專利名稱：一種篩選腫瘤化療增敏劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種篩選腫瘤化療增敏劑的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤化療失敗，90%以上的原因是腫瘤細(xì)胞對腫瘤藥物產(chǎn)生了抗性而導(dǎo)致的，也就是腫瘤細(xì)胞的多藥抗藥性((multidrug resistance, MDR))。決定腫瘤抗藥性的因素有多種可能，其中最重要的是腫瘤細(xì)胞會把藥物快速地運出細(xì)胞，使藥物在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的滯留時間縮短，大大降低藥物的作用效果。承擔(dān)藥物運輸?shù)闹饕褪歉鞣N運輸通道蛋白(transporter),包括向細(xì)胞內(nèi)(uptake)和向細(xì)胞外(efflux)運輸?shù)膬深愡\輸通道蛋白。前者把抗腫瘤藥物運進(jìn)細(xì)胞,后者把藥物運出細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞通過大量表達(dá)將藥物運出的運輸?shù)鞍?ABC運輸?shù)鞍?ATP-binding cassette運輸?shù)鞍?的方式,來降低細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度,從而產(chǎn)生抗藥性。因此ABC運輸?shù)鞍资切碌乃幬锇悬c。這類蛋白有48個成員，其中對MDRl、MPR1和BCRP的研究顯示，這三個蛋白的過量表達(dá)和癌細(xì)胞的抗藥性緊密相關(guān)，是腫瘤抗藥現(xiàn)象最常見的機制。這些發(fā)現(xiàn)，為癌癥治療藥物的研發(fā)提供了一個新的方向抑制MDRUMPR1和BCRP等通道蛋白的活力，使化療藥物可以滯留在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的抗藥性。總體說來，提高化療藥物的療效，降低其毒副反應(yīng)是根治腫瘤的重要措施。因此，低毒高效的化療增敏劑具有廣泛的應(yīng)用前景，加快化療增敏劑的開發(fā)和研究將會為腫瘤治愈帶來新的希望。目前篩選針對運輸?shù)鞍椎幕熢雒魟┑姆椒?，主要采用的是實驗篩選的方案。MDRU MPRl和BCRP是最重要化療增敏劑類藥物靶點，它們都是多次跨膜結(jié)構(gòu)，功能和三維結(jié)構(gòu)都很復(fù)雜?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬藥物篩選不適用于這類蛋白，所以主要采用的是實驗篩選的方案。目前的實驗篩選都采用了一個基本的原則當(dāng)候選化合物抑制了MDRl等蛋白的活力，那么抗腫瘤藥物可以在更低的濃度或者更短的時間里殺死腫瘤細(xì)胞。所以采取的是直接觀察腫瘤細(xì)胞死亡過程，來評價候選化合物的效果?；境绦蚴窍确蛛x、培養(yǎng)MDRl等蛋白過量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，加入抗腫瘤藥物，同時加入候選化合物，如果MDRl等目標(biāo)蛋白對候選化合物敏感、活力降低或喪失，那么可以觀察到腫瘤細(xì)胞的死亡；作為對照，不加入化合物或者加入對MDRl等目標(biāo)蛋白無作用的化合物，同樣濃度下抗腫瘤藥物不會殺死腫瘤細(xì)胞。類似的方案已經(jīng)沿用多年，但是這些方法都存在缺陷1)需要培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞來針對性篩選；2)觀察腫瘤細(xì)胞死亡耗費時間和精力；3)無法選取指標(biāo)或參數(shù)來實現(xiàn)大規(guī)模篩選。這幾個缺陷，導(dǎo)致針對MDRl等靶點蛋白的藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，至今還沒有一個相關(guān)藥物由FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。要克服這些缺陷，需要新的方案來實現(xiàn)大通量篩選，從海量的化合物庫中找到好的候選化合物。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對傳統(tǒng)的篩選化療增敏劑的方法存在耗時、費精力、難以大規(guī)模篩選的缺陷，提供一種更簡單、明了、易于實現(xiàn)大通量篩選的新的篩選化療增敏劑的方法。本發(fā)明提供一種篩選腫瘤化療增敏劑的方法，包括以下步驟a)讓候選化合物和細(xì)胞接觸；b)加入線狀病毒(Filoviridae)感染細(xì)胞；c)測量線狀病毒對細(xì)胞的感染。本發(fā)明中，步驟a)所述的細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)來源于靈長類MDRl的細(xì)胞。本發(fā)明中，步驟a)所述的候選化合物較佳的是現(xiàn)有的組合化合物庫或者天然產(chǎn)物庫，如從中草藥中提取和分離天然化合物庫。本發(fā)明中，步驟b)所述的線狀病毒(Filoviridae)，優(yōu)選埃博拉病毒(ZaireEbolavirus請給出拉丁名)和/或馬爾堡病毒(Marburgvirus)。本發(fā)明中，步驟b)所述的病毒優(yōu)選假病毒。較佳的，假病毒的衣殼蛋白(ENV)來自線狀病毒屬(Filoviridae)，基因組中包含有報告基因。所述的報告基因可以是本領(lǐng)域常規(guī)的報告基因，優(yōu)選熒光素酶或者熒光蛋白的編碼基因。本發(fā)明中，步驟c)所述的測量線狀病毒對細(xì)胞的感染的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，較佳的，通過測量重組假病毒表達(dá)的熒光素酶的活力或者熒光蛋白的熒光強度來表征病毒對細(xì)胞的感染。本發(fā)明所述的方法優(yōu)選所有加樣過程由機械臂完成的高通量的方法，可以實現(xiàn)高通量、大規(guī)模的篩選。本發(fā)明的方法篩選到的化合物抑制線狀病毒的感染細(xì)胞，同時這些化合物也是腫瘤化療增敏劑/或ABC運輸?shù)鞍滓种苿１景l(fā)明中，所述的“腫瘤化療增敏劑”是指促進(jìn)化療藥物滯留在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的抗藥性的藥物。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖I是MDRl的表達(dá)水平降低對線狀病毒感染力的影響。圖2是腫瘤細(xì)胞中MDRl的表達(dá)水平和線狀病毒感染力之間的關(guān)系。其中，2A是MCF7 細(xì)胞；2B 是 MDA-MB-231 細(xì)胞。圖3是MDRl的抑制劑對線狀病毒感染力的影響。其中，3A是3. 5 μ Mcompound C對線狀病毒感染力的影響；38是7511|1 Verapamil對線狀病毒感染力的影響；3(是2(^皿cyclosporinA對線狀病毒感染力的影響。
具體實施方式
本發(fā)明人經(jīng)過仔細(xì)研究和反復(fù)試驗，驚喜的發(fā)現(xiàn)化合物直接抑制MDR(多藥抗藥性，multidrug resistance)相關(guān)蛋白的活性時，也同時抑制線狀病毒的入侵。因此,本發(fā)明人利用這種相關(guān)性，選取化合物對病毒入侵的抑制作用為指標(biāo)來篩選腫瘤化療增敏劑，經(jīng)過反復(fù)試驗論證，終于得到了一種簡單、能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的篩選腫瘤化療藥物增敏劑的方法，從而完成了本發(fā)明。一、線狀病毒入侵過程和MDR具有相關(guān)性
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在線狀病毒侵入的多種細(xì)胞中，包括來自狗、豬、嚙齒和靈長類等的細(xì)胞，當(dāng)MDRl蛋白的活性受到抑制或者在細(xì)胞中的數(shù)量減少，線狀病毒入侵該細(xì)胞的能力也會相應(yīng)地下降。一個例子是在人源細(xì)胞293T的感染實驗中，當(dāng)用shRNA來降低MDRl的表達(dá)后，埃博拉病毒和馬爾堡病毒對細(xì)胞的入侵能力都明顯下降，見圖I。另外一個突出的例子是采用MDRl表達(dá)或活性缺陷的細(xì)胞系，MCF7和MDA-MB-231。該兩株細(xì)胞有個共同點是MDRl表達(dá)很低的乳腺癌細(xì)胞系，對腫瘤化療藥物阿霉素敏感。實驗證實，埃博拉病毒和馬爾堡病毒不能很好的入侵這兩株細(xì)胞；然而在外源引入MDRl的表達(dá)后，兩株細(xì)胞對阿霉素敏感度下降，與此同時，埃博拉病毒和馬爾堡病毒對細(xì)胞的入侵能力也大幅度上升(見圖2A、2B，和表I)。在這兩個例子中，作為對照，MDRl蛋白活性的變化并不會明顯影響到其他病毒，如VSV和LCMV對細(xì)胞的入侵能力(見圖1、2)。因此，線狀病毒入侵細(xì)胞過程和MDRl的活性間存在相關(guān)性。二、線狀病毒的感染能力和MDRl的表達(dá)及活力密切相關(guān)本發(fā)明人選取了多個經(jīng)證實的MDRl抑制劑，包括compound C、VerapamiI和cyclosporinA均成功抑制了線狀病毒對細(xì)胞的感染，但是陰性對照病毒VSV，LCMV不受影響(見圖3)。因此，線狀病毒的感染能力和MDRl的表達(dá)及活力密切相關(guān)，表明線狀病毒對細(xì)胞侵染力的變化可以作為篩選MDRl等蛋白抑制劑的表觀指標(biāo)。三、利用線狀病毒對細(xì)胞侵染力的變化來篩選腫瘤化療增敏劑的方法本發(fā)明以線狀病毒對細(xì)胞侵染力的變化作為表觀指標(biāo)，篩選MDRl等蛋白抑制劑，包括以下步驟a)培養(yǎng)細(xì)胞；b)讓候選化合物和細(xì)胞接觸；c)加入病毒液,讓病毒感染細(xì)胞；d)測量病毒對細(xì)胞的感染。本發(fā)明中，所述的病毒為線狀病毒，優(yōu)選埃博拉病毒和/或馬爾堡病毒。線狀病毒屬是負(fù)鏈RNA病毒，侵染靈長動物。未經(jīng)改造的線狀病毒會引起病毒性出血熱，但是為了研究這類病毒的入侵過程，可以只取出該類病毒衣殼蛋白的編碼基因，和去除本身衣殼蛋白的其他病毒的編碼基因共同在宿主中表達(dá)，從而得到不具有傳染能力的假病毒。這種重新包裝得到的假病毒，在病毒的外部結(jié)構(gòu)上只保留了作為研究對象的衣殼蛋白，沒有復(fù)制和傳染能力，可以在普通實驗室里操作使用。因此，本發(fā)明中所述的病毒優(yōu)選假病毒。本發(fā)明中，包裝好的假病毒較佳的帶有熒光素酶或者熒光蛋白基因，在完成入侵細(xì)胞后，攜帶的熒光素酶或者熒光蛋白基因在細(xì)胞中表達(dá)，可以在10-15小時后通過熒光信號自動檢測和計算出病毒侵染的能力。通過測量酶或蛋白的熒光強度來表征化合物對病毒入侵細(xì)胞的抑制，利用這種抑制作用來反映這種化合物作為腫瘤化療藥物增敏劑的潛力。剔除假陽性后即得到有真實效果的候選化合物。
傳統(tǒng)的篩選MDRl等蛋白抑制劑的方案，采用直接觀察的方法。在實驗流程上，往MDRl過量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，同時加入抗腫瘤藥物和候選的抑制MDRl活力的化合物。在藥物作用20-150小時后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定藥物的細(xì)胞毒性、計算耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)等。該方法需要長時間觀察腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)，監(jiān)測細(xì)胞生長曲線的方法耗費時間、人力和物力，無法實現(xiàn)高通量，而且假陽性率高、確認(rèn)程序繁瑣；更重要的是當(dāng)面對一個10萬級的化合物庫時，采用這種傳統(tǒng)方案，資源消耗會呈指數(shù)增加，代價非常高昂，所以只能在實驗室或者小規(guī)模水平的篩選中應(yīng)用。本發(fā)明和傳統(tǒng)方法相比較而言，I)不需要培養(yǎng)特定的腫瘤細(xì)胞；2)不需要加入抗腫瘤藥物，只需要加入候選的MDRl抑制劑；3)不需要殺死細(xì)胞，如果候選化合物有細(xì)胞毒性，可以直接被淘汰；4)不需要長時間觀察，8-10小時后可以看結(jié)果；5)最重要的是，由于病毒入侵藥物篩選已經(jīng)實現(xiàn)自動化，利用自動加樣臂系統(tǒng)，采用這種流程，每天可以完成1-5萬化合物的篩選。細(xì)胞生長狀態(tài)觀察和病毒感染力檢測，這兩種方法的比較在表中列出 (見表2)。 表I. MDRl的表達(dá)水平、腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性和線狀病毒感染力之間的關(guān)系
權(quán)利要求
1.一種篩選腫瘤化療增敏劑的方法，其特征在于，包括以下步驟 a)讓候選化合物和細(xì)胞接觸； b)加入線狀病毒(Filoviridae)感染細(xì)胞； c)測量線狀病毒對細(xì)胞的感染。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的細(xì)胞是表達(dá)來源于靈長類MDRl的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的候選化合物是現(xiàn)有的組合化合物庫或者天然產(chǎn)物庫。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的線狀病毒是埃 博拉病毒(Ebolavirus)和/或馬爾堡病毒(Marburgvirus)。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的線狀病毒是假病毒。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項所述的方法，其特征在于，所述的假病毒的衣殼蛋白中包含有熒光素酶或者熒光蛋白。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項所述的方法，其特征在于，步驟c)所述的測量線狀病毒對細(xì)胞的感染的方法通過測量重組假病毒表達(dá)的熒光素酶或者熒光蛋白的熒光強度來表征病毒對細(xì)胞的感染。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項所述的方法，其特征在于，所述的方法是所有加樣過程由機械臂完成的高通量的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選腫瘤化療增敏劑的方法，包括以下步驟a)讓候選化合物和細(xì)胞接觸；b)加入線狀病毒(Filoviridae)感染細(xì)胞；c)測量線狀病毒對細(xì)胞的感染。本發(fā)明利用候選化合物直接抑制多藥抗藥性(multidrug resistance，MDR)相關(guān)的運輸通道蛋白的活性時，也同時會抑制病毒的入侵的特點，選取化合物對病毒入侵的抑制為指標(biāo)來篩選腫瘤化療藥物增敏劑，這種基于病毒感染的藥物篩選方法，簡單(以病毒感染為參數(shù))，快速(10小時后，可以得到結(jié)果)，高通量(每天可以完成1-5萬化合物的篩選)。
文檔編號C12Q1/02GK102653781SQ201110050419
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者李琦 申請人:李琦