專利名稱：鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒傳統(tǒng)毒株和高致病毒株的熒光pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了ー種鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒傳統(tǒng)毒株和高致病毒株的熒光PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
豬繁通與呼吸系統(tǒng)綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱“藍(lán)耳病”，是ー種由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道征狀，以及高死亡率為特征的高度接觸性傳染病。1987年該病首次爆發(fā)于美國(guó)，世界各國(guó)也相繼呈流行性感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。該病于2006年在我國(guó)大部分省份開(kāi)始流行起來(lái)，即所謂的“豬無(wú)名高熱”，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。PRRSV的變異分為基因組變異和抗原性變異兩類，PRRSV的nsp2(非結(jié)構(gòu)蛋白)基 因具有非常高的變異性，如HB-2株和MN184株在該區(qū)分別缺失了 12個(gè)和100多個(gè)氨基酸，spl84212株則在該區(qū)插入了 30多個(gè)氨基酸。從我國(guó)患病豬體內(nèi)提取到的高致病性PRRSV進(jìn)行全基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)在nps2基因片段存在約80個(gè)堿基序列的缺失，推測(cè)nsp2基因缺失為高致病性PRRSV的毒力增強(qiáng)的重要原因。傳統(tǒng)的PCR方法不能對(duì)樣品進(jìn)行精確的定量測(cè)定，并且在時(shí)效性上存在一定的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種根據(jù)PRRSV變異毒株在nsp2存在86個(gè)堿基的缺失這ー特點(diǎn)建立ー種利用熒光PCR方法快速檢測(cè)nsp2基因缺失變異毒株的方法，具有操作方便、敏感性強(qiáng)、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明實(shí)施例采取的技術(shù)方案是鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒傳統(tǒng)毒株和高致病毒株的熒光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟(I)準(zhǔn)備材料提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-Hl和傳統(tǒng)株TJ-H3的nsp2基因的質(zhì)粒TJ-Hlnsp2-T 和 TJ-H3 nsp2_T，并提取該質(zhì)粒的 DNA ；(2)設(shè)計(jì)引物運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-Hl與傳統(tǒng)株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他株P(guān)RRSV的nsp2基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出缺失部分的核苷酸序列和所有參與比對(duì)的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守區(qū)域，利用Primer Premier5. 0引物設(shè)計(jì)軟件,在缺失區(qū)域上游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條上游引物nsp2-l,在缺失區(qū)域設(shè)計(jì)一條下游引物lnsp2-2,在缺失區(qū)域下游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條下游引物2nsp2-3 ；(3) PCR反應(yīng)體系及其反應(yīng)程序和參數(shù)的優(yōu)化
分別以TJ-Hl nsp2-T和TJ-H3 nsp2_T質(zhì)粒DNA為模板，對(duì)退火溫度、循環(huán)次數(shù)、弓丨物濃度及雙重PCR反應(yīng)中三條引物的最佳濃度配比進(jìn)行優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)的最佳條件；(4)檢測(cè)最佳PCR反應(yīng)條件下的PCR反應(yīng)特異性和敏感性利用步驟(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)的最佳條件，以TJ-Hlnsp2-T和TJ-H3nsp2_T質(zhì)粒DNA為模板，各自分別用nsp2-l，nsp2-2引物對(duì)、nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)和nsp2-l，nsp2-2，nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，確定PCR反應(yīng)的特異性；將TJ-Hlnsp2-T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為模板，各自用nsp2-l，nsp2-3
引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增；以及，將TJ-H3 nsp2-T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為模板，各自分別用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)、nsp2_l，nsp2_2，nsp2_3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，確定PCR反應(yīng)的靈敏性。(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time FQ-PCR)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線利用步驟(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的TJ-H3 nsp2_T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋作為模板，各自用nsp2-l，nsp2-2引物對(duì)、nsp2_l，nsp2_3引物對(duì)和nsp2_l，nsp2-2,nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；以及將已知拷貝數(shù)的TJ-Hl nsp2_T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋作為模板，各自用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的程序和參數(shù)為95°C 10min，l個(gè)循環(huán)；95°C 15s，57°C 45s，40個(gè)循環(huán)，得到相應(yīng)的熔解曲線，最后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(橫坐標(biāo))對(duì)PCR反應(yīng)的Ct值(縱坐標(biāo))作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)未知樣品的檢測(cè)用總RNA提取試劑(Trizol試劑)提取待測(cè)樣品細(xì)胞的總RNA，焦碳酸こニ酯(DEPC)水(Iwt^ )溶解后置-40°C冰箱備用；以該總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行SYBR Green (核苷酸膠體染料，分子式為C32H37IN4S)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)的程序和參數(shù)為95°C lOmin，I個(gè)循環(huán)；95°C 15s，57°C 45s，40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)結(jié)果與(5)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，并根據(jù)其熔解曲線鑒別該樣本是否為PRRSV高致病性毒株TJ-Hl。上述步驟⑵中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. I所示；缺失部分上游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 2所示；缺失部分下游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 3所示；擴(kuò)增的引物如下上游引物nsp2-l的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 4所示CCTAACGGTTGGGAAGATTT GACTG ；下游引物lnsp2-2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 5所示CCACC TGCTGAAATTTGTGT CGC ；下游引物2nsp2-3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 6所示ACACAGGTGCAGGGT TGATG TCATT。進(jìn)ー步分別以TJ-Hlnsp2-T和TJ-H3 nsp2_T質(zhì)粒DNA為模板，對(duì)退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物濃度及雙重PCR反應(yīng)中三條引物的最佳濃度配比等進(jìn)行優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)的最佳條件，其中，50iiL PCR反應(yīng)體系為10 X Buffer (含MgCl2 25mM) 5 y L，模板DNAI V- L(3copies/ u L)，上游引物(25pmol/ u L) I u L,下游引物(25pmol/ u L) I u L, dNTPs (姆種10mmol/L) I ii L，TaqDNA聚合酶(2. 5M/y L) I y L，雙蒸水補(bǔ)至50 y L ;雙重PCR反應(yīng)的50 ii L反應(yīng)體系為上游引物(25pmol/U L) I y L，下游引物I (25pmol/uL)0. 5uL, T游引物2(25 11101/11し)111し其他同上；反應(yīng)程序和參數(shù)為94°C 3min，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s，55°C 30s, 72°C 30s，共 5 個(gè)循環(huán)；94で 40s, 57°C 30s, 72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72で 8min, I個(gè)循環(huán)；4°C 3min。本發(fā)明實(shí)施例的有益效果是本發(fā)明根據(jù)PRRSV基因變異毒株的nsp2基因缺失了86個(gè)堿基的這ー特點(diǎn)建立ー種利用熒光定量PCR方法快速檢測(cè)該變異毒株的方法，敏感性高于常規(guī)PCR。建立的SYBR Green熒光定量PCR方法比傳統(tǒng)PCR方法在靈敏度、準(zhǔn)確性、時(shí)效性等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可滿足臨床上簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確進(jìn)行區(qū)分鑒定的要求。


圖I是TJ-Hl和TJ-H3的nsp2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的I. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是梯度稀釋的TJ-H3 nsp2_T質(zhì)粒DNA的nsp2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的I. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3是梯度稀釋的TJ-Hl nsp2-T質(zhì)粒DNA的nsp2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的I. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4是梯度稀釋的TJ-H3nsp2-T質(zhì)粒DNA的nsp2基因雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5a 是 TJ-H3 nsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l 和 nsp2-3 引物對(duì)的 SYBR Green 熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5b 是 TJ-H3nsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l 和 nsp2_3 引物對(duì)的 SYBR Green 熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖6a 是 TJ-H3nsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l 和 nsp2_2 引物對(duì)的 SYBR Green 熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6b 是 TJ-H3nsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l 和 nsp2_2 引物對(duì)的 SYBR Green 熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖7a 是 TJ-Hlnsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l 和 nsp2-3 引物對(duì)的 SYBR Green 熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖幾是TJ-Hlnsp2-T質(zhì)粒DNA加入nsp2_l和nsp2-3引物對(duì)的SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖 8a 是 TJ-H3nsp2_T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l、ns p2~2 和 nsp2-3 引物對(duì)的 SYBRGreen熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖 8b 是 TJ-H3nsp2-T 質(zhì)粒 DNA 加入 nsp2_l、ns p2_2 和 nsp2_3 引物對(duì)的 SYBRGreen熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖9a是12株P(guān)RRSV抗體陽(yáng)性樣本的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入nsp2_l和nsp2_3引物對(duì)的SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線；圖9b是12株P(guān)RRSV抗體陽(yáng)性樣本的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入nsp2_l和nsp2_3引物對(duì)的SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線。圖 I 中的 M 為 DGL 2000Marker, 1-6 泳道分別為 TJ-H3nsp2_T DNA+nsp2_l、nsp2_2 ；TJ-H1 nsp2_T DNA+nsp2_l、nsp2_2 ;TJ_H3 nsp2_T DNA+nsp2_l、nsp2_3 ;TJ_H1nsp2-TDNA+nsp2_l、nsp2_3 ;TJ_H3 nsp2_T DNA+nsp2_l、nsp2_2 和 nsp2_3 ;TJ_H1 nsp2_TDNA+nsp2-l、nsp2_2和nsp2_3 ;7泳道為陰性對(duì)照(I y L上游引物，I y L下游引物，5uL10XBuffer(*MgCl225mM)，IuL (各 10mmol/L) dNTPs, IuL (2. 5U/uL) TaqDNA 聚合酶，雙蒸水補(bǔ)至50 u L) o
圖2中的M為DGL 2000Marker, 1-7泳道分另I」為KT1-KT7稀釋的TJ-H3nsp2-T DNA+nsp2-l、nsp2_3 ；8泳道為陰性對(duì)照(I U L上游引物，I y L下游引物，5uL10XBuffer(*MgCl225mM)，IuL (各 10mmol/L) dNTPs, IuL (2. 5U/uL) TaqDNA 聚合酶，雙蒸水補(bǔ)至50 u L) o圖3 中 M 為 DGL 2000Marker，1-6 泳道分別為 KT3-KT8 稀釋的 TJ-Hlnsp2-T DNA+nsp2-l、nsp2_3 ;7泳道為陰性對(duì)照(I U L上游引物，I y L下游引物，5uL10 X Buffer (含 MgCl225mM)，IuL (各 10mmol/L) dNTPs, IuL (2. 5U/uL) TaqDNA 聚合酶，雙蒸水補(bǔ)至50 u L) o圖4 中 M 為 DGL 2000Marker,ト6 泳道分別為 KT3-KT8 稀釋的 TJ-H3 nsp2_TDNA+nsp2-l、nsp2_2和nsp2_3 ；0泳道為陰性對(duì)照(IuL上游引物，0. 5uL下游游引物1，I u L 下游引物 2，5uL 10 X Buffer (含 MgCl225InM)，IuL (各 10mmol/L) dNTPs, IuL (2. 5U/uL)TaqDNA聚合酶,雙蒸水補(bǔ)至50 ii L)。圖5a 和圖 5b 中 R2 = 99. 48% ；圖6a 和圖乩中 R2 = 99. 77% ；圖7a 和圖 7b 中 R2 = 99. 79% ；圖8a 和圖 8b 中 R2 = 99. 60% ；圖5a、圖6a、圖7a和圖8a中橫坐標(biāo)為L(zhǎng)og (模板中拷貝數(shù))，縱坐標(biāo)為Ct值；圖5b、圖6b、圖7b、圖8b和圖9b中橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光量；圖9a中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。I、準(zhǔn)備材料I. I質(zhì)粒和毒株已克隆了 PRRSV高致病性毒株TJ-Hl和傳統(tǒng)株TJ-H3的nsp2基因的質(zhì)粒(TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2_T)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(已發(fā)表在“動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展”，2010年第31期，論文題為“PRRSV天津分離株Nsp2基因的克隆和遺傳進(jìn)化分析”，并可向公眾提供該兩種質(zhì)粒)，Genbank 登錄號(hào)分別為 GQ923891、GQ923892、GQ923893 (GQ923891、GQ923892 為高致病性毒株TJ-Hl，并且同源性達(dá)到100% ;GQ923893為傳統(tǒng)株TJ-H3)。豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒抗體陽(yáng)性血清12份由天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。I. 2儀器和試劑高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自力康公司，AppliedBiosystems 7500 Fast Real-Time PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司。Trizol試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司，反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自杭州博日科技公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物公司，引物由北京奧科生物公司合成。
2、方法2. I引物的設(shè)計(jì)運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)nsp2基因缺失株TJ-Hl與傳統(tǒng)株TJ-H3的nsp2基因核苷酸序列(該核苷酸序列可在Genebank中查到，登錄號(hào)分別為GQ923891、GQ923892和GQ923893)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他PRRSV株的nsp2基因序列比對(duì)，找出缺失部分的核苷酸序列和所有參與比對(duì)的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守區(qū)域，利用Primer Premier5. 0引物設(shè)計(jì)軟件，在缺失部分上游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條上游引物nsp2-l，在缺失部分設(shè)計(jì)一條下游引物nsp2-2，在缺失部分下游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條下游引物nsp2-3。其中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. I所示；缺失部分上游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 2所示；缺失部分下游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 3所示；三條擴(kuò)增引物的序列如下表所示 表I三條引物核苷酸序列
權(quán)利要求
1.鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒傳統(tǒng)毒株和高致病毒株的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)準(zhǔn)備材料 提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-Hl和傳統(tǒng)毒株TJ-H3的nsp2基因的質(zhì)粒TJ-Hlnsp2-T 和 TJ-H3 nsp2_T，并提取該質(zhì)粒的 DNA ； (2)設(shè)計(jì)引物 運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-Hl與傳統(tǒng)株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他株P(guān)RRSV的nsp2基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出缺失部分的核苷酸序列和所有參與比對(duì)的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守區(qū)域，利用Primer Premier5. O引物設(shè)計(jì)軟件,在缺失區(qū)域上游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條上游引物nsp2-l,在缺失區(qū)域設(shè)計(jì)一條下游引物lnsp2-2,在缺失區(qū)域下游的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條下游引物2nsp2-3 ； (3)PCR反應(yīng)體系及其反應(yīng)程序和參數(shù)的優(yōu)化 分別以TJ-Hl nsp2-T和TJ-H3 nsp2_T質(zhì)粒DNA為模板，對(duì)退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物濃度及雙重PCR反應(yīng)中三條引物的最佳濃度配比進(jìn)行優(yōu)化，確定PCR反應(yīng)的最佳條件； (4)檢測(cè)最佳PCR反應(yīng)條件下的PCR反應(yīng)特異性和敏感性 利用步驟(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)的最佳條件，以TJ-Hlnsp2-T和TJ-H3nsp2_T質(zhì)粒DNA為模板，各自分別用 nsp2-l,nsp2_2 引物對(duì)、nsp2-l,nsp2_3 引物對(duì)和 nsp2-l,nsp2-2,nsp2_3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，確定PCR反應(yīng)的特異性； 將TJ-Hlnsp2-T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為模板，各自用nsp2_l，nsp2_3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增；以及將TJ-H3 nsp2-T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后作為模板，各自分別用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)、nsp2_l，nsp2_2，nsp2_3引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，確定PCR反應(yīng)的靈敏性； (5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用步驟(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的TJ-H3nsp2-T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋作為模板，各自分別用nsp2-l, nsp2-2引物對(duì)、nsp2_l, nsp2_3引物對(duì)和nsp2_l,nsp2-2, nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；以及將已知拷貝數(shù)的TJ-Hlnsp2_T質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋作為模板，各自用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的程序和參數(shù)為95°C 10min，l個(gè)循環(huán)；95°C 15s，57°C 45s，40個(gè)循環(huán)，得到相應(yīng)的熔解曲線，最后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制； (6)未知樣本的檢測(cè) 用總RNA提取試劑提取待測(cè)樣本細(xì)胞的總RNA，焦碳酸こニ酯水溶解后置-40°C冰箱備用，以該總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用步驟(3)優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，用nsp2-l，nsp2-3引物對(duì)進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)的程序和參數(shù)參數(shù)為950C 10min，l個(gè)循環(huán)；95°C 15s，57°C 45s，40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)結(jié)果與步驟(5)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，并根據(jù)其熔解曲線鑒別該樣本是否為PRRSV高致病性毒株TJ-Hl。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. I所示；缺失部分上游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 2所示；缺失部分下游的高度保守區(qū)域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 3所示；擴(kuò)增所用的引物如下上游引物nsp2-l的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 4所示； 下游引物lnsp2-2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 5所示 下游引物2nsp2-3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(3)的PCR反應(yīng)的最佳條件如下50iiL PCR反應(yīng)體系為10\8ばデ61'(含1%(12251111) 5 11し模板0嫩I V- L(3copies/ u L)，上游引物(25pmol/ u L) I u L,下游引物(25pmol/ u L) I u L, dNTPs (姆種10mmol/L) I ii L，TaqDNA聚合酶(2. 5M/y L) I y L，雙蒸水補(bǔ)至50 y L ;雙重PCR反應(yīng)的·50 ii L反應(yīng)體系為上游引物(25pmol/U L) I y L，下游引物I (25pmol/uL)0. 5uL, T游引物2(25 11101/11し)111し其他同上；反應(yīng)程序及參數(shù)為94°C 3min，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s，·55°C 30s, 72°C 30s，共 5 個(gè)循環(huán)；94で 40s, 57°C 30s, 72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72で 8min, I個(gè)循環(huán)；4°C 3min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒傳統(tǒng)毒株和高致病毒株的熒光PCR檢測(cè)方法，為了能準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)nsp2基因缺失的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征變異病毒，在nsp2基因核苷酸序列上設(shè)計(jì)了一條上游引物和兩條下游引物，其中一條下游引物設(shè)計(jì)在缺失堿基序列區(qū)域。通過(guò)條件優(yōu)化建立了區(qū)分傳統(tǒng)株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法；并將最優(yōu)化條件運(yùn)用于SYBR Green熒光定量PCR分析，建立了根據(jù)熔解曲線鑒別nsp2缺失變異株的熒光定量PCR方法，靈敏度達(dá)到可檢出3-6個(gè)基因拷貝。與常規(guī)PCR相比，本發(fā)明的熒光定量PCR方法能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出傳統(tǒng)株和缺失株，靈敏度約比常規(guī)PCR高10倍。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102653798SQ201110049950
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者李秀梅 申請(qǐng)人:天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心