專利名稱：重組腺病毒及其修飾的樹突狀細(xì)胞與它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種重組腺病毒及其修飾的樹突狀細(xì)胞與它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Human papillomavirus病毒(HPV)屬于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳頭瘤病毒屬，是一種嗜上皮細(xì)胞的DNA病毒。HPV是宮頸癌的主要致病因子，約99. 7%的宮頸癌發(fā)病都與HPV感染有關(guān)。宮頸癌在全球婦女癌癥發(fā)病率中居第二位，每年全球大約有50萬例。根據(jù)致癌性高低，可將HPV分為高危型和低危型兩種，其中HPV16屬于高危型的代表之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約50%的宮頸癌與HPV16感染相關(guān)。宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療、 化療等只對(duì)早期患者有一定的療效，且治療創(chuàng)傷大，不能防止HPV再度感染。HPV基因組主要編碼2種晚期蛋白(Li和L2)和6種早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6 和E7)。晚期蛋白為HPV衣殼結(jié)構(gòu)成分，參與病毒顆粒組裝。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主細(xì)胞永生化并進(jìn)一步發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。E6和E7基因只存在于癌變組織中，在正常組織中不存在。樹突狀細(xì)胞(DC)在體內(nèi)分布廣泛，膜表面高表達(dá)共刺激分子、粘附分子及主要組織相容性復(fù)合物分子，是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的 APC，被稱為天然“免疫佐劑”，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥等過程中發(fā)揮重要作用。它的臨床試驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)顯著特征就是其安全性，除了發(fā)燒、局部反應(yīng)等，極少有副反應(yīng)，而且沒有見到嚴(yán)重威脅生命的副反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組腺病毒及其修飾的樹突狀細(xì)胞與它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組腺病毒為表達(dá)序列表的序列2所示蛋白質(zhì)的重組腺病毒。所述蛋白質(zhì)的編碼基因具體可如序列表的序列1所示。所述重組腺病毒具體可為培養(yǎng)重組細(xì)胞甲得到的重組腺病毒；所述重組細(xì)胞甲是將重組質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒PBH Glox AEl\3cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；所述重組質(zhì)粒是在PDC315質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入所述蛋白質(zhì)的編碼基因得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的重組腺病毒可有效的感染樹突狀細(xì)胞，使之表達(dá)(E6E7融合蛋白) 并提呈，注射到體內(nèi)后可激發(fā)HPV16 E6E7特異性的CTL，可用于HPV16感染的宮頸癌的免疫治療。本發(fā)明還保護(hù)所述的重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞得到的重組細(xì)胞乙。所述樹突狀細(xì)胞可為小鼠樹突狀細(xì)胞。所述樹突狀細(xì)胞具體可為用鼠源GM-CSF 誘導(dǎo)來自鼠骨髓的CD34+干細(xì)胞得到的樹突狀細(xì)胞。所述的重組細(xì)胞乙和/或所述的重組腺病毒在制備宮頸癌預(yù)防和/或治療疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明還保護(hù)一種宮頸癌預(yù)防和/或治療疫苗，它的活性成分是所述的重組細(xì)胞乙和/或所述的重組腺病毒。本發(fā)明提供的疫苗可以采用多種方式進(jìn)行免疫，如采用皮內(nèi)注射。采用皮內(nèi)注射時(shí)，對(duì)于60Kg左右的成年人，建議每月免疫一次，連續(xù)免疫六次，每次免疫劑量為2 X IO5個(gè)所述的重組細(xì)胞乙。本發(fā)明還保護(hù)在pDC315質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重組質(zhì)粒(PDC315-E6E7-1)。本發(fā)明還保護(hù)將所述重組質(zhì)粒(pDC315-E6E7-l)與骨架質(zhì)粒pBH GloxAEl\3cre 共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到的重組細(xì)胞甲。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下(1)選用的抗原是高危HPV16型的兩個(gè)癌基因E6和E7的融合基因，相比只做單個(gè)基因的研究，包含了更多的表位。(2)包裝了表達(dá)HPV16E6E7基因的腺病毒，可用來高效感染樹突狀細(xì)胞和其他細(xì)胞或直接用來注射人體；相比而言，包裝了 HPV16 E6E7基因的腺病毒可能是目前最有效的給樹突狀細(xì)胞負(fù)載HPV16 E6E7抗原的方法。(3)目前國內(nèi)還沒有使用腺病毒載體來使樹突狀細(xì)胞負(fù)載高危型HPV16抗原的研究，更沒有相關(guān)的臨床研究，本發(fā)明使用腺病毒載體使樹突狀細(xì)胞負(fù)載HPV16E6E7抗原的細(xì)胞疫苗填補(bǔ)國內(nèi)空白。發(fā)明人使用HPV16 E6E7作為HPV16相關(guān)腫瘤基因治療的目的基因，并利用AdMax 系統(tǒng)構(gòu)建了 HPV16 E6E7重組腺病毒(Ad-HPV16E6E7_1)。同時(shí)，選擇DC作為抗原提呈細(xì)胞， 用HPV16 E6E7重組腺病毒修飾DC后將其作為抗腫瘤疫苗。該疫苗在體外具有誘導(dǎo)HPV16 E6E7特異性CTL的能力，并且通過臨床前小鼠實(shí)驗(yàn)檢測了此疫苗體外活化的CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明人制備的基于HPV16 E6E7重組腺病毒的疫苗，在預(yù)防和 /或治療HPV16相關(guān)腫瘤中有良好的使用效果，具有很大的臨床應(yīng)用前景。


圖1為重組腺病毒RCA電泳檢測結(jié)果；1 :pXC-l質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；2 :pXC-l質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液；3 :pXC-l質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液；4 病毒上清的PCR 產(chǎn)物；5 病毒上清的PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液；6 病毒上清的PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液；7 WideRange DNA Marker(100-6000)。圖2為重組腺病毒中目的基因PCR電泳鑒定結(jié)果；1 病毒上清的PCR產(chǎn)物；2 病毒上清的PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液；3 病毒上清的PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液；4 =WideRange DNA Marker(100-6000)。圖3為重組腺病毒感染細(xì)胞后表達(dá)的目的蛋白的Western blot結(jié)果；1為蛋白 Marker ；2 重組腺病毒，一抗為E6山羊多抗；3 重組腺病毒，一抗為E7小鼠單抗；4 重組腺病毒，一抗為E7小鼠單抗；5 對(duì)照腺病毒，一抗為E6山羊多抗；對(duì)照腺病毒，一抗為E7小鼠單抗。圖4為樹突狀細(xì)胞的流式細(xì)胞儀表面分子標(biāo)記鑒定。圖5為ELISpot實(shí)驗(yàn)結(jié)果；每個(gè)柱子代表一只小鼠。
圖6為體外殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；縱坐標(biāo)為待測細(xì)胞的信號(hào)值與1640培養(yǎng)基孔的信號(hào)值的差值，單位為RLU(Relative Light Unit，橫坐標(biāo)為淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞TC_1的比例。圖7為實(shí)施例3中體內(nèi)抗瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果；橫坐標(biāo)的單位為周，從小鼠接種腫瘤細(xì)胞兩周后2周后對(duì)照組體表腫瘤可見，所以從接種腫瘤細(xì)胞開始第15天開始記，每7天為一周； 縱坐標(biāo)的小鼠的存活率。圖8為實(shí)施例4中體內(nèi)抗瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果；橫坐標(biāo)的單位為周，從小鼠接種腫瘤細(xì)胞兩周后2周后對(duì)照組體表腫瘤可見，所以從接種腫瘤細(xì)胞開始第15天開始記，每7天為一周； 縱坐標(biāo)的小鼠的存活率。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明所涉及到的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)如核酸分子克隆技術(shù)、蛋白質(zhì)表達(dá)檢測等在科學(xué)文獻(xiàn)中都已經(jīng)有充分的描述(如參見J.薩姆布魯克、E. F 弗里奇、T.曼尼要蒂斯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版))，涉及到各種試劑盒的具體操作，按照其相應(yīng)說明書進(jìn)行。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoR I、BamH I，T4連接酶，PCR EXTaq酶均購自日本TAKARA公司。質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根公司。FuGENE-HD (轉(zhuǎn)染試劑)購自Roch公司。鼠源GM-CSF (細(xì)胞因子)和鼠源TNF- α (細(xì)胞因子)購自P^r01Tech公司。檢測小鼠MHC-II的抗體、檢測小鼠⑶Ilc 的抗體、檢測小鼠⑶86的抗體、Elispot set購買自BD公司。E6山羊多抗和E7小鼠單抗購自santa cruz公司。山羊二抗和小鼠二抗購自rockland公司。引物均由上海生工合成。C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所。CTL殺傷檢測試劑盒為CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay 購自 promega 公司。pDC315 質(zhì)粒來自力口拿大 Microbix Biosystems Inc.公司銷售的 Admax kitD (PD-01—64)。骨架質(zhì)粒 pBH Glox ΔEl\3cre 來自加拿大 MicrobixBiosystems Inc.公司銷售的 Admax kitD(PD-01—64)。 HEK 293細(xì)胞購買自美國ATCC(CRL-1573)。p)(C-l質(zhì)粒(含有腺病毒El基因)購自加拿大 Microbix Biosystems Inc.公司(PD-01-03)。TC-I腫瘤細(xì)胞由約翰霍普金斯大學(xué)的Tzyy-Choou脅教授惠贈(zèng)；參考文獻(xiàn)Treatment of Established Tumors with a Novel Vaccine That Enhances MajorHistocompatibility Class II Presentation of Tumor Antigen,1996, Cancerresearch0實(shí)施例1、重組腺病毒的制備、鑒定和純化一、用于腺病毒包裝的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建1、合成序列表的序列1所示的E6E7-1融合基因(序列表的序列1所示的E6E7-1 融合基因是將野生型HPV16 E6E7的融合基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的，編碼序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)；參見專利“經(jīng)修飾的HPV E6-E7融合基因及其編碼蛋白”，申請(qǐng)?zhí)枮?200710100262. 5，專利授權(quán)公告號(hào)為 CN 101100672 B)。2、以步驟1合成的E6E7-1融合基因?yàn)槟０澹肊67-5，端引物(下劃線標(biāo)注EcoRI識(shí)別序列)和E67-3’端引物(下劃線標(biāo)注BamH I識(shí)別序列)組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。E67-5，端引物5，-GCGAATTCGCCACCATGCACCAGAA-3’ ；E67-3，端引物5，-GCGGATCCTTCAGGGCTTCTGGCT-3’。PCR擴(kuò)增的熱循環(huán)條件為95°C 1分鐘，30秒，72 °C 1分鐘。3、回收步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切， 得到酶切產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切pDC315質(zhì)粒，回收載體骨架(約 3900bp)。5、用T4DNA連接酶連接步驟3回收的酶切產(chǎn)物與步驟4回收的載體骨架，得到連接產(chǎn)物。6、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取重組菌提質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PDC315-E6E7-1，即為用于腺病毒包裝的重組穿梭質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pDC315-E6E7-l的結(jié)構(gòu)描述在pDC315質(zhì)粒的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重組質(zhì)粒。二、制備重組腺病毒1、將重組質(zhì)粒pDC315-E6E7-l與骨架質(zhì)粒pBH Glox Δ El\3cre按照摩爾比1 1 混合，借助FuGENE-HD (轉(zhuǎn)染試劑)轉(zhuǎn)染6孔板中的HEK293細(xì)胞(配比為如g質(zhì)粒DNA :12ul 轉(zhuǎn)染試劑)。2、約2周后除去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液收獲細(xì)胞。3、將收獲的溶于PBS緩沖液的細(xì)胞使用-70°C冰箱和37°C水浴鍋反復(fù)凍融3_5 次，得到原代病毒液。4、用原代病毒液感染新的HEK293細(xì)胞，在發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí)收獲病毒， 重復(fù)幾次(用病毒液感染新的HEK293細(xì)胞)，擴(kuò)大病毒的量和提高病毒的滴度，得到重組腺病毒Ad-E6E7-1的病毒液(粗制腺病毒)。用pDC315質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒pDC315_E6E7_l，進(jìn)行步驟1至4，得到對(duì)照腺病毒的病毒液(粗制腺病毒)。三、檢測包裝的重組腺病毒的復(fù)制缺陷型本發(fā)明使用的腺病毒載體是復(fù)制缺陷的，其基因組不含復(fù)制所需的腺病毒El基因。而在制備復(fù)制缺陷型的腺病毒的過程中，腺病毒的復(fù)制是依賴于包裝細(xì)胞系HEK293表達(dá)的腺病毒El基因的。然而，存在HEK293細(xì)胞表達(dá)的腺病毒El基因重組到包裝腺病毒基因組的可能性，從而產(chǎn)生可自主復(fù)制的腺病毒。因此，需要檢測制備的復(fù)制缺陷型腺病毒中是否含有復(fù)制型腺病毒(RCA)。RCA的檢測的方法是用PCR的方法檢測制備的腺病毒DNA 中是否有腺病毒El的存在。l、25ul步驟二得到的重組腺病毒Ad-E6E7-1的病毒液加入Iul蛋白酶K(IOmg)， 55 °C 水浴 Ih。2、煮沸 5min。3、IOOOOrpm 離心 5min，取上清。4、分別以上清、上清的10倍稀釋液和上清的100倍稀釋液為模板(以p)(C-l質(zhì)粒為陽性對(duì)照)，用RCA-up和RCA-down組成的引物對(duì)(RCA-up和RCA-down的靶序列是腺病毒El基因中的部分區(qū)域，靶序列長度為1.21Λ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。RCA-up :5， -CACAAGGGCGTCTCCAAGTT-3，；RCA-down :5，-CCTGCGAGTGTGGCGGTAAA-3，。5、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃度為的瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。四、檢測包裝的重組腺病毒的目的基因包裝的腺病毒要求是含有目的基因的DNA并在感染細(xì)胞后會(huì)表達(dá)目的蛋白(E6E7 融合蛋白)，因此需要檢測重組腺病毒中目的基因DNA的存在和轉(zhuǎn)染細(xì)胞后目的蛋白的表達(dá)。用E6E7特異的引物PCR擴(kuò)增腺病毒DNA中目的DNA是否存在；用腺病毒感染HEK293 細(xì)胞M小時(shí)后收細(xì)胞，用Wfestern Blot的方法檢測目的蛋白的表達(dá)。1、檢測腺病毒DNA中目的基因的存在(l)25ul步驟二得到的重組腺病毒Ad-E6E7-1的病毒液加入Iul蛋白酶K (IOmg)， 55 °C 水浴 Ih。(2)煮沸 5min.(3) IOOOOrpm 離心 5min，取上清。(4)分別以上清、上清的10倍稀釋液和上清的100倍稀釋液為模板，用E6E7-Up和 E6E7-down組成的引物對(duì)(靶序列長度約為780bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。E6E7-up :5， -ATGCACCAGAAGAGAACCGCCAT-3，；E6E7-down :5，-TCAGGGCTTCTGGCTGCAGAT-3，。(5)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，見圖2。2、檢測重組腺病毒感染細(xì)胞后目的蛋白的表達(dá)(1)用HEK293細(xì)胞鋪6孔板，在感染時(shí)使其覆蓋率大于90%。(2)將新鮮培養(yǎng)液與步驟二得到的重組腺病毒Ad-E6E7_1的病毒液混勻，得到腺病毒稀釋液(每孔份的量為200ul新鮮培養(yǎng)液與1 X 107pfu重組腺病毒Ad-E6E7-1的病毒液混勻)；將步驟二得到的對(duì)照腺病毒的病毒液作為重組腺病毒Ad-E6E7-1的病毒液的對(duì)照。(3)吸去步驟(1)的6孔板中細(xì)胞表面的培養(yǎng)液，每孔加入1孔份步驟(2)的腺病毒稀釋液，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置2小時(shí)。(4)吸去病毒稀釋液，加入新鮮培養(yǎng)液在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小時(shí)； 吸去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS緩沖液，吹打細(xì)胞層，將細(xì)胞收集到離心管中；1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘沉淀細(xì)胞。(5)在沉淀的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞(細(xì)胞裂解液的加入量為每孔細(xì)胞IOOul細(xì)胞裂解液)。(6)蝸旋震蕩 5min，14000rpm 4°C離心 lOmin，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE。(7)轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉過夜。(8)以E6山羊多抗(或E7小鼠單抗)(1 200)室溫?fù)u床孵育60min。(9)以 PBST 洗膜 3 次，IOmin/ 次。(10)分別以山羊二抗(或小鼠二抗)(1 1000)室溫避光孵育45min。(11)以 PBST 洗膜 3 次，IOmin/ 次。
(12)將膜置于PBS中，紅外掃描儀機(jī)檢，結(jié)果見圖3。五、純化包裝的重組腺病毒收獲的粗制腺病毒，用氯化銫不連續(xù)密度梯度法進(jìn)行純化以除掉其中混雜的細(xì)胞碎片和其他生物大分子，離心完畢后吸去乳白色的腺病毒層。由于離心過程和回收腺病毒液時(shí)均會(huì)吸入氯化銫，因此還需除去腺病毒液中的氯化銫。將離心后的病毒液加入到100KD 的超濾管中，再補(bǔ)加足量的PBS緩沖液，離心除去含氯化銫的液體，反復(fù)2次后剩下的即為純化的腺病毒。1、在離心管下層加入 4M 的氯化銫 7ml(67g CsCl 溶于 100ml IOmM HEPES，pH7. 4)， 中間加上 2. 2M 的氯化銫 IOml (38g CsCl 溶于 100ml IOmM HEPES，pH7. 4 ； IOmM HEPES :1. 3g HEPES溶于500ml雙蒸水)，上面加入20ml步驟二得到的重組腺病毒Ad-E6E7_1的病毒液。2、4°C下100 OOOg離心12小時(shí)，中間形成的一層乳白色的腺病毒層，用注射器收
集該乳白色的腺病毒層。3、收集的腺病毒液加入到規(guī)格100KD的超濾管中，2500rpm離心30分鐘。4、加入足量的PBS緩沖液，2500rpm離心30分鐘，重復(fù)2次。5、加入含10 %甘油的PBS緩沖液，即為純化后重組腺病毒Ad-E6E7_1病毒液，-70°C保存。用步驟二得到的對(duì)照腺病毒的病毒液代替步驟二得到的重組腺病毒Ad-E6E7_1 的病毒液，進(jìn)行步驟1至5，得到純化后對(duì)照腺病毒病毒液。六、測定包裝腺病毒的滴度利用 CELL BIOLABS, INC.公司的 QuickTiter Adenovirus Titer Immunoassay Kit試劑盒測定包裝腺病毒的滴度，具體操作步驟如下1、按照2. 5X IO5細(xì)胞/孔的量將HEK293細(xì)胞鋪于24孔板，Iml/孔，于37°C,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育Ih。2、將步驟五得到的純化后重組腺病毒Ad-E6E7_1病毒液用培養(yǎng)基做10倍比稀釋， 并將稀釋后的病毒樣品按照IOOul/孔的用量加入M孔板；將步驟五得到的純化后對(duì)照腺病毒病毒液作為純化后重組腺病毒Ad-E6E7-1病毒液的對(duì)照。3、于37 °C，5 % (X)2恒溫培養(yǎng)箱孵育2天。4、緩慢去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml預(yù)冷的甲醇，_20°C孵育20min，固定 HEK293 細(xì)胞。5、用IXPBS緩沖液洗固定好的細(xì)胞三次，5min/次。6、每孔加入適量含有BSA的PBS緩沖液，置于搖床上室溫封閉lh。7、每孔加入0.25ml 1 X anti-Hexon antibody，置于搖床上室溫孵育lh。8、用IXPBS緩沖液洗固定好的細(xì)胞三次，5min/次。9、每孔加入0. 25ml 1 X 二抗(HRP-conjugated)，置于搖床上室溫孵育Ih。10、用IXPBS緩沖液洗固定好的細(xì)胞五次，5min/次。11、每孔加入0. 25ml新鮮配制的IXDAB工作液，置于搖床上室溫孵育lOmin。12、吸除DAB，用IXPBS緩沖液洗滌兩次，并將每孔加入Iml IXPBS緩沖液。13、光鏡下，10倍鏡對(duì)陽性細(xì)胞(棕色)計(jì)數(shù)，每孔至少計(jì)5個(gè)視野。14、計(jì)算每孔的陽性細(xì)胞平均數(shù)以及病毒滴度。
病毒滴度=(每個(gè)視野平均陽性細(xì)胞數(shù)X每個(gè)孔的視野數(shù)X稀釋倍數(shù))/0. 1 ； 病毒滴度單位為pfu/ml。實(shí)施例2、重組腺病毒Ad-E6E7_1致敏的樹突狀細(xì)胞的制備一、體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞小鼠骨髓中的CD34+干細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞的前體，在含GM-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下會(huì)分化成樹突狀細(xì)胞。1、取斷頸法處死的C57BL/6小鼠，70%乙醇滅菌5min。2、解剖取股骨，去除附著肌肉，保持骨的完整性，70%乙醇浸泡1分鐘，PBS緩沖液沖洗兩次。3、剪斷股骨兩端，注射器沖洗髓腔三次至股骨變白，200目不銹鋼網(wǎng)研磨過濾。4、400g(1200-1500rpm)離心 5 分鐘，收集沉淀(細(xì)胞)。5UmL 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液5mL室溫裂解紅細(xì)胞2_3分鐘， 400g(1200-1500rpm)離心5分鐘，收集沉淀(細(xì)胞)。6、1640培養(yǎng)基洗2次。7、細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1-2X 106/ml接種6孔板和M孔板。8、鼠源GM-CSF(購買自ρ印rotech公司)按500U/ml的濃度加入到培養(yǎng)基中， 37V,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。9、2天后除去一半的舊誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入新的含500U/ml鼠源GM-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。10、在第4、6天進(jìn)行步驟9的半量換液。11、在第7天加入鼠源TNF-α，濃度為200U/ml。12、2天后收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面⑶11c、MHC-II和⑶86的表達(dá)， 結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞的⑶11c、MHCII和⑶86表達(dá)陽性率均超過80%，可以認(rèn)定為樹突狀細(xì)胞。二、重組腺病毒Ad-E6E7_1致敏的樹突狀細(xì)胞的制備重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)E6E7融合蛋白，并被樹突狀細(xì)胞經(jīng)MHC-I途徑提呈到細(xì)胞表面，從而可刺激特異的⑶8+T細(xì)胞激活。1、收獲未成熟的樹突狀細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106/ml。2、按照MOI (有感染能力的病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量的比值，病毒數(shù)量以pfu計(jì))= 100加入實(shí)施例1的步驟五得到的純化后重組腺病毒Ad-E6E7-1病毒液，37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。3、離心除去含病毒液的培養(yǎng)基，加入含200U/ml鼠源TNF-α的RPMI1640培養(yǎng)基。4、2天后收獲細(xì)胞，用PBS緩沖液漂洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 107ml，即為重組腺病毒Ad-E6E7-1致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液。用實(shí)施例1的步驟五得到的純化后對(duì)照腺病毒病毒液代替實(shí)施例1的步驟五得到的純化后重組腺病毒Ad-E6E7-1病毒液，進(jìn)行步驟1至4，得到對(duì)照腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液。實(shí)施例3、用重組腺病毒Ad-E6E7_1致敏的樹突狀細(xì)胞免疫小鼠一、分組處理
C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，分別進(jìn)行如下處理第一組(DC-E6E7-1)腹腔注射實(shí)施例2制備的重組腺病毒Ad-E6E7_1致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100 μ 1細(xì)胞液(含IX IO6 細(xì)胞)；第二組(DC-Ad):腹腔注射注射實(shí)施例2制備的對(duì)照腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫ΙΟΟμΙ細(xì)胞液(含IXlO6細(xì)胞)；第三組(DC)腹腔注射注射實(shí)施例2的步驟一制備的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100μ 1細(xì)胞液(含IXlO6細(xì)胞)；第四組(PBQ 腹腔注射注射生理鹽水；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100 μ ι生理鹽水。二、小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y的能力免疫的小鼠脾臟細(xì)胞激活后會(huì)分泌IFN-γ，通過檢測細(xì)胞分泌的IFN-Y可反應(yīng)脾臟T淋巴細(xì)胞的激活狀態(tài)。自第一次免疫開始第21天，每組隨機(jī)取4只小鼠，采用 ELISpotSet 檢測 IFN- γ 的分泌。1、收獲小鼠脾細(xì)胞①眼球取血(一只正常大小的小鼠可取0.7ml的血液)，小鼠血盡而亡。②將小鼠放在75%的酒精中消毒aiiin后取脾臟，加入細(xì)1淋巴細(xì)胞分離液，用注射器內(nèi)芯壓脾臟過400目鋼網(wǎng)，收集濾過的脾細(xì)胞。③在含有脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞分離液上層小心的加入0. 5ml的含2% FBS的1640培養(yǎng)基，2500rpm離心30min，之后取出淋巴細(xì)胞層。④加入IOml的含2% FBS的1640培養(yǎng)基，1500rpm離心5min，將沉淀(細(xì)胞)用 2ml PBS緩沖液重懸，計(jì)數(shù)，一部分進(jìn)行ELISpot試驗(yàn)，其余的凍存起來。2、進(jìn)行 ELIpot 檢測①用PBS緩沖液100倍稀釋包被抗體，在ELISpot96孔板中每孔加入100ul，4°C過夜。②棄包被抗體液，用1640完全培養(yǎng)基洗孔。③室溫下每孔加200ul的1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行封閉池。④棄封閉液，每孔加入2X的混合多肽液(多肽E6 18-26、多肽E637-45、多肽 E648-57、多肽E77-15、多肽E749-57和多肽E779-87,各多肽的濃度均為4uM ；E6 18-26 的氨基酸序列為KLPQLCTEL，E637-45的氨基酸序列為CVYCKQQLL，E648-57的氨基酸序列為EVYDFAFRDL，E77-15的氨基酸序列為TLHEYMLDL，E749-57的氨基酸序列為RAHYNIVTF、 E779-87 的氨基酸序列為 LEDLLMGTL) IOOul。⑤每孔加入4X 106/ml待測細(xì)胞液共IOOul，放入孵箱培養(yǎng)M小時(shí)。⑥吸去細(xì)胞懸液，用去離子水洗2次，每次浸泡3-5min。⑦每孔用200ul PBST(0. 05% )洗 3 次。⑧用含10% FBS的PBS緩沖液IOml稀釋50ul的檢測抗體，每孔加IOOul，室溫靜置2h。⑨棄檢測抗體，每孔200ul PBST洗三次，每次浸泡1_2分鐘。⑩用含10% FBS的PBS緩沖液IOml稀釋IOOul的酶聯(lián)物(鏈親和素-HRP)，每孔IOOul，室溫靜置Ih0 棄酶聯(lián)物，每孔200ul PBST洗四次，每次浸泡1_2分鐘。@每孔200ul PBS緩沖液洗兩次。@每Iml的底物稀釋液加1滴的染料配成顯色液，每孔加IOOul顯色，看顏色變化用去離子水洗以終止反應(yīng)。@室溫避光晾干板并用讀板儀檢測。ELISpot結(jié)果見圖5。分泌IFN- γ的能力自高至低依次為重組腺病毒Ad-E6E7_1 致敏的樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞>樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞 >生理鹽水免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，三者有顯著差異。樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞與對(duì)照腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y的能力基本相同，沒有顯著差異。三、測定免疫小鼠脾細(xì)胞中CTL對(duì)宮頸癌靶細(xì)胞的體外殺傷免疫過的小鼠的脾細(xì)胞中會(huì)刺激產(chǎn)生HPV16E6E7特異性的CTL，這是體內(nèi)消除 HPV16+宮頸癌細(xì)胞所必須的。通過檢測小鼠脾細(xì)胞對(duì)HPV16+宮頸癌鼠源模型TC-I的殺傷可反應(yīng)本發(fā)明所制備的疫苗激起HPV16E6E7特異型CTL的能力。本實(shí)驗(yàn)采用CTL殺傷檢測試劑盒，流程概述如下將免疫過的小鼠的脾細(xì)胞取出，在體外用HPV16E6E7感染的樹突狀細(xì)胞刺激3-5天后，將脾細(xì)胞與靶細(xì)胞TC-I共培養(yǎng)4-6小時(shí)看免疫小鼠的脾細(xì)胞中CTL對(duì)宮頸癌鼠源靶細(xì)胞的殺傷。自第一次免疫開始第21天，每組隨機(jī)取4只小鼠，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)1、取脾細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，計(jì)數(shù)。2、將淋巴細(xì)胞與實(shí)施例2制備的重組腺病毒Ad-E6E7_1致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞液 (用重組腺病毒病毒感染樹突狀細(xì)胞并在48小時(shí)收獲的樹突狀細(xì)胞)按10 1的比例共孵育3-5天。3、96孔板每孔加2 X IO4個(gè)TC-I腫瘤細(xì)胞(50ul)，再按不同比例分別加入步驟2 處理后的淋巴細(xì)胞(淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞TC-I的比例分別為0. 1 1,1 1,5 1,10 1 或 25 1)。4、37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。5、每孔加入IOOul顯色液CytoTox-ONE，搖板混勻30秒；6.每孔加50ul的終止液(試劑盒自帶)，搖板混勻10秒。7.上機(jī)用560/590進(jìn)行熒光檢測。體外殺傷的結(jié)果見圖6。PBS對(duì)照組小鼠的淋巴細(xì)胞對(duì)TC-I腫瘤細(xì)胞未見有效殺傷。對(duì)照腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞對(duì)TC-I腫瘤細(xì)胞有一定程度的殺傷，但不顯著。重組腺病毒Ad-E6E7-1致敏的樹突狀細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)的淋巴細(xì)胞對(duì)TC-I腫瘤細(xì)胞則有較強(qiáng)的殺傷。四、測定免疫小鼠對(duì)宮頸癌細(xì)胞攻擊的抵抗作用自第一次免疫開始第21天，每組取20只小鼠，分別在起右側(cè)腹股溝注射IOOul TC-I腫瘤細(xì)胞OX IO5個(gè))，每周觀察小鼠成瘤狀況，并記錄小鼠在接種腫瘤后的存活時(shí)間，結(jié)果見圖7。免疫生理鹽水、免疫對(duì)照腺病毒致敏的樹突狀細(xì)胞和免疫樹突狀細(xì)胞的小鼠全部成瘤。在小鼠成瘤后開始記錄其存活時(shí)間，在成瘤的數(shù)周內(nèi)全部死亡。而免疫了重組腺病毒Ad-E6E7-1致敏的樹突狀細(xì)胞的小鼠在接種宮頸癌腫瘤TC-I后未見成瘤，在記錄時(shí)間內(nèi)也未死亡。實(shí)施例4、用重組腺病毒Ad-E6E7_1免疫小鼠一、分組處理C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，分別進(jìn)行如下處理第一組(DC-E6E7-1)大腿肌肉注射實(shí)施例1制備的純化后重組腺病毒Ad-E6E7_1 病毒液；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100 μ 1病毒液(含5Χ IO7Pfu病毒)；第二組(Ad-null):大腿肌肉注射實(shí)施例1制備的純化后對(duì)照腺病毒病毒液；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100 μ 1病毒液(含5 X IO7Pfu Pfu病毒)；第三組(PBQ 大腿肌肉注射生理鹽水；共免疫三次，每次間隔一周；每只小鼠每次免疫100 μ ι生理鹽水。二、免疫效果驗(yàn)證自第一次免疫開始第21天，每組取20只小鼠，分別在起右側(cè)腹股溝注射IOOul TC-I腫瘤細(xì)胞OX IO5個(gè))，每周觀察小鼠成瘤狀況，并記錄小鼠在接種腫瘤后的存活時(shí)間，結(jié)果見圖8。免疫生理鹽水、免疫對(duì)照腺病毒的小鼠全部成瘤。在小鼠成瘤后開始記錄其存活時(shí)間，在成瘤的數(shù)周內(nèi)全部死亡。而免疫了重組腺病毒Ad-E6E7-1致的小鼠在接種宮頸癌腫瘤TC-I后未見成瘤，在記錄時(shí)間內(nèi)也未死亡。
權(quán)利要求
1.表達(dá)序列表的序列2所示蛋白質(zhì)的重組腺病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于所述蛋白質(zhì)的編碼基因如序列表的序列1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒是培養(yǎng)重組細(xì)胞甲得到的重組腺病毒；所述重組細(xì)胞甲是將重組質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBH Glox AEl\3cre共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞得到的重組細(xì)胞；所述重組質(zhì)粒是在pDC315質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求2 所述編碼基因得到的重組質(zhì)粒。
4.將權(quán)利要求1至3中任一所述的重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞得到的重組細(xì)胞乙。
5.如權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞乙，其特征在于所述樹突狀細(xì)胞為小鼠樹突狀細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4或5所述的重組細(xì)胞乙和/或權(quán)利要求1至3中任一所述的重組腺病毒在制備宮頸癌預(yù)防和/或治療疫苗中的應(yīng)用。
7.一種宮頸癌預(yù)防和/或治療疫苗，它的活性成分是權(quán)利要求4或5所述的重組細(xì)胞乙和/或權(quán)利要求1至3中任一所述的重組腺病毒。
8.在pDC315質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重組質(zhì)粒。
9.將權(quán)利要求8所述重組質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBHGlox Δ El\3cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到的重組細(xì)胞甲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組腺病毒及其修飾的樹突狀細(xì)胞與它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了表達(dá)序列表的序列2所示蛋白質(zhì)的重組腺病毒。將所述重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞，得到了重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞和所述的重組腺病毒均可用于制備宮頸癌預(yù)防和/或治療疫苗。本發(fā)明人制備的基于HPV16 E6E7重組腺病毒的疫苗，在預(yù)防和/或治療HPV16相關(guān)腫瘤中有良好的使用效果，具有很大的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102181407SQ20111004996
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者周志祥, 張立娜, 徐銀勝, 曾毅, 李澤琳, 盛望 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)