專利名稱：大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光pcr引物、探針及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大蔣臀級(jí)輪喻Planococcus minor (Maskell)是“中華人民共和國(guó)進(jìn)出境植物檢疫性有害生物名錄”中的有害生物，同時(shí)也是歐洲、美洲等許多國(guó)家或地區(qū)十分關(guān)注的檢疫性有害生物。該蟲在亞洲、非洲、美洲的許多國(guó)家或地區(qū)廣泛分布，已記錄寄主植物多達(dá)60 余個(gè)科共250余種，為害多種水果、林木和觀賞植物。主要寄主植物有榴蓮、甘橘、葡萄、芒果、香蕉、人心果、西瓜、甜瓜、咖啡、可可、大豆、玉米、馬鈴薯、觀賞花卉植物等。大洋臀紋粉蚧極易隨上述寄主植物傳入我國(guó)，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成潛在威脅，因此，需要在口岸檢疫部門嚴(yán)格加強(qiáng)檢疫工作，防止該蟲傳入我國(guó)。在蚧蟲鑒定中，只有成熟、完整的雌成蟲才能進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)鑒定，若口岸截獲到若蟲，必須花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間將其飼養(yǎng)為成蟲；若截獲到不完整的死蟲，根本無法鑒定其種類。 蚧蟲鑒定前，需先將其制作成玻片標(biāo)本。玻片標(biāo)本制作的技術(shù)性較強(qiáng)，制作人員需經(jīng)專門培訓(xùn)，才能制作出合格的標(biāo)本。蚧蟲鑒定十分困難，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的蚧蟲專家才能準(zhǔn)確鑒定其種類。本發(fā)明彌補(bǔ)了蚧蟲形態(tài)學(xué)鑒定的不足，可以更為快捷、準(zhǔn)確地鑒定出口岸截獲的蚧蟲是否為大洋臀紋粉蚧。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針及檢測(cè)方法，旨在解決蚧蟲形態(tài)鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、鑒定困難的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1 和 SEQ NO. 2 所示。一種用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR的MGB探針，其中，所述MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標(biāo)記的寡核苷酸，在5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)和一個(gè)MGB基團(tuán)，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。所述的用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR的MGB探針，其中，所述報(bào)告熒光基團(tuán)為熒光染料FAM，所述淬滅基團(tuán)為非熒光淬滅基團(tuán)。一種檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其中，包括以下步驟
1)先對(duì)大洋臀紋粉蚧及其近似種轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同于其它近似種的獨(dú)有的堿基位點(diǎn)，然后設(shè)計(jì)用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的上游引物、下游引物和MGB探針；
2)提取待測(cè)樣品DNA;
3)設(shè)置實(shí)時(shí)熒光PCR 的反應(yīng)體系5 μ 1 2XTaqMan Gene Expression Master Mix,IOpM的上游引物和下游引物各0. 25 μ 1，IOpM的MGB探針0. 2 μ 1，待測(cè)樣品DNA 1 μ 1，加水補(bǔ)足總體積10μ 1 ；同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；
4)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，并檢測(cè)熒光信號(hào)反應(yīng)條件為50°C，2min；95IOmin ； 950C，IOs ；600C，Imin ；40 個(gè)循環(huán)；
5)根據(jù)熒光信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。所述的檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其中，所述陽性對(duì)照為大洋臀紋粉蚧DNA，陰性對(duì)照為南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧DNA、雙條拂粉蚧DNA，空白對(duì)照為去離子水。本發(fā)明的有益效果設(shè)計(jì)了適用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)的引物和寡核苷酸探針，克服了現(xiàn)有形態(tài)學(xué)鑒定方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、需要制作玻片標(biāo)本和需要豐富經(jīng)驗(yàn)的缺點(diǎn)，也克服了現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法操作復(fù)雜或檢測(cè)靈敏度不高、特異性不強(qiáng)、重復(fù)性不好等缺點(diǎn)；由于本發(fā)明檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)，特別適用于口岸檢疫等時(shí)效性要求較強(qiáng)的場(chǎng)合使用。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例中實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的熒光信號(hào)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚、明確，以下參照附圖并舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR是在反應(yīng)體系中加入一條熒光。TaqMan MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標(biāo)記的寡核苷酸，即在5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)非熒光淬滅基團(tuán)和一個(gè)MGB基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被非熒光淬滅基團(tuán)吸收。在PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一條這種特異性的熒光雙標(biāo)記探針，TaqMan MGB探針同PCR產(chǎn)物雜交，在延伸階段，Taq酶的5’端到3’端的外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和非熒光淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告熒光基團(tuán)染料發(fā)出的熒光不再轉(zhuǎn)換給非熒光淬滅基團(tuán)，導(dǎo)致熒光量的增加，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如果以每一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)所測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)，以PCR循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，可得到一條連接每一個(gè)循環(huán)后熒光值的曲線，即擴(kuò)增曲線。當(dāng)樣品中含有所要檢測(cè)的靶核酸序列時(shí)，所得到的曲線呈“S”形；而當(dāng)樣品中不含靶核酸序列時(shí)，則沒有發(fā)生PCR擴(kuò)增，探針不被水解，也就檢測(cè)不到熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線為一水平線。利用上述TaqMan MGB探針，本發(fā)明提供的大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1)先對(duì)大洋臀紋粉蚧及其近似種轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行序列測(cè)定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同于其它近似種的獨(dú)有的堿基位點(diǎn)；
(2)設(shè)計(jì)大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物和寡核苷酸探針；
(3)對(duì)所設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行篩選及反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選出優(yōu)化的引物和探針，并優(yōu)化出合適的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件；(4)加入上述的引物、探針進(jìn)行大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；
(5)根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果，判斷檢測(cè)樣品是否為大洋臀紋粉蚧。用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物，其序列(SEQ ID NO. 1-2)如下 COI- PM-F :5’ -TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3’ ；
COI- PM-R 5' -GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3，。用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的寡核苷酸探針，其包括特異性檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的iTaqMan MGB探針和特異結(jié)合的寡核苷酸序列，其序列(SEQ ID NO. 3)如下
COI-PM-MGB FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。其中，MGB探針的5’端用熒光染料FAM作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端的MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)。采用上述檢測(cè)方法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是1)若定量PCR儀檢測(cè)到以大洋臀紋粉蚧 DNA為模板的陽性對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照的報(bào)告熒光沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而樣品的檢測(cè)結(jié)果是報(bào)告熒光信號(hào)有明顯增長(zhǎng)，則表示所檢測(cè)的蚧蟲是大洋臀紋粉蚧；2)若定量PCR儀檢測(cè)到以大洋臀紋粉蚧DNA為模板的陽性對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照的報(bào)告熒光沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而樣品的檢測(cè)結(jié)果報(bào)告熒光也沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，則表示所檢測(cè)的蚧蟲不是大洋臀紋粉蚧。實(shí)施例1引物和探針的準(zhǔn)備
對(duì)大洋臀紋粉蚧及其近似種轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行序列測(cè)定及比較分析，設(shè)計(jì)用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物序列如下
COI- PM-F :5’ -TGCTATTCCTACAAGAATTAAAATCTTTAGA-3’ ； COI- PM-R 5' -GACGGGGTATTCCATTTATTCCT-3，。用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的MGB探針的序列如下 COI-PM-MGB :FAM-CAATTGGATTCATCATTATAT-MGB。其中，MGB探針的5’端用熒光染料FAM為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)探針的3’端上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)。實(shí)施例2
利用大洋臀紋粉蚧iTaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)進(jìn)口泰國(guó)榴蓮Durio zibethinus Murray中截獲粉蚧進(jìn)行鑒定。所用弓丨物和MGB探針是實(shí)施例1中的引物和MGB探針。利用大洋臀紋粉蚧TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的過程如下
1、提取待測(cè)樣品DNA:將從進(jìn)口泰國(guó)榴蓮中發(fā)現(xiàn)的粉蚧，按照常規(guī)的DNA提取方法進(jìn)行 DNA提取。2、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，并進(jìn)行熒光檢測(cè)
TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7700型PCR儀的96孔板上進(jìn)行，TaqMan MGB 探針熒光 PCR 的反應(yīng)體系5 μ 1 2 X TaqMan Gene Expression Master Mix，上、下游引物(IOpM)各0. 25 μ 1，MGB探針(IOpM) 0. 2 μ 1，待測(cè)樣品DNA 1 μ 1 (約IOng)，加水補(bǔ)足總體積10μ 1。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照以大洋臀紋粉蚧DNA為陽性對(duì)照、以南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧 DNA、雙條拂粉蚧DNA為陰性對(duì)照，以去離子水為空白對(duì)照。PCR 反應(yīng)條件:50°C,2min ；95°C, IOmin ；95°C, IOs ；60°C, Imin ；40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)報(bào)告熒光基團(tuán)的類型，選擇對(duì)應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。3、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。從進(jìn)口泰國(guó)榴蓮中發(fā)現(xiàn)的粉蚧，按照上述的方法和條件進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果為以大洋臀紋粉蚧DNA為模板的陽性對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而從進(jìn)口泰國(guó)榴蓮果實(shí)上截獲的粉蚧DNA模板的檢測(cè)結(jié)果為陽性，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，表明所檢測(cè)進(jìn)口泰國(guó)榴蓮攜帶的粉蚧為大洋臀紋粉蚧。采用本發(fā)明的方法檢測(cè)大洋臀紋粉蚧比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法更加快速、準(zhǔn)確，且易于推廣應(yīng)用。綜上所述，采用本發(fā)明能對(duì)實(shí)際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的粉蚧進(jìn)行大洋臀紋粉蚧分子生物學(xué)鑒定或檢測(cè)，其意義重大。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ NO. 1和SEQ NO. 2所示。
2.一種用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR的MGB探針，其特征在于，所述MGB探針是一段兩端分別用不同的染料標(biāo)記的寡核苷酸，在5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)和一個(gè)MGB基團(tuán)，所述寡核苷酸的序列如SEQ NO. 3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR的MGB探針，其特征在于，所述報(bào)告熒光基團(tuán)為熒光染料FAM，所述淬滅基團(tuán)為非熒光淬滅基團(tuán)。
4.一種檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟1)先對(duì)大洋臀紋粉蚧及其近似種轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定及比較分析，分別找出大洋臀紋粉蚧不同于其它近似種的獨(dú)有的堿基位點(diǎn)，然后設(shè)計(jì)用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的上游引物、下游引物和MGB探針；2)提取待測(cè)樣品DNA；3)設(shè)置實(shí)時(shí)熒光PCR 的反應(yīng)體系5 μ 1 2XTaqMan Gene Expression Master Mix, IOpM的上游引物和下游引物各0. 25 μ 1，IOpM的MGB探針0. 2 μ 1，待測(cè)樣品DNA 1 μ 1，加水補(bǔ)足總體積10μ 1 ；同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；4)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，并檢測(cè)熒光信號(hào)反應(yīng)條件為50°C，2min；95IOmin ； 950C，IOs ；600C，Imin ；40 個(gè)循環(huán)；5)根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果，判斷是否為大洋臀紋粉蚧。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于，所述陽性對(duì)照為大洋臀紋粉蚧DNA，陰性對(duì)照為南洋臀紋粉蚧DNA、甘蔗簇粉蚧DNA、新菠蘿灰粉蚧 DNA、李比利氏灰粉蚧DNA、氣生根粉蚧DNA、雙條拂粉蚧DNA，空白對(duì)照為去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了大洋臀紋粉蚧的實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針及檢測(cè)方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)了適用于大洋臀紋粉蚧實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)的引物和寡核苷酸探針，克服了現(xiàn)有形態(tài)學(xué)鑒定方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、需要制作玻片標(biāo)本和需要豐富經(jīng)驗(yàn)的缺點(diǎn)，也克服了現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法操作復(fù)雜或檢測(cè)靈敏度不高、特異性不強(qiáng)、重復(fù)性不好等缺點(diǎn)；由于本發(fā)明檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)，特別適用于口岸檢疫等時(shí)效性要求較強(qiáng)的場(chǎng)合使用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102168142SQ20111004992
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者余道堅(jiān), 康林, 徐浪, 焦懿, 陳志粦 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心