專利名稱：一種檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型的方法。
背景技術(shù)：
北京基因型菌株是一類具有相似遺傳背景的結(jié)核分枝桿菌。這類菌株的分布廣泛，在世界各地都有發(fā)現(xiàn)，是傳播更迅速、致病性更強(qiáng)、以及耐藥形成更容易的一類菌株。目前對(duì)于北京基因型的定義是指菌株在間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)指紋圖譜上表現(xiàn)為35—43的間隔區(qū)中至少有三個(gè)雜交條帶，而1一34的間隔區(qū)上有缺失的特異指紋圖譜。檢測北京基因型的方法主要是采用間隔區(qū)寡核苷酸分型法特異性擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因組中的間隔序列，根據(jù)上文提到的定義來判斷序列之間的間隔序列數(shù)目，達(dá)到分型的目的。該方法是鑒定北京基因型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但在處理大樣本時(shí)仍然是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的， 并且對(duì)于IS6110序列缺失的菌株無法進(jìn)行準(zhǔn)確分型。綜合迄今為止的各種分型方法，或者對(duì)樣本質(zhì)量要求非常高，或者操作較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)需要昂貴的儀器，或者結(jié)果分析繁重、費(fèi)用昂貴。因而一種全新，簡便，快速的檢測方法必然有著良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)北京基因型檢測方法耗時(shí)、復(fù)雜和昂貴的局限性，本發(fā)明提供一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的簡單、快速檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的方法。本發(fā)明提供的檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株的方法，是同時(shí)檢測AVJ^沙(191 位)A — C和7 ^ ^介(242位)G — C突變作為結(jié)核桿菌北京基因型分型的標(biāo)志。具體而言， 在結(jié)核分枝桿菌和Rv0444c的基因片段中，根據(jù)Rv262隊(duì)191位)A — C和Rv0444c (242位)G — C同時(shí)發(fā)生單核苷酸突變，則判定待檢菌株為北京基因型菌株。所述判定單核苷酸突變的方法為設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增Rv2629基因468bp片段，通過測序和序列比對(duì)可判定其191位核苷酸是否發(fā)生A — C突變；
同理，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增Rv0444c基因346bp片段，通過測序和序列比對(duì)可判定其242位核苷酸是否發(fā)生G — C突變；
首先對(duì)結(jié)核桿菌基因組進(jìn)行抽提，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌全基因組AVi^^、^V似《C基因的序列，設(shè)計(jì)測序弓丨物，擴(kuò)增基因片段。對(duì)于7( ^ 基因，擴(kuò)增片段為SEQ. ID. NO. 1;為 468bp ； 設(shè)計(jì)的測序引物為
SeUP PRIMER (63-81) 5’ CGACGACTCGCACGACACT 3’ (記為 SEQ. ID. NO. 3)
SeDOffN PRIMER (509-530) 5’ CAGTTCATTCGGATGGCTTCTT 3’ (記為 SEQ. ID. NO. 4)；Rv0444c 基因，擴(kuò)增片段為SEQ. ID. NO. 2 ；為;346bp ； 設(shè)計(jì)的測序引物為
SeUP PRIMER (133-151) 5’ AACGACGAAGTTCGAGCCG 3’ (記為 SEQ. ID. NO. 5)
SeDOffN PRIMER (457-479) 5’ ACATTGTTCATCACCAGCAGACC 3’ (記為 SEQ. ID. NO. 6)；
擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列分析。如果同時(shí)檢測到Rv2629 (191位)A — C和Rv0444c (242位)G — C突變，則確定該結(jié)核桿菌分枝為北京基因型分型。本方法中，通過PCR和基因測序鑒定了 TtVJ^沙基因的191位核苷酸發(fā)生A —C 突變，導(dǎo)致67位密碼子由GAT — GCT,其編碼的氨基酸產(chǎn)生Asp — Ala變異；同時(shí)鑒定了 Rv0444c基因的242位核苷酸發(fā)生G — C突變，導(dǎo)致81位密碼子由GAG — GAC,其編碼的氨基酸產(chǎn)生Glu —Asp變異。這兩種突變僅同時(shí)發(fā)生于結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株中，而未見于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)菌株和非北京型菌株中。本發(fā)明所提供的兩個(gè)基因在結(jié)核分枝桿菌中有很好的穩(wěn)定性，通過基因擴(kuò)增和序列比對(duì)分析檢測單核苷酸突變，不僅操作簡便、費(fèi)用低廉，而且檢測時(shí)間短、靈敏度高，在普通臨床實(shí)驗(yàn)室就可完成，適于在臨床或者科學(xué)研究中對(duì)結(jié)核桿菌菌株北京基因型的快速分型鑒定。本發(fā)明可以準(zhǔn)確快速地開展結(jié)核桿菌北京基因型分型，為臨床結(jié)核病的診斷、治療，以及實(shí)驗(yàn)室開展結(jié)核病相關(guān)科研工作提供靈敏、快速、簡單易行的方法。經(jīng)查新無相關(guān)報(bào)道。


圖1為RV2629、RV0444C基因擴(kuò)增片段電泳結(jié)果。圖2為基因191A/C突變(箭頭所示)。圖3為Rv0444c基因M2 G/C突變(箭頭所示)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本方法。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本方法而不用于限制本方法的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本方法講述的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本方法作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)條件均采用常規(guī)操作方法，菌株基因組提取參照上海華舜公司試劑盒使用說明，在消化時(shí)間等方面略作修改，將溶菌酶(Lysozyme)和RNA酶(RNaseA) 37°C溫浴時(shí)間從0. 5小時(shí)延長至4小時(shí)，以保證完全裂解結(jié)核分枝桿菌的過厚細(xì)胞壁。根據(jù)GENEBANK上各基因的序列，采用OLIGO 6. 0軟件設(shè)計(jì)測序引物，MRv2629、 Rv0444c基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，電泳結(jié)果見圖 1。采用 PCR純化試劑盒(QIAquick column PCR purification kit, QIAGEN)純化后，送上海生工生物技術(shù)公司/北京奧科生物技術(shù)有限公司上海分公司測序，使用ABI377 (Applied Biosystems, Inc.)自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列分析。結(jié)果與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)。Rv2629基因191A/C突變見圖2 ；Rv0444c基因M2 G/C突變見圖3。經(jīng)比對(duì)和分析，兩個(gè)基因的SNPs與結(jié)核分枝桿菌北京型的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，增加菌株的收集和基因測序量。對(duì)菌株的Rv0444c基因和Rv2629基因的序列進(jìn)行測定，在64株北京型結(jié)核分枝桿菌菌株中，59株同時(shí)出現(xiàn)了 Rv2629沙基因191A/C和Rv0444c基因242G/C 突變，突變率達(dá)92. 2%;而9株非北京型菌株中兩個(gè)基因同時(shí)突變的頻率僅為11. 1%(1/9)， 具體位點(diǎn)的突變率見表1。表1不同菌株中Rv2629、Rv0444c單核苷酸突變檢測結(jié)果(+代表發(fā)生突變；-代表未發(fā)生突變)。
權(quán)利要求
1.一種檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型的方法，其特征在于，在結(jié)核分枝桿菌AVi^^和 Rv0444c的基因片段中，根據(jù)TtVi^沙(191位)A — C ^PRv0444c (242位)G — C同時(shí)發(fā)生單核苷酸突變，判定待檢菌株為北京基因型菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型的方法，其特征在于，具體操作步驟為根據(jù)結(jié)核分枝桿菌全基因組AVi^^、WW^介基因的序列，設(shè)計(jì)測序引物，擴(kuò)增基因片段對(duì)于TtVi^沙基因，擴(kuò)增片段為SEQ. ID. NO. 1;為468bp ； 設(shè)計(jì)的測序引物為SeUP PRIMER 5’ CGACGACTCGCACGACACT 3’ SeDOffN PRIMER 5’ CAGTTCATTCGGATGGCTTCTT 3’Rv0444c 基因，擴(kuò)增片段為SEQ. ID. NO. 2 ；為;346bp ； 設(shè)計(jì)的測序引物為SeUP PRIMER5’ AACGACGAAGTTCGAGCCG 3’SeDOffN PRIMER 5’ ACATTGTTCATCACCAGCAGACC 3’ 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列分析；如果同時(shí)檢測到沙基因的191位A — C突變和TtV似《C基因242位G — C突變， 則確定該結(jié)核桿菌分枝為北京基因型分型。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種檢測結(jié)核分枝桿菌北京基因型的方法。本發(fā)明通過基因擴(kuò)增和序列比對(duì)分析，檢測Rv2629基因191位核苷酸A/C和Rv0444c基因242位核苷酸G/C突變，如果Rv2629和Rv0444c基因同時(shí)發(fā)生單堿基置換突變，則判定待檢菌株為結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株。與其它區(qū)分北京基因型的方法相比，本方法具有操作簡便，費(fèi)用低廉，檢測時(shí)間短，適于在臨床或者科學(xué)研究中對(duì)結(jié)核桿菌菌株的快速分型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154492SQ20111005547
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉巖巖, 劉鼎乾, 張敬, 張鷺, 徐亦薇, 王文婕, 王洪海, 胡鼎, 麥俊滔 申請人:復(fù)旦大學(xué)