jù)提供了使用2' OMe修飾的核苷酸的修飾形式H、H+1、H-1、K、V_2和 0的抑制活性。該數(shù)據(jù)集表示靶向4個不同的內(nèi)源mRNA靶的24個不同的siRNA。以各形 式合成24個siRNA中的每一個，然后同樣地分析各組中siRNA的抑制活性。以5nM的終濃 度轉(zhuǎn)染Hela細胞，轉(zhuǎn)染后48小時使用TaqMan Gene Expression Assay進行測定。結(jié) 果顯示修飾形式H、H+l、H-1、K、V-2和0，與對于未修飾形式Asi RNA觀察到的抑制活性相 比，保持或增加了抑制活性。圖14A提供了與形式A相比的使用LNA 修飾核苷酸的修飾形式H、M、W、W+1、 W-1、Y、Y+1和Y-I的另外的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集表示靶向5個不同內(nèi)源mRNA靶的15個不同的 siRNA。以指定的形式合成15個siRNA中的每一個，然后同樣地分析各組中siRNA的抑制 活性。以30nM的終濃度轉(zhuǎn)染U20S細胞，轉(zhuǎn)染后48小時使用TaqMan GeneExpression Assay進行測定。結(jié)果顯示具有用LNA 殘基修 飾的修飾形式W、W+1、W_1、Y、Y+1和Y-I的 siRNA,當與未修飾siRNA形式A的抑制活性相比較時，保持抑制活性。具有修飾形式M的 siRNA,當與具有未修飾形式A的siRNA的抑制活性相比時，抑制活性被削弱(以統(tǒng)計學上 顯著的方式)，具有修飾形式H的siRNA，當與未修飾形式A的抑制活性相比時，提高了抑制 活性(以統(tǒng)計學上顯著的方式)。圖14B的數(shù)據(jù)提供了使用LNA 修飾核苷酸的修飾形式H、M、JB1、JB2、JB 3、JB4 和JB5與形式A相比較的抑制活性。該數(shù)據(jù)集表示靶向5個不同內(nèi)源mRNA靶的15個不同 的siRNA。以指定的形式合成15個siRNA中的每一個，然后同樣地分析各組中siRNA的抑 制活性。以30nM的終濃度轉(zhuǎn)染U20S細胞，轉(zhuǎn)染后48小時使用TaqMan GeneExpression Assay進行測定。結(jié)果顯示具有修飾形式JB2、JB 3和JB5的siRNA就抑制活性而言與未 修飾形式A沒有統(tǒng)計學上顯著的差異；具有形式H、JBl和JB4的siRNA，與形式A相比，提 高了抑制活性，具有形式M的siRNA，當與形式A相比時，具有較低的抑制活性。在本實施例中檢查的siRNA修飾形式中，當與未修飾形式相比時，形式G、J、K和M 削弱了抑制活性。實施例5作為脫靶效應的量度的具有修飾形式H的siRNA對全基因表達特征譜的影響通過使用微陣列分析測量基因特征譜，將形式H中LNA 和2' -0-甲基修飾的 核苷酸影響差異表達的基因的特征(signature)的能力與未修飾siRNA的能力相比。在一 式四份的用4個經(jīng)設計靶向FDFTl基因的siRNA轉(zhuǎn)染的生物學樣品上進行微陣列基因組分 析。FDFTl是參與膽固醇生物合成的基因，其對于用于檢測的細胞不是必需的。該標準確保 通過陣列分析檢測到的基因表達的差異完全是siRNA介導的切割的結(jié)果而不是由于功能 性mRNA靶的喪失而引起的任何生物級聯(lián)的結(jié)果。使用上文中概述的標準方法，分別以未修飾形式A、LNA 修飾的形式H和 2' -0-甲基修飾的形式H將3個siRNA序列(稱為siRNA#183、#184和#192)中的每一個 轉(zhuǎn)染入Hela細胞，在24小時后收獲轉(zhuǎn)染的細胞。使用標準方法分離RNA以進行微陣列分 析。將含有人探針組的Affymetrix U133V2微陣列芯片(Affymetrix，Santa Clara, CA)用于這些研究。對照包括陰性對照siRNA、“模擬(mock)”轉(zhuǎn)染的細胞和未處理的細胞(以記錄在實驗處理不存在的情況下基因表達的基線水平)。在對數(shù)據(jù)進行標準化后，分析結(jié)果以 確定與模擬(只有遞送劑)對照樣品的結(jié)果相比，樣品組的每一個樣品中變化2倍或更大 倍數(shù)的基因的身份。然后將使用計劃對比(planned contrast)的單因素方差分析(1-way AN0VA)用于確定各模擬處理對實驗條件的ρ值。然后以2倍變化和ρ < 0. 001來確定差異 表達的基因探針組。差異表達的基因的數(shù)目是由于siRNA而引起的脫靶效應的量度。圖 9A 至圖 9C 提供了 siRNA#183(圖 9A)、siRNA#184(圖 9B)和 siRNA#192(圖 9C) (3個不同的經(jīng)設計靶向FDFTl基因的siRNA)的結(jié)果的維恩圖。各圖描述了以指定的未修 飾的、2' -0-甲基或LNA 修飾的siRNA形式存在的3個siRNA中的每一個的結(jié)果。維恩 圖顯示了在各實驗條件中發(fā)生變化的特定基因的數(shù)目和siRNA條件之間基因的交集。對于 各圖，左下組(如果有顏色的話為紅色)顯示未修飾的siRNA處理的樣品中變化2倍或更 大倍數(shù)的特定基因的數(shù)目，上組(如果有顏色的話為藍色)顯示2' -0-甲基形式H修飾 的siRNA處理的樣品中變化2倍或更大倍數(shù)的特定基因的數(shù)目，右下組(如果有顏色的話 為綠色)顯示LNA 形式H修飾的siRNA處理的樣品中變化2倍或更大倍數(shù)的特定基因的 數(shù)目。對于siRNA#183 (圖9A)，未修飾的siRNA誘導31個基因(2+19+10+0)的mRNA水 平降低2倍或更大倍數(shù)。2’ -0-甲基修飾的siRNA誘導32個基因(3+0+10+19)的mRNA水 平降低2倍或更大倍數(shù)，其中29個也受到未修飾的對照siRNA的影響。用2' -0-甲基修 飾的siRNA處理的樣品與未修飾siRNA處理的樣品在脫靶基因的數(shù)目上只相差3個基因。 LNA 修飾的siRNA誘導10個基因(0+0+10+0)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)，其全部 也受未修飾對照和2' -0-甲基修飾影響。因此，這10個基因代表了依賴于序列的并且不 能通過本文中提供的教導減弱的脫靶效應。因此，與2' -0-甲基修飾(0%的脫靶效應的 減少)相比，LNA 修飾形式對脫靶基因表達變化的消除具有更顯著的影響(68%的脫靶 效應的減少)。對于siRNA#184 (圖9B)，未修飾的siRNA在Hela細胞中誘導70個差異表達的基因 (14+23+33+1)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)。2' -0-甲基修飾的siRNA誘導66個基 因(9+1+33+23)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)。相比之下，與未修飾siRNA的結(jié)果相比， LNA 修飾的siRNA減少差異表達的基因的數(shù)目50% (35個基因(0+1+33+1))。在LNA 修飾處理的樣品中絕大部分差異表達的基因(33個基因)也在未修飾siRNA和2' -0-甲 基修飾的siRNA處理的樣品中被鑒定為差異表達。這樣的基因代表了依賴于序列的并且不 能通過本文中提供的教導減弱的脫靶效應。因此，與2' -0-甲基修飾(6%的脫靶效應的 減少)相比，LNA 修飾形式對脫靶基因表達變化的消除再次具有更顯著的影響(50%的 脫靶效應的減少)。對于siRNA#192 (圖9C)，未修飾的siRNA誘導103個差異表達的基因 (28+13+61+1)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)。2' -0-甲基修飾的siRNA誘導81個基 因(7+0+61+13)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)。LNA 修飾的siRNA誘導64個基因 (2+1+61+0)的mRNA水平降低2倍或更大倍數(shù)。因此，與未修飾siRNA相比，LNA 修飾消除 了大約38%的脫靶效應。對于該siRNA，61個基因代表依賴于序列的并且不能通過本文中 提供的教導減弱的脫靶效應。與2' -0-甲基修飾(21%的脫靶效應的減少)相比，LNA ‘修飾形式對脫靶基因表達變化的消除再次具有更顯著的影響(38%的脫靶效應的減少)?？傊?，微陣列分析顯示，當與未修飾形式A SiRNA相比時，LNA 修飾的形式H siRNA產(chǎn)生減少38%至68%的差異表達的基因，當與未修飾形式A siRNA相比時， 2' -0-甲基修飾的形式H siRNA產(chǎn)生減少0%至22%的差異表達的基因。因此，LNA⑩修 飾的形式H siRNA提供最少數(shù)目的脫靶效應。實施例6修飾形式化的siRNA在細胞生物學研究中的性能進行細胞生物學研究以測量修飾形式和修飾核苷酸的類型影響由SiRNA引起的 中靶和脫靶表型的能力。為了確定修飾形式化的SiRNA是否保持“中靶”或期望的表型和減少“脫靶”或不 期望的表型，選擇誘導可測量的并且高度表征的生物學應答的siRNA。因此，除了消除脫靶 表型以外，還監(jiān)控中靶表型的保持。以測試修飾形式合成siRNA，將其轉(zhuǎn)染入合適的細胞中 以如下所述進行測定。進行在本文中稱為“生長測定”的測定以研究修飾形式化的siRNA與未修飾siRNA 和陰性對照siRNA相比在細胞水平上的差異。生長測定包括在以30nM和以3nM進行siRNA 轉(zhuǎn)染后測量U20S骨肉瘤細胞系中細胞表型相關(guān)參數(shù)例如增殖、細胞凋亡和形態(tài)學。本文中 論述了來自30nM的測定的結(jié)果，因為在更高的siRNA濃度下觀察到更多的脫靶效應，從而 消除此類脫靶效應的屏障(barrier)更高。生長測定分析包括下列抗原的免疫熒光檢測， 所述抗原為指定的表型的標志物1.切割的核纖層蛋白A(細胞凋亡)，2.磷酸化的組蛋白H3 (有絲分裂)，3.微管蛋白(細胞骨架形態(tài)學，其為性質(zhì)對照測量，即用于細胞結(jié)構(gòu)的背景確定， 以及其標記所有細胞)，和4.HoeSCht染色(細胞核形態(tài)學，其提供細胞數(shù)目標準化)。使用IMAGEXPRESSMi。r。
自動化熒光顯微鏡(Molecular Devices, Toronto, Canada),利用計算機控制的圖像獲取軟件(Cellinger，Munich, Germany)和 METAM0RPH 圖像分析軟件包(MolecularDevices，Toronto, Canada)驅(qū)動的 10X 物鏡 采集免疫熒光。采集各384孔樣品中的4個位點，計算3個生物學重復實驗的數(shù)據(jù)的平均 值，將其與以相似方式處理的陰性siRNA對照樣品(混雜的非靶向性siRNA)相比。在進行 圖像分析后，根據(jù)下列方案評估數(shù)據(jù)1)指數(shù)計算對于孔中的各位點，針對細胞核的總數(shù)標準化有絲分裂細胞核和細 胞凋亡細胞核的數(shù)目，從總圖像面積中減去非細胞背景的面積以計算細胞占據(jù)的面積，然 后針對細胞核的數(shù)目進行標準化；2)樣品孔平均值計算計算孔中所有位點的平均值，此外，計算每塊板所有陰性 對照孔的所有位點的平均值；3)標準化將一式三份重復的每一塊板的樣品和陽性對照針對陰性SiRNA對照孔 的平均值進行標準化；4) 一式三份重復的平均值計算就各處理和讀數(shù)(readout)計算一式三份的板的 平均值。
選擇在不同細胞中在功能上被良好表征的測試基因(根據(jù)公開的文獻)。測試基 因包括表1的測試基因。表 1 鑒定提供可測量的預期表型(例如在Weel或PLKl的抑制后有絲分裂增加 300 % (Watanabe, N.等人(2004) PNAS, 101,4419-4424 ；Leach, S. D.等人(1998) Cancer Research,58,3132-3136 ；Cogswell, J. P.等人(2000)Cell Growth and Diff.ll， 615-623))的強誘導的siRNA。與Neg對照相比，BUBlB基因的抑制預期減少有絲分裂的百 分比(Lampson，Μ· A.禾口 Kapoor，Τ· Μ· (2004)Nature Cell Biology, 7，93—98)。此外，鑒定展示脫靶表型的siRNA。例如，針對LDLR(預期不誘導細胞凋亡的基因) (關(guān)于其他此類基因，參見表1)的siRNA顯示增加細胞凋亡500%。此類siRNA序列用作 確定修飾形式是否可提高siRNA的特異性的工具。產(chǎn)生具有可觀察的中靶表型和脫靶表型 的siRNA的分開的組以包含幾種修飾形式以及2' -0-甲基修飾的核苷酸或具有上述結(jié)構(gòu) (a)的LNA 殘基，其中Rl是0，R2是0，并且R3是CH2。就中靶和脫靶表型檢測此類修飾 的siRNA以確定可消除脫靶效應同時保持中靶表型的修飾形式。在圖10A至圖10E、圖IlA至圖11F、圖12C至圖12D、圖13C至圖13D、圖15A至 15D和圖16A至圖16D中以箱須圖的形式，將修飾形式化的siRNA的基于細胞的測定結(jié)果作 圖，以與在基于細胞的測定中平行分析的陰性對照siRNA處理的樣品的標準化的值(在所 述圖中標記為Neg)相比較。圖10A提供了由于具有LNA 修飾形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA產(chǎn)生的沉默而引起的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖。siRNA靶向BUB1B、WEEK⑶C2、⑶K2、CASP3 和CCND1 (這些基因?qū)τ薪z分裂表型具有迥然不同的效應)。即，該組基因包括當被沉默時 增加有絲分裂的亞組，當被沉默時減少有絲分裂的亞組以及當被沉默時預期對有絲分裂沒 有作用的亞組。由于此類迥然不同的效應，分析其抑制提供了預期的有絲分裂減少的表型 的基因亞組，數(shù)據(jù)提供于圖10B中。圖10B數(shù)據(jù)顯示在靶向基因(BUB1B、⑶C2、CCND1)的siRNA的轉(zhuǎn)染后標準化的 有絲分裂細胞，所述基因的抑制預期減少有絲分裂(Lampson，M. A.和Kapoor，T. M. (2004) Nature Cell Biology, 7,93-98 ；Harborth,J.等人(2001) Journal of Cell Science 114， 4557-4565 ；Klier，M. (2008) Leukemia, EPUB) 因此，這些數(shù)據(jù)測量了中靶表型效應，即，該 測定確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的組“無害”。Neg對照處理的樣品的標準化 的值顯示大約1.0的中值。未修飾形式A siRNA提供了大約0.55的中值，這表示有絲分裂 減少大約2倍。與Neg對照相比，所有修飾形式都減少了有絲分裂。具有修飾形式H和J的 siRNA在它們對有絲分裂的影響上與未修飾形式A相比，提供了統(tǒng)計學上顯著的差異(較少 的中靶效應)，如通過Wilcoxon值以及有絲分裂的中值偏離未修飾形式A所證明的。因此， 與圖8的關(guān)于mRNA抑制的結(jié)果相一致，基于細胞的測定顯示形式J與高度功能性的siRNA 的期望的特征不相容。基于細胞的生長測定還通過定量來自展示切割的核纖層蛋白A的細胞的熒光信 號測量與Neg對照處理的樣品相比的細胞凋亡(Rao,L.等人(1996) J Cell Biology, 135, 1441-1455)。歷史上，在基因組范圍的siRNA篩選實驗中觀察到的最普遍的預料之外的表 型是細胞死亡。在用于此類研究的該siRNA集合中，包括了已知其誘導預料之外的細胞死 亡的siRNA序列，這樣的siRNA序列用作確定修飾形式是否可消除不希望的細胞表型的工 具。圖10C提供了定量由于用具有LNA 修飾形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA處 理U20S細胞而產(chǎn)生的細胞凋亡片段的結(jié)果。陰性對照siRNA處理的樣品用于確定siRNA轉(zhuǎn) 染后細胞凋亡的基線，將數(shù)據(jù)標準化為1. 0。該集合中的siRNA靶向下列基因BUB1B、CDC2、 CCNDUWEEUCASP 3和⑶K2 ( —組基因靶，其一個亞組的抑制預期增加細胞凋亡，其一個亞 組的抑制預期對細胞凋亡沒有作用)。由于此類迥然不同的效應，分析其抑制提供了預期的 細胞凋亡增加的表型的基因亞組，數(shù)據(jù)提供于圖10D中。圖10D提供了在靶向TOE1的siRNA轉(zhuǎn)染后U20S細胞中細胞凋亡測量的結(jié)果。TOE1 的抑制預期增加細胞凋亡(Watanabe,N.等人(2004) PNAS, 101, 4419-4424 ；Leach, S. D.等 人(1998) Cancer Research，58，3132-3136)。因此，這些數(shù)據(jù)測量了中靶表型效應，即，該 測定確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的組“無害”。Neg對照siRNA處理的樣品用 于確定標準化的細胞凋亡的基線。靶向WEE1的形式A的未修飾siRNA與NEG處理的樣品 相比展示大約7. 5的中值，從而提供了預期的表型變化。具有形式J和K的修飾形式化的 siRNA通過以統(tǒng)計學上顯著的方式減少細胞凋亡的量(當與未修飾形式A siRNA相比時) 來減少中靶表型，從而證明形式J和K削弱了 siRNA的性能。這些數(shù)據(jù)與圖8的關(guān)于由具 有修飾形式J和K的siRNA產(chǎn)生的抑制的數(shù)據(jù)相一致。圖10E的數(shù)據(jù)提供了修飾形式化的siRNA消除基因亞組(其抑制預期對細胞凋 亡沒有作用)的脫靶表型的能力的分析。特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。 siRNA具有脫靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有增加的中值和 更大的數(shù)據(jù)分布)來證明(圖10E)。研究的siRNA具有形式A、E、F、G、H、J、K、M和0，靶 基因(其抑制預期不誘導細胞凋亡)包括BUB1B、CCND1、OTK2和⑶C2。將Neg對照處理的 群體用于確定細胞凋亡的基線。具有形式G、H、J和K的siRNA顯示統(tǒng)計學上顯著的消除脫 靶效應的能力，如與未修飾形式A相比更低的細胞凋亡信號所證明的(圖10E)。根據(jù)圖IOD的數(shù)據(jù)(其中具有修飾形式J和K的siRNA顯示削弱了 siRNA的中靶 功效)和根據(jù)圖8的數(shù)據(jù)(其中具有修飾形式G、J和K的siRNA顯示削弱了抑制活性)， 形式G、J和K似乎對功能性siRNA “有害”。通過使用含有2' 0-甲基化的殘基而非LNA 殘基的修飾核苷酸進行修飾形式 的進一步表征，以確定其他類型的修飾是否可降低siRNA的脫靶效應。圖IlA提供了由于 具有2' -0-甲基修飾形式H和K并且靶向TOE1、PLK1、FDFT1、LDLR和SC5DL(這些基因?qū)?有絲分裂表型具有迥然不同的效應)的siRNA產(chǎn)生的沉默而引起的標準化的有絲分裂細胞 的箱線圖。即，該組基因包括當被沉默時增加有絲分裂的亞組，和當被沉默時預期對有絲分 裂沒有作用的亞組。由于這些迥然不同的效應，分析其抑制提供了預期的有絲分裂增加的 表型的基因亞組，數(shù)據(jù)提供于圖IlB中。圖IlB提供了在靶向TOEl或PLKl的siRNA轉(zhuǎn)染(通過具有2' _0_甲基修飾形式 H禾口 K的siRNA)后U20S細胞中有絲分裂測量的結(jié)果。WEEl或PLKl的該沉默導致U20S細 胞中有絲分裂增加，這由 Watanabe，N.等人((2004)PNAS，101,4419-4424)，Leach，S. D.等 人((1998) Cancer Research, 58, 3132-3136)和 Cogswell，J. P.等人((2000) Cell Growth and Diff，11,615-623)提出，并且由具有未修飾形式A的siRNA (其誘導了與Neg對照處理 的樣品相比增加大約4倍的有絲分裂)的數(shù)據(jù)證實。因此，這些數(shù)據(jù)測量了中靶表型效應， 艮口，該測定確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的組“無害”。如圖IlB的數(shù)據(jù)所顯示 的，使用具有2 ‘ OMe修飾形式H和K的siRNA觀察到相似水平的對有絲分裂的影響。該研 究證明形式H和K中的2‘ OMe修飾對功能性siRNA無害。為了確定具有2' OMe修飾形式H和K的siRNA是否可減少脫靶效應，將靶向基因 亞組(FDFT1、SC5DL和LDLR)(所述基因亞組的抑制預期對有絲分裂沒有作用)的siRNA轉(zhuǎn) 染入U20S細胞，然后測定對有絲分裂的影響。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂 脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫 靶效應。圖IlC提供了數(shù)據(jù)。siRNA具有脫靶效應可通過未修飾形式A的箱線圖(與Neg 對照相比，其具有更大的數(shù)據(jù)分布)來證明(圖11C)。當比較單獨的siRNA序列時，在形式 H中具有2' OMe殘基的siRNA降低了在未修飾siRNA形式A中觀察到的許多脫靶表型。在 形式K中具有2' OMe殘基的siRNA，與未修飾siRNA相比，提高了中值有絲分裂影響。然 而，關(guān)于形式H和K中該2' -0-甲基修飾的數(shù)據(jù)與未修飾形式A的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上沒有顯
者差升。圖IlD提供了定量由于用具有2' -0-甲基修飾形式H和K的siRNA處理U2 0S細 胞而引起的細胞凋亡片段的結(jié)果。Neg對照siRNA處理的樣品用于確定siRNA轉(zhuǎn)染后細胞凋 亡的基線，并且將數(shù)據(jù)標準化為1.0。該集合中的siRNA靶向基因TOEl、PLKl、FDFTl、LDLR 和SC5DL，所述基因的一個亞組的抑制預期增加細胞凋亡，所述基因的一個亞組的抑制預期對細胞凋亡沒有作用。由于這些迥然不同的效應，分析其抑制提供了預期的細胞凋亡增加 的表型的基因亞組，數(shù)據(jù)提供于圖IlE中。圖IlE提供了在靶向TOEl和PLKl的siRNA轉(zhuǎn)染(通過12個具有2' _0_甲基修 飾形式H和K的siRNA的組)后U20S細胞中細胞凋亡測量的結(jié)果。因此這些數(shù)據(jù)測量了 中靶表型效應，即，該測定確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的組“無害”。Neg對照 siRNA處理的樣品用于確定標準化的細胞凋亡的基線。靶向WEEl或PLKl的形式A的未修 飾siRNA展示與NEG處理的樣品相比細胞凋亡的中值增加大于大約4倍，從而提供了預期 的表型變化。對于以形式H和形式K存在的2' OMe修飾的siRNA觀察到相似水平的細胞 凋亡。該研究表明H和K形式中的2' OMe修飾不降低siRNA的功效并且提供與在未修飾 siRNA形式A中觀察到的表型相似的表型。圖IlF的數(shù)據(jù)提供了 2' -0-甲基修飾形式化的siRNA消除一組基因(FDFT1、LDLR 和SC5DL)(其抑制預期對細胞凋亡沒有作用)的脫靶表型的能力的分析。特別地選擇已在 經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化 時，是否消除或減少脫靶效應。研究的siRNA具有形式A、H和K。Neg對照處理的群體用 于確定細胞凋亡的基線，所述群體具有范圍特別寬的細胞凋亡結(jié)果。對照形式A的中值與 Neg對照處理的樣品的中值相似。當評估單獨的siRNA序列時，在修飾形式H和K中具有 2’ OMe修飾核苷酸的siRNA減少在未修飾siRNA形式A中觀察到的許多脫靶表型，但在測 試群體中，未以統(tǒng)計學上顯著的方式觀察到脫靶效應的減少。 檢測另外的修飾形式(如提供了形式!1、!1-2、!1-1、!1+1、0、￥、￥-1、￥-2和1(的圖IA 至圖IC的示意圖中所示)。LNA 修飾核苷酸具有結(jié)構(gòu)(a)，其中Rl和R2是0，R 3是CH2, R4和R5是如本文中描述的siRNA中的核苷酸的位點所確定的。就圖12C的siRNA修飾形 式在U20S細胞中進行針對有絲分裂的中靶表型測定(即，“無害”測定)。如圖12C的數(shù)據(jù) 所顯示的，未修飾siRNA，與Neg對照處理的細胞相比，在siRNA處理的細胞中顯示有絲分裂 增加大約2倍。以這些形式存在的LNA 修飾的修飾形式化的siRNA的中靶性能對預期的 表型沒有負面影響。修飾形式H在表型上提供了統(tǒng)計學上顯著的增加。圖12D提供了關(guān)于消除圖12C的具有LNA 修飾形式的siRNA的脫靶效應的數(shù) 據(jù)。由于具有未修飾形式A和具有LNA 修飾形式H、H+l、H-I、H-2、K、Q、V、V-I和V-2的 siRNA沉默一組基因靶(其抑制預期對細胞凋亡沒有作用)(FDFT1、LDLR或SC5DL)而產(chǎn)生 的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖。陰性對照(Neg)是混雜的非靶向性siRNA，對于所述混 雜的非靶向性siRNA，將細胞凋亡的定量標準化為1. 0的值。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上 證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否 消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應由未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比， 其具有增加的中值和更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。在消除不希望的細胞凋亡表型上最有效的 修飾形式是形式H、K、Q和V-2，而修飾形式H-2、H-1、H+1、V和V-I，當與未修飾siRNA相比 時，不以任何統(tǒng)計學顯著性改變細胞凋亡片段的測量值。對于修飾形式H、H-l、K和V，由2' OMe核苷酸修飾的siRNA在基于U20S細胞的 測定中對中靶表型也沒有負面影響，如圖13C的數(shù)據(jù)所顯示的。圖13C提供了由于具有未 修飾形式A和具有擁有2' -0-甲基修飾的核苷酸的所述修飾形式的siRNA沉默一組基因 靶(WEE1和PLK1)而引起的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖，所述基因靶的抑制預期增加有絲分裂。該測定是“無害”測定。未修飾siRNA顯示與Neg對照處理的樣品相比大約2倍 的有絲分裂中值，如所預期的。修飾形式化的siRNA的數(shù)據(jù)顯示具有2' OMe修飾核苷酸的 siRNA在基于細胞的測定中對預期的表型不具有負面影響。圖13D提供了由于具有未修飾形式A的siRNA和具有擁有2' _0_甲基修飾核苷 酸的修飾形式H、H-1、V和K的siRNA沉默一組基因靶(FDFT1、SC5DL或LDLR)而引起的標 準化的細胞凋亡片段的箱線圖，所述基因靶的抑制預期對細胞凋亡沒有作用。然而，特別地 選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修 飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可由未修飾形式A的箱線圖 (與Neg對照相比，其具有更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。對于每一種形式，siRNA的組包含13 個不同的siRNA。具有2‘ OMe修飾形式的siRNA沒有一個提供與未修飾對照形式A具有 統(tǒng)計學上顯著差異的數(shù)據(jù)，從而證明2' OMe修飾形式化的siRNA保持與對于未修飾形式A siRNA觀察到的脫靶效應相同的脫靶效應。研究與形式H的修飾形式和圖1D中所示的修飾形式相似的另外的修飾形式。圖 15A提供了關(guān)于在形式A、H、M、W、W+1、W-1、Y、Y+1和Y_1中具有LNA 修飾核苷酸的siRNA 的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖。選擇siRNA的組來抑制BUB1B、CCND1和CDC2mRNA以 產(chǎn)生預期的U20S細胞有絲分裂指數(shù)的減少。因此這些數(shù)據(jù)測量中靶表型效應，即，該測定 確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的組“無害”。如圖15A的數(shù)據(jù)所提供的，用未修 飾形式A siRNA處理的樣品的有絲分裂中值，與Neg對照siRNA處理的樣品相比，顯示有絲 分裂減少至大約0. 75。&BSH、M、W+1、W-1、Y-1和Y+1存在的修飾形式化的siRNA不顯 著改變此類siRNA對有絲分裂的影響，從而證明此類修飾形式“無害”。然而，修飾形式Y(jié)和 W減少預期的siRNA的中靶影響，從而證明此類修飾形式干擾中靶功能。圖15B如圖15A —樣提供了關(guān)于CASP3的箱線圖，CASP3的抑制預期不影響有絲 分裂。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這 樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可由未修 飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大約0.7的中值)來證明。具有修飾形式H、 W、W+1、W-1、Y和Y+1的siRNA逆轉(zhuǎn)了形式A的siRNA顯示的脫靶效應。具有形式M和Y-1 的siRNA的修飾不逆轉(zhuǎn)形式A siRNA的脫靶表型。對于圖15B的數(shù)據(jù)，沒有一個Wilcoxon 值的p < 0. 05，這可能是由于每一個形式中siRNA的群體較小。圖15C提供了關(guān)于靶向TOE1基因(其抑制預期增加細胞凋亡)的一組siRNA (形 式A、H、M、W、W+l、W-l、Y、Y+1和Y-1)的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖。未修飾形式A siRNA，與Neg對照siRNA處理的樣品相比，顯示大于4. 0的細胞凋亡中值，從而證明由于 WEE1抑制，細胞凋亡強烈增加。因此檢測數(shù)據(jù)測量中靶表型效應，即，該測定確保修飾形式 化的siRNA對功能性未修飾siRNA的組“無害”。如圖15C的數(shù)據(jù)所提供的，具有修飾形式 H、M和W-1的siRNA,與形式A相比，顯示相似的細胞凋亡增加，然而形式W、W+l、Y、Y+1和 Y-1，與未修飾siRNA形式A相比，顯示更小的對細胞凋亡的影響。對于圖15C的數(shù)據(jù)，沒有 一個Wilcoxon值的p < 0. 05，這可能是由于每一個形式中siRNA的群體較小。盡管對細胞 凋亡的影響減小，但化學修飾形式W、W+l、Y、Y+1和Y-1保持抑制靶mRNA(圖14A)和誘導 細胞凋亡的能力(與Neg對照siRNA處理的樣品相比)。圖1叨提供關(guān)于具有修飾形式々、1^、1、1+1、1-1、￥、￥+1和￥-1的siRNA沉默一組基因靶(其抑制預期不影響細胞凋亡)的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖。該組中的 siRNA靶向BUB1B、CCND1、⑶C2或⑶K2。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實細胞凋亡脫靶 效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效 應。siRNA具有脫靶效應可由非修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大于3.5的 中值和更大的數(shù)據(jù)分布)來證明。與形式A相比，由具有形式H、Y和Y+1的siRNA產(chǎn)生的 沉默顯示統(tǒng)計學上顯著的對脫靶效應的逆轉(zhuǎn)。研究圖1E中所示的另外的siRNA修飾形式。將siRNA轉(zhuǎn)染入U20S細胞，如本文 中所述測量有絲分裂效應。圖16A提供了關(guān)于具有未修飾形式A和具有LNA 修飾形式H、 M、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA的標準化的有絲分裂細胞的箱線圖。選擇siRNA的 組(3個siRNA/靶mRNA)來抑制BUB1B、CCND1和CDC2mRNA以產(chǎn)生預期的U20S細胞有絲分 裂指數(shù)的減少。因此，這些數(shù)據(jù)測量了中靶表型效應，即，該測定確保修飾形式化的siRNA 對功能性siRNA的組“無害”。如圖16A的數(shù)據(jù)所提供的，用未修飾形式A siRNA處理的樣 品的有絲分裂中值，與Neg對照siRNA處理的樣品相比，顯示有絲分裂減少至大約0.75。以 形式H、M、JB1、JB2、JB4和JB5存在的修飾形式化的siRNA沒有顯著改變siRNA對有絲分 裂的中靶影響，從而證明此類形式能被siRNA耐受。然而，具有修飾形式JB3的siRNA顯著 減少了預期的靶向這些基因的siRNA的中靶影響，從而證明形式JB3干擾中靶功能。圖16B如圖16A—樣提供了修飾形式(針對基因靶CASP3，其抑制預期不影響有絲 分裂)的箱線圖。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上證實有絲分裂脫靶效應的siRNA來進行研究 以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應 可由未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照相比，其具有大約0. 65的中值，從而展示有絲分 裂的減少)證明。修飾形式H、JB1、JB2、JB4和JB5能夠逆轉(zhuǎn)此類脫靶效應，如圖16B的數(shù) 據(jù)所證明的。修飾形式M和JB3沒有減少靶向CASP3的siRNA的脫靶表型，從而證明此類 形式在消除脫靶表型上是無效的。對于圖16B的數(shù)據(jù)，沒有一個Wilcoxon值的p<0.05， 這可能是由于每一個形式中siRNA的群體較小。圖16C提供了由于具有修飾形式A、H、M、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA沉 默基因靶WEE1 (其抑制預期增加細胞凋亡)而產(chǎn)生的標準化的細胞凋亡片段的箱線圖。因 此這些數(shù)據(jù)測量了中靶表型效應，即，該測定確保修飾形式化的siRNA對功能性siRNA的 組“無害”。如圖16C的數(shù)據(jù)所提供的，用未修飾形式A siRNA處理的樣品的細胞凋亡中值， 與Neg對照siRNA處理的樣品相比，顯示細胞凋亡增加至大于4. 0，從而顯示由于WEE1抑 制，細胞凋亡強烈增加。具有修飾形式的siRNA誘導預期的表型至不同的程度，從而證明 所有測試的形式對功能性siRNA的組無害。對于圖15B的數(shù)據(jù)，沒有一個Wilcoxon值的p < 0. 05，這可能是由于每一個形式中siRNA的群體較小。圖16D如圖16(—樣提供了關(guān)于在形式々、1^、邛1、邛2、邛3、邛4和邛5中具有 LNA修飾的核苷酸的siRNA的修飾形式(針對包括BUBlB、CCNDl、raC2和⑶K2的基因靶的 組，所述基因靶的抑制預期對細胞凋亡沒有作用)的箱線圖。然而，特別地選擇已在經(jīng)驗上 證實細胞凋亡脫靶效應的siRNA來進行研究以確定這樣的siRNA，當被修飾形式化時，是否 消除或減少脫靶效應。siRNA具有脫靶效應可由未修飾形式A的箱線圖(與Neg對照處理 的樣品相比，其具有大于3的增加的中值和更大的數(shù)據(jù)分布)證明。如圖16D的數(shù)據(jù)所顯 示的，當與形式A的脫靶效應相比時，具有修飾形式H、JB1、JB2、JB3、JB4和JB5的siRNA能夠以統(tǒng)計學上顯著的方式逆轉(zhuǎn)細胞凋亡脫靶效應。具有形式M的siRNA不能將細胞凋亡 效應逆轉(zhuǎn)至統(tǒng)計學上顯著的程度。總的來說，圖10E、11C、11F、12D、13D、15B、15D、16B和16D的數(shù)據(jù)顯示提供預料之 外的脫靶表型效應的減少的修飾形式包括形式G、H、J、K、Q、V-2、Y、Y+l、JB1、JB2、JB 3、 JB4和JB5。在這些修飾形式中，形式G、J和K對功能性siRNA抑制活性的能力“有害”。高 度功能性的siRNA具有減少脫靶表型效應的性質(zhì)，并且在抑制活性方面“無害”。給功能性 siRNA提供這樣的功能性的修飾形式包括形式H、Q、V-2、Y、Y+1、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5。就鏈型效應(圖4E、6C、7B、12A、13A、本文實施例3的數(shù)據(jù))和就它們減少脫靶效 應的能力(如上文所提供的)對這些修飾形式進行研究，以評估是否可根據(jù)鏈型測定來預 測修飾形式化的siRNA在脫靶效應的消除中將起什么樣的作用。使用經(jīng)典報告子測定獲得 的實施例3的鏈型數(shù)據(jù)顯示，可預期修飾形式E、G、H、K、0和M在細胞表型測定中表現(xiàn)良好。 事實上，這些形式中有3個形式確實表現(xiàn)良好，但它們中有3個表現(xiàn)不良。因此，鏈型測定 似乎在預測修飾形式化的siRNA在獲得期望的細胞表型上是否具有功能中是無效的。實施例7穩(wěn)定的修飾形式化的siRNA本實施例提供了修飾形式化的siRNA，其除了上述保持抑制活性且消除脫靶效應 的性質(zhì)外，還對暴露于含有核酸酶的生物學液體特別穩(wěn)定。Elmen等人(Nucleic Acids Research 33 1，439-447，2005)報導描述了稱為siLNA5的穩(wěn)定的siRNA，其具有與本文中 的形式F相同的修飾形式并且該形式用作參照對照用于本實施例的穩(wěn)定性研究。術(shù)語“對 暴露于生物學液體是穩(wěn)定的”，如本文中所使用的，是指siRNA在含有核酸酶的生物學液體 存在的情況下保持它們的全長，以與暴露于相同生物學液體且進行相同時間的具有修飾形 式F的siRNA相比，相同或更大的程度。雖然本實施例提供了穩(wěn)定的修飾形式，但之前的實施例提供的修飾形式化的 siRNA適合用于其中幾乎不用考慮核酸酶活性的環(huán)境中。 關(guān)于形式F，來自實施例6和圖10E的數(shù)據(jù)顯示具有修飾形式F的siRNA在消除脫 靶細胞效應中基本上是無效的。 對8個不同的靶向CLTC和TOE lmRNA的siRNA進行研究以確定在90%的小鼠血 清中賦予siRNA穩(wěn)定性的修飾形式。如實施例1中所述，針對下面描述的和圖1F至圖1K 所示的修飾形式進行siRNA的合成。形式修飾的位點(從各鏈爾J5'末端開始編號
過客序列引導序列
A，對照無無
F(E lmen 等人)1,20,2120,21
H1,2,13，14無
DH211,2,13，1420,21
DH201,2,13，1419,20,21
DH31,2,13，14,20,21無
DH301,2,13，14，19,20無
DH351,2,13，14,2021CN 10849008 A說明書
對于每一個測定，將10 ii M的修飾形式化的siRNA以50 i L終體積于37°C下在 90%的小鼠血清中溫育，進行時間曲線(圖17)中所指定的時間或進行5小時的時間(圖
5318A 至圖 23B)。平行于血清中的溫育，用 PBS(cat#9625，Applied Biosystems, Austin, TX) 處理每一組的siRNA，進行與血清處理的樣品相同的時間以確定用于HPLC研究的全長產(chǎn)物 的量的基線。在溫育后，用酚(cat#9700, AppliedBiosystems, Austin, TX)抽提 siRNA,然 后在 5iig 糖原載體(liU/試管，產(chǎn)品編號 AM9510，Applied Biosystems, Austin, TX)存 在的情況下用乙醇沉淀以增加小RNA的回收。通過離心(以15，OOOxg進行15分鐘)回收 siRNA和切割產(chǎn)物，然后在進行HPLC分析之前將其溶解于PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖的鹽溶 液)中。使用離子交換高效液相色譜(HPLC)，利用連續(xù)梯度的含有乙腈的高氯酸鈉 (NaC104)確定全長產(chǎn)物的量。固定相是與Waters 2795 ALLIANCE 分析HPLC系 統(tǒng)和 EMPOWER Dissolution Software v2 (Waters Corp, Milford, MA) 一起使用的 DionexDNAPAC 200 柱子(4mm X 250mm, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA)。保持 溫度以使siRNA雙鏈體不變性。利用Waters 2998光電二極管陣列檢測器(Waters Corp, Milford, MA)在254nm處進行定量和UV檢測。將10 ii 1-20 u 1注射體積中的靶向GAPdH 的mRNA的siRNA(在各末端上具有2個3'懸突核苷酸的21聚體雙鏈體)(10 u M)用于確 定柱子質(zhì)量和保留時間。HPLC結(jié)果的分析基于未處理的siRNA的峰的總面積(areacount) (當作100% )和血清處理的樣品的相同保留時間(+/-0. 1-0. 2分鐘)的峰的總面積(提 供了計算的剩余的百分數(shù))。分別就內(nèi)源基因的抑制活性檢測用于血清穩(wěn)定性檢測的相同siRNA以確定修飾 形式是否改變siRNA抑制其mRNA靶的功效。如實施例4所述(除了在廠商描述的“正向” 方案中，轉(zhuǎn)染使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)以外)，以 5nM 的終濃度 將修飾形式化的siRNA和未修飾對照siRNA轉(zhuǎn)染入Hela細胞。在收獲轉(zhuǎn)染細胞后，按照廠 商的方案，使用TaqMan Gene Expression Cells-to-CT 試劑盒(Applied Biosystems, Inc. Cat. #AM1728)分離總細胞裂解物。如實施例4中所述進行cDNA的制備、基因表達測定 和抑制活性的計算。圖17的數(shù)據(jù)顯示本研究的8個不同siRNA的未修飾形式在血清中降解，其中在暴 露于血清5至10分鐘內(nèi)，50%以上的全長分子降解。對于未修飾形式A、穩(wěn)定性對照形式F和修飾形式H、DH21、DH20、DH3、DH30、DH35、 DH6、DH34和DH2，圖18A提供了當在描述的條件下用90%的血清處理5小時時，保持全長 的siRNA的百分比的箱線圖。在描述的條件下，未修飾形式A和修飾形式H在血清中被完 全降解。在描述的條件下，穩(wěn)定性參照對照形式F在血清中具有大約43%的全長siRNA的 中值。圖18A的數(shù)據(jù)的分析表明只在一個3'-末端上的和/或其附近的核苷酸的修飾不 足以在血清中保護修飾的siRNA(形式DH21、DH20、DH 3和DH 30，與形式F相比)。兩個或 三個懸突核苷酸的修飾也不足以在血清中保護修飾的siRNA(形式DH6、DH 34和DH 35，與 形式F相比)。所有4個懸突核苷酸都被修飾的形式DH2在血清中提供了等于或好于形式 F的保護作用。圖18B提供了圖18A中研究的siRNA的mRNA抑制(表示為Neg對照的百分 比)的箱線圖。如由圖18B所顯示的，未修飾形式A siRNA展示了與Neg對照siRNA處理 的樣品相比大約85%的中值抑制。siRNA修飾形式DH20，與形式H的抑制活性相比，特別地 顯示抑制活性的降低。這該組研究的修飾形式中，只有形式DH2由于其穩(wěn)定性和抑制活性 而被考慮用于進一步的分析。
在有義鏈的3'末端的倒數(shù)第二和倒數(shù)第三位中提供兩個修飾的核苷酸且在反義 鏈的兩個或三個末端殘基中提供修飾的核苷酸(DH4、DH31、DH19)似乎對血清穩(wěn)定性具有 不利作用，如圖19A所顯示的。這些數(shù)據(jù)進一步支持將修飾核苷酸安置為懸突核苷酸。此 外，如圖19B的數(shù)據(jù)所顯示的，形式DH19、DH27和DH25，與形式A相比，顯示抑制活性的顯著 降低。形式DH 31具有大于70%的抑制活性。保護內(nèi)部殘基(如DH27(位點7)和DH25 (位 點6和9))而讓末端殘基不受保護，在抑制活性方面產(chǎn)生相反效果(當將數(shù)據(jù)與形式DH2 的數(shù)據(jù)相比時)。圖20A提供的數(shù)據(jù)顯示與對照形式F相比，修飾形式DH47和DH29的穩(wěn)定性增加， 且DH18的穩(wěn)定性甚至進一步增加。除了懸突位點和形式H的位點中的修飾核苷酸外，修飾 形式DH47和DH29在有義鏈序列的倒數(shù)第三和倒數(shù)第四位中的一個位點(即，對于21聚 體，位點18和19之一)上提供修飾核苷酸。形式DH18提供了與DH29 —樣的修飾核苷酸， 此外，在反義鏈的倒數(shù)第三個位點(即，對于21聚體，位點19)上提供了修飾核苷酸。形式 DH28的數(shù)據(jù)，當直接與形式DH 29相比時，再次顯示反義鏈的懸突位點上修飾核苷酸的缺 乏破壞了受保護的有義鏈提供的穩(wěn)定性。當與形式F相比時，形式DH47和DH28的數(shù)據(jù)具 有p < 0. 05的Wilcoxon值。圖20B的數(shù)據(jù)顯示形式DH47、DH29和DH28具有大于70%的 抑制活性。反義鏈的倒數(shù)第三個位點(位點19)的修飾(如形式DH18)，雖然提供了增強的 穩(wěn)定性，但將抑制活性削弱至大約60%的中值。基于上述數(shù)據(jù)，形式DH47和DH29都提供了 超過對照形式F的增加的siRNA的穩(wěn)定性，形式DH47提供了與未修飾形式A相當?shù)囊种苹?性，形式DH29提供了大于70%的抑制活性。圖21A中描述的具有修飾形式的siRNA沒有一個提供超過具有修飾形式F或形式 DH2的siRNA的增加的血清穩(wěn)定性。增加的血清穩(wěn)定性的缺乏進一步支持其中懸突核苷酸 被修飾的修飾形式。圖21A中研究的siRNA的抑制活性的數(shù)據(jù)都顯示大于70%的活性，如 圖21B所顯示的。圖22A的具有修飾形式F的siRNA的血清穩(wěn)定性與具有修飾形式DH23、DH48、 DH49、DH44和DH45的siRNA的血清穩(wěn)定性的比較進一步支持懸突核苷酸的位點上的修飾 核苷酸。除了在懸突核苷酸的位點上具有修飾核苷酸外，反義鏈的位點2上的核苷酸的修 飾(例如形式DH1和DH7)增加了血清穩(wěn)定性的中值(圖22A)。圖22B的數(shù)據(jù)顯示圖22A 的所有形式化的siRNA，除了形式DH23外，都獲得大于70%的抑制活性。總的來說，除了懸 突核苷酸的位點外，在引導鏈的位點2上具有修飾核苷酸的形式DH1和DH7提供了血清穩(wěn) 定性和抑制活性的性質(zhì)。具有修飾形式DH7的siRNA在位點13和14上以及其附近的位點 上缺乏修飾的核苷酸，因而可能不提供消除脫靶效應的性質(zhì)。然而，這樣的siRNA可在其中 不預期脫靶效應的環(huán)境中用于沉默。圖23A提供的數(shù)據(jù)檢查除了形式H和懸突位點上的修飾核苷酸外在反義鏈的位點 1、2、3、4、5、6或7(位點#1是5'核苷酸)上的一個核苷酸修飾(分別地DH38、DH1、DH 39、 DH40、DH41、DH42、DH43)的效應。數(shù)據(jù)顯示所有檢測的形式化的siRNA都增加中值血清穩(wěn) 定性，并且隨著修飾核苷酸進一步遠離引導反義鏈的5'末端，穩(wěn)定性傾向于減小。如圖23B的數(shù)據(jù)所提供的，除了具有形式DH38的siRNA以外，所有形式化的siRNA 具有大于70%的抑制活性。該觀察結(jié)果突出了位于反義鏈的5'末端的修飾核苷酸的不相 容性。將磷酸基團添加至反義鏈的5'末端部分地拯救了生物學活性，但以減小的穩(wěn)定性為代價(數(shù)據(jù)未顯示)?？偟膩碚f，關(guān)于血清穩(wěn)定性和抑制活性的數(shù)據(jù)顯示在引導反義鏈的位 點2、3、4、5、6或7(參照5'末端)上的至少一個核苷酸修飾增強了 siRNA穩(wěn)定性同時還提 供了至少70%的抑制活性。結(jié)合圖18A至圖23B的數(shù)據(jù)，提供大于形式F的血清穩(wěn)定性同時保持至少70%的 抑制活性的修飾形式是形式 DH47、DH29、DH7、DH1、DH 39、DH40、DH41、DH42 和 DH43。形式DH7在位點13和14上以及其附近的位點上缺乏修飾的核苷酸，因而可能不 提供消除脫靶效應的性質(zhì)。形式DH47、DH29、DH1、DH 39、DH40、DH41、DH42 和 DH43 在過客有義鏈中在位點 1、 2、13、14、20、21上以及對于DH47和DH29，在位點18或19之一上具有修飾的核苷酸；且在 引導反義鏈中在位點20和21上以及對于DH39至DH43，在位點2、3、4、5、6或7的任一個上 具有修飾的核苷酸。其中在過客有義鏈的位點1上的兩個核苷酸都被修飾的雙鏈化堿基對 顯示對抑制活性是不利的(DH20、DH19、DH4、DH18)。實施例8穩(wěn)定siRNA的體內(nèi)遞送體內(nèi)遞送未修飾形式A siRNA和具有修飾形式DH1和DH47的穩(wěn)定siRNA，并且 比較存在于對照動物和測試動物的肝中的全長siRNA的量。將允許siRNA和miRNA的 可靠和有效定量并且只特異性檢測全長分子的基于TaqMan 的莖-環(huán)rt-pcr測定 (TaqMan basedstem-loopRT-PCR assay)用于分析(2004 年 9 月 21 日提交的屬于 Chen 等人的美國公開專利申請 2005/0266418 ;Chen，C.等人 Nucleic AcidsResearch 33， e 179，2005)。如Zhang等人(HumanGene Thera py 10，1735-1737. 1999)和Lewis等人(Nature Genetics 32，107-108. 2002)所述，使用水動力(hydrodynamic)(高壓)尾靜脈注射對小鼠 施用靶向Fas基因的siRNA(lnmol，稀釋于2.5ml PBS中(10%的小鼠體重))。針對每一個 修飾形式化的siRNA注射4只小鼠。修飾的核苷酸是具有結(jié)構(gòu)(a)的LNA 殘基，其中R1 是0，R2是0且R 3是CH2。注射后5分鐘時，殺死小鼠，收獲完整肝臟，將其冷凍于干冰中。按照具有如下改 進的廠商的方案，使用mirVanaTMPARIS 試劑盒(Applied Biosystems,Foster City，CA)從 完整肝臟分離總RNA。加入細胞裂解緩沖液(Cell disruption buffer) (20ml)，并將樣品勻 漿。將裂解物(400 yl)轉(zhuǎn)移至新管中，向各管中加入變性溶液(400 yl)，通過渦旋充分混 合管。通過加入800 u 1酚，渦旋5分鐘，離心10分鐘來進行酚抽提。將上層相(300 yl)轉(zhuǎn) 移入新管中并且與375 u 1 (1. 25倍體積)的100%乙醇混合。按照試劑盒的方案，將混合物 通過過濾柱，使用100 yl洗脫緩沖液進行終洗脫。測量RNA的濃度并且將其調(diào)整至10ng/
li lo用于定量siRNA的測定包括使用具有莖-環(huán)設計的RT引物逆轉(zhuǎn)錄(RT) siRNA的引 導鏈，如對于 TaqMan MicroRNA ReverseTranscription Assays(Applied Biosystems, Foster City, CA)所描述的，然后進行PCR。在10 yl RT反應中，將lng/ u 1的總RNA和 50nM的RT引物在85°C下變性5分鐘，然后在60°C下進行5分鐘，然后在4°C下退火。在加 入酶混合物(0. 25mM各dNTP，終濃度；3. 33個單位/yl的MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(Applied Biosystems), IX RT緩沖液，0. 25個單位/ yl的RNA酶抑制劑)后，將反應混合物在16°C下溫育30分鐘，在42°C下溫育30分鐘，在85°C下溫育5分鐘，然后在4°C下溫育。在Applied Biosystems 7900HT 序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)上使用標準TaqMan PCR 方案 進行實時PCR。10 μ 1 PCR反應混合物包含1 μ 1 RT產(chǎn)物、IX TaqMan Universal PCR
下溫育10分鐘，然后進行40個循環(huán)95°C下進行15秒和在60°C下進行1分鐘。在勻漿之前，用300、200、100和50pmol的siRNA給來自分開的對照未處理組的小鼠的冷凍完整肝臟加料(spike)。此類“加料的”樣品用作研究的對照并且提供用于比較注 射的樣品與對照樣品之間的循環(huán)閾值(Ct)的標準曲線。如上所述從對照器官分離RNA。術(shù) 語“Ct”表示當信號首次被記錄為統(tǒng)計學上顯著的時，PCR循環(huán)的次數(shù)。因此，Ct值越低，核 酸靶的濃度越高。在TAQMAN 測定中，通常各循環(huán)幾乎倍增PCR產(chǎn)物的量，因此，如果不 存在對反應的抑制并且反應對于純化的核酸幾乎100%有效，那么熒光信號應當加倍。圖24提供了“加料的”對照、未修飾形式A注射的動物以及形式DHl和形式 DH47siRNA處理的動物的Ct值。在水動力注射后5分鐘在肝中檢測到大約5%的未修飾形 式A SiRNA0相比之下，檢測到大約20%的具有形式DHl和DH47的修飾形式化的siRNA，與 未修飾siRNA相比，400%的增加。該體內(nèi)研究顯示為了穩(wěn)定而進行修飾形式化的siRNA在 全身性施用后提供了顯著增加的全長siRNA的遞送。本文中已廣泛地和一般地描述了本教導的組合物、方法和試劑盒。落在一般公開 內(nèi)容內(nèi)的每一個更窄的種類和亞屬(sub-generic)分類也形成了本教導的部分。這包括帶 有條件或負向限制(從該屬中除去任何主題物質(zhì)，無論去除的物質(zhì)是否明確地在本文中引 用)的本教導的一般描述。雖然已通過參考不同應用、方法和組合物描述了公開的教導，但應當理解可進行 各種改變和修飾而不背離本文中的教導。前述實施例用于更好地說明本教導而非意欲限定 本文的教導的范圍?？筛鶕?jù)下列權(quán)利要求進一步理解本教導的某些方面。
權(quán)利要求
一種化學合成的過客(有義)寡核苷酸，其具有15至30個核苷酸的長度并且包含不依賴于序列的修飾形式(1)、不依賴于序列的修飾形式(2)和不依賴于序列的修飾形式(3)中的一個(1)5′Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3′，其中p為0或1；x為7、8、9、10或11；r為0、1或2；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+x+r+4)的整數(shù)；(2)5′Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3′，其中p為0或1；y為7、8或9并且z為1；或y為7并且z為2或3；r為0、1或2；以及q是表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+4)的整數(shù)；(3)5′m-N1-m-Nx-m-m-Nq-nr3′，其中x為8、9或10；r為0、1或2；以及q為表示過客鏈的長度減去(x+r+5)的整數(shù)；其中，各m獨立地是二環(huán)核苷酸或三環(huán)核苷酸；各n獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸，和當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外的核苷酸。
2.包含權(quán)利要求1的過客(有義)寡核苷酸和引導(反義)寡核苷酸的化學合成的 短干擾RNA，所述引導(反義)寡核苷酸具有15至30個核苷酸，與至少12個核苷酸的過客 (有義)寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域；引導鏈還與靶mRNA的至少一部分具有互補性。
3.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(1)，？為0，乂為10且1~為2。
4.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(1)，P為0，χ為9或11且r為2。
5.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(2)，ρ為0，y為9且r為2。
6.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中至少一個m具有結(jié)構(gòu)(a)、(b)或(c) 其中Rl和R2獨立地是O、S、CH2或NR，其中R是氫或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O, CH2-S, CH2-CH2, CH2-CH2-CH2, CH-CH 或 CH2-NR,其中 R 是氫或(^3-烷基；R4和R5獨立地是核苷間的連接、末端基團或保護基團； R4和R5中至少一個是核苷間的連接；和 B是核堿基、核堿基衍生物或核堿基類似物。
7.權(quán)利要求6的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(1)，P為0，χ為10，r為2，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中Rl是0，R2是O 且 R3 是 CH2。
8.權(quán)利要求6的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(1)，P為l，x為9或10，r為2，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中Rl是0，R2 是0且R3是CH2。
9.權(quán)利要求6的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸包含不依賴 于序列的修飾形式(3)，χ為9或10，r為2，并且各m具有結(jié)構(gòu)(a)，其中Rl是0，R2是0且 R3 是 CH20
10.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸和所述引導 (反義)寡核苷酸通過核苷酸環(huán)或連接體環(huán)共價連接，從而形成短發(fā)夾寡核苷酸。
11.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述SiRNA的各3'末端獨立地具有1 個、2個或3個核苷酸的懸突。
12.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中至少一個核苷間的連接不是磷酸二酯核 苷間連接。
13.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中所述化學合成的短干擾RNA進一步與靶 向細胞的配體結(jié)合。
14.權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA，其中用磷酸鹽/酯、Ch2-烷基、CH2-烷基胺、 CV12-烯基、C1^12-炔基、CV12-環(huán)烷基、C1^12-芳烷基、芳基、酰基或甲硅烷基取代基進一步衍 生5'末端。
15.包含權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA和生物學上可接受的載體的組合物。
16.包含權(quán)利要求2的化學合成的短干擾RNA和轉(zhuǎn)染劑的試劑盒。
17.使關(guān)于通過RNA干擾抑制靶基因表達的脫靶事件減少至最少的方法，該方法包括 將含有靶基因的細胞與足以減少脫靶事件同時保持效力的量的權(quán)利要求2的化學合成的 短干擾RNA接觸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述基因是內(nèi)源基因。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述接觸是含有所述細胞的細胞培養(yǎng)物或含有所述細胞 的組織與所述化學合成的短干擾RNA的體外接觸。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述接觸是含有所述細胞的組織、含有所述細胞的體液 或含有所述細胞的器官與所述化學合成的短干擾RNA的離體接觸。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述接觸是含有所述細胞的器官或動物與所述化學合成 的短干擾RNA的體內(nèi)接觸。
22.在通過RNA干擾抑制外源提供的靶基因的表達中使由過客鏈產(chǎn)生的切割減少至最 少的方法，該方法包括將含有所述靶基因的細胞與足以使過客鏈產(chǎn)生的切割減少至最少 同時保持引導鏈的效力的量的化學合成的短干擾RNA接觸，所述短干擾RNA包含過客(有義)寡核苷酸，其具有15至30個核苷酸的長度，并且包含如下的不依賴于序 列的修飾形式(1)、不依賴于序列的修飾形式(2)和不依賴于序列的修飾形式(3)中的一 個(1)5'Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ 為 O 或 1 ;x 為 7、8、9、10 或 11 ;r 為 O、1 或 2 ； 并且q是表示過客鏈的長度減去(p+x+r+4)的整數(shù)；(2)5‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ 為 O 或 l;y 為 7、8 或 9 并且 ζ 為 1;或 y 為7并且ζ為2或3 為0、1或2 ；并且q是表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+4)的整數(shù)；(3)5'm-Nrm-N.-m-m-N,-!!, 3'，其中 χ 為 8、9 或 10 ;r 為 O、1 或 2 ；并且 q 為表示過 客鏈的長度減去(x+r+5)的整數(shù)；其中各m獨立地是2'-修飾的核苷酸； 各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸； 各N獨立地是未修飾的核苷酸； 禾口引導(反義)寡核苷酸，其具有15至30個核苷酸，與至少12個核苷酸的過客(有義) 寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域；引導鏈還與靶mRNA的至少一部分具有互補性。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述2'-修飾的核苷酸的2'修飾包括H、溴、氯、碘、 氟、阿拉伯糖構(gòu)象中的氟(FANA)、SH、NH2, CN、疊氮化合物或OR、R、SR、NHR或N(R)2，其中R 是烷基、烯基、炔基、烷氧基、氧烷基、烷氧基烷基或烷基胺，其中烷基部分是C1-C6。
24.短干擾RNA，其包含過客(有義)寡核苷酸，其具有17至30個核苷酸的長度并且包含不依賴于序列的修 飾形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一個(4)5'mp-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中當 ρ 為 0 時，χ 為 12 ；當 ρ 為 1 時，χ 為 11 ；當 ρ 為 2 時，χ為10 ；當ρ為3時，χ為9 ；當ρ為4時，χ為8 ;r為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈的 長度減去(P+x+r+2)的整數(shù)；(5)5'm-m-Nx-m-Nq-nr3'，其中χ為11 ;r為0、1或2 ；以及q是表示過客鏈的長度減 去(x+r+3)的整數(shù)；(6)5 ‘ mp-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ為 3;y 為9并且ζ 為 l;r 為0、1 或2;以及 q為 表示過客鏈的長度減去(p+y+z+r+2)的整數(shù)；和引導(反義)寡核苷酸，其具有17至30個核苷酸，與至少12個核苷酸的過客(有義) 寡核苷酸連續(xù)互補的區(qū)域；引導鏈還與靶mRNA的至少一部分具有互補性； 其中各m獨立地是二環(huán)核苷酸、三環(huán)核苷酸或2'-修飾的核苷酸；各η獨立地是脫氧核苷酸、修飾的核苷酸或核糖核苷酸，且為懸突核苷酸；當m是二環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了二環(huán)核苷酸外的核苷酸，當m是三環(huán)核苷酸時，各N獨立地是除了三環(huán)核苷酸外的核苷酸，和當m是2' _修飾的核苷酸時，各N獨立地是除了 2' _修飾的核苷酸外的核苷酸。
25.權(quán)利要求24的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸具有不依賴于序列的修飾形式(4)，p為2，x為10，r為2， 各η是懸突核苷酸，并且各η獨立地是修飾的核苷酸，所述引導(反義)寡核苷酸包含2個3'-懸突修飾的核苷酸，和 各修飾的核苷酸獨立地是二環(huán)核苷酸、三環(huán)核苷酸或2'-修飾的核苷酸。
26.權(quán)利要求25的短干擾RNA，其中所述過客寡核苷酸的3'倒數(shù)第三個位點和3'倒 數(shù)第四個位點中的至少一個是修飾的核苷酸。
27.權(quán)利要求25的短干擾RNA，其中當長度為17個核苷酸時，所述引導寡核苷酸的位點2和3中的至少一個是修飾的核苷酸；當長度為18個核苷酸時，所述引導寡核苷酸的位點2、3和4中的至少一個是修飾的核 苷酸；當長度為19個核苷酸時，所述引導寡核苷酸的位點2、3、4和5中的至少一個是修飾的 核苷酸；當長度為20個核苷酸時，所述引導寡核苷酸的位點2、3、4、5和6中的至少一個是修飾 的核苷酸；和當長度為21-30個核苷酸時，所述引導寡核苷酸的位點2、3、4、5、6和7中的至少一個 是修飾的核苷酸。
28.權(quán)利要求24、25、26或27的短干擾RNA，其中所述過客(有義)寡核苷酸的至少一 個m具有結(jié)構(gòu)(a)、(b)或(c) 其中Rl和R2獨立地是O、S、CH2或NR，其中R是氫或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O、CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR,其中 R 是氫或 C1^-烷基；R4和R5獨立地是核苷間的連接、末端基團或保護基團； R4和R5中至少一個是核苷間的連接；和 B是核堿基、核堿基衍生物或核堿基類似物。
29.權(quán)利要求24、25、26或27的短干擾RNA，其中各修飾的核苷酸具有結(jié)構(gòu)(a) 其中Rl和R2獨立地是0、S、CH2或NR，其中R是氫或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O、CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR,其中 R 是氫或 C1^-烷基；R4和R5獨立地是核苷間的連接、末端基團或保護基團； R4和R5中至少一個是核苷間的連接；和 B是核堿基、核堿基衍生物或核堿基類似物。
30.包含權(quán)利要求24至29中任一項的短干擾RNA和生物學上可接受的載體的組合物。
31.在有此需要的受試者中減少關(guān)于通過RNA干擾抑制靶基因表達的脫靶事件的方 法，該方法包括將所述受試者與足以減少脫靶事件同時保持效力的量的權(quán)利要求25至30 的任一項的短干擾RNA接觸。
32.權(quán)利要求31的方法，其中接觸是通過血管內(nèi)注射的施用。
33.一種方法，其包括獲得權(quán)利要求26或27的短干擾RNA，其中各修飾的核苷酸具有結(jié)構(gòu)(a) 其中Rl和R2獨立地是O、S、CH2或NR，其中R是氫或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O, CH2-S, CH2-CH2, CH2-CH2-CH2, CH-CH 或 CH2-NR,其中 R 是氫或(^3-烷基；R4和R5獨立地是核苷間的連接、末端基團或保護基團； R4和R5中至少一個是核苷間的連接；和 B是核堿基、核堿基衍生物或核堿基類似物 禾口將所述短干擾RNA體內(nèi)施用至有此需要的受試者；其中在施用后，與缺乏修飾的核苷酸的短干擾RNA的量相比，體內(nèi)存在更大量的所述 短干擾RNA。
全文摘要
提供了siRNA的具有修飾核苷酸的修飾形式。本文中提供的具有修飾形式和修飾核苷酸的短干擾RNA在內(nèi)源基因的RNA干擾中減少脫靶效應。已證明另外的修飾形式化的siRNA對于富含核酸酶的環(huán)境是穩(wěn)定的。出人意料地，增加或保持鏈偏向性，雖然是保持內(nèi)源RNA干擾的效力所必需的，但不足以在細胞生物學測定中減少脫靶效應。
文檔編號C12N15/113GK101849008SQ200880113683
公開日2010年9月29日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者A·烏拉索夫, C·博內(nèi)特, I·查爾斯, N·普瑞, S·馬格達雷諾 申請人:應用生物系統(tǒng)有限公司