專利名稱：一種提高阿維菌素產量的方法及其生產菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種提高阿維菌素產量的基因工程方法。
背景技術：
阿維菌素(avermectins)是由阿維鏈霉菌(Sti^ptomyces avermitilis)發(fā)酵產生的一組高效殺蟲的十六元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素，它的天然產物共有八個組分(Ala、Alb、 A2a,A2b,Bla,Blb,B2a和B2b)，其中Bl組分的殺蟲活性最強，幾乎抗所有與農業(yè)有關的線蟲和節(jié)肢動物，被廣泛應用于農業(yè)生產上。伊維菌素(ivermectin)是以阿維菌素Bl為原料在C22-C23位加氫還原而成，與阿維菌素Bl具有相同的殺蟲活性，但毒性比阿維菌素低 2-3倍，更適用于動物體內外寄生蟲的防治，是一類廣譜有效的新型抗寄生蟲抗生素。阿維菌素和伊維菌素具有獨特的作用機制，不易使害蟲產生抗性，且易降解、無殘留，對作物、牲畜、人類和環(huán)境高度安全，被我國農業(yè)部推薦為無公害農藥，具有非常廣闊的市場前景和應用價值。阿維菌素和伊維菌素已在國內實現了產業(yè)化，取得了巨大的經濟和社會效益。但我國阿維菌素的生產菌株還存在著發(fā)酵單位低，生產成本高等問題。提高阿維菌素的產量， 降低生產成本，具有重要的現實意義。因此，通過基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維菌素的產量，具有重要的意義和應用價值。σ因子是RNA聚合酶的輔助因子，其功能是引導RNA聚合酶穩(wěn)定地結合到DNA啟動子上。細菌中的ο因子分為“管家” σ因子和一系列選擇性σ因子。前者主要用于啟動快速生長必需基因的表達，后者負責啟動特定生長條件下的相關基因表達或關閉，以對抗環(huán)境脅迫和滿足自身生理需求。細胞質外功能亞家族RNA聚合酶ο因子(ECFo因子) 按照其序列保守性和功能可歸為σ 7°家族，ECFo因子所識別的啟動子序列也是相當保守的。ECFo因子能夠在特定情況下控制特定基因的轉錄。通常情況下，這些ECFo因子受到一些內膜蛋白的調節(jié)，這些內膜蛋白可以作為一種感受器或一種信號分子，通過感受外界環(huán)境的變化來調節(jié)ECF σ因子的活性，從而起始相應基因的轉錄。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高阿維菌素產量的方法。本發(fā)明的另一目的是提供高產阿維菌素的基因工程菌。為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供sig6基因在提高菌種的阿維菌素產量中的應用。前述的應用，即通過在菌種中缺失sig6基因，以提高阿維菌素產量。所述菌種可以是任何能夠產生阿維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生菌，或者經常規(guī)誘變和基因工程改造后能夠產生阿維菌素的菌種，例如阿維鏈霉菌(Sti^ptomyces avermitilis)ATCC 31267。基于此，本發(fā)明提供一種缺失sig6基因的產阿維菌素的基因工程菌。如前所述，其出發(fā)菌可以是任何能夠產生阿維菌素的鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌野生菌，或者經基因工程改造后能夠產生阿維菌素的菌種。本發(fā)明 還提供一種制備上述基因工程菌的方法，包括如下步驟構建sig6基因的缺失載體，并將該缺失載體引入產阿維菌素的菌種中獲得sig6缺失的重組菌。具體可通過如下方法構建基因工程菌用PCR擴增阿維鏈霉菌中sig6基因的上、 下游序列，構建sig6基因的缺失載體，并將構建好的重組載體轉化產阿維菌素菌株，篩選獲得陽性重組菌。將含有上述重組載體的菌株先在39°C高溫下培養(yǎng)，誘導質粒丟失獲得單交換菌株，再將其在^°C、無安普霉素的培養(yǎng)基下傳代進行培養(yǎng)獲得sig6基因缺失突變株。在本發(fā)明實施例中，獲得了缺失sig6的阿維鏈霉菌野生菌的基因工程菌。前述的方法，其中構建sig6基因缺失載體的出發(fā)載體為任意一種含有鏈霉菌溫度敏感型復制子的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體。優(yōu)選載體如PKC1139、pGM160、pHZ132或 PCZA185 等。在本發(fā)明實施例中，以PKC1139為出發(fā)載體構建了 sig6基因缺失載體pLBll。前述的方法，其中所述將sig6基因缺失載體引入產阿維菌素的菌種中，可以采用生物工程領域中常用的方法，例如PEG介導的原生質體轉化法、電轉化法、接合轉移法等， 優(yōu)選PEG介導的原生質體轉化法。前述的方法，為提高轉化效率，可先將sig6基因缺失載體轉化到限制修飾作用缺陷的大腸桿菌ET12567中，從中提取質粒再轉化到產阿維菌素的菌種中。本發(fā)明提供一種提高阿維菌素產量的方法，其利用缺失sig6基因的產阿維菌素的基因工程菌來提高阿維菌素的產量。本發(fā)明是將阿維鏈霉菌中編碼ECF RNA聚合酶ο因子的sig6基因通過缺失載體引入阿維鏈霉菌中，獲得sig6基因缺失的重組菌，使其不再合成ο 6，從而提高阿維菌素的產量。本發(fā)明的基因工程菌可直接用于阿維菌素的發(fā)酵生產，提高阿維菌素的發(fā)酵單位，降低生產成本。


圖1為本發(fā)明較佳實施例sig6基因缺失載體pLBll的質粒圖譜。圖2為本發(fā)明較佳實施例sig6缺失載體pLBll與阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267染色體的同源雙交換示意圖。圖3為本發(fā)明較佳實施例阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267及其sig6缺失突變株的阿維菌素發(fā)酵單位。圖4為在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC731267及其sig6缺失突變株的阿維菌素發(fā)酵單位。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例lsig6基因缺失載體的構建一、阿維鏈霉菌sig6基因的克隆根據Genebank公布的阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267中sig6基因[NC_003155. 4(820435. · 821349)]的序列及其上、下游的序列設計PCR引物Primer sig6_l 5' -CCCAAGCTTACCGAGGCAAGTACGAGG-3‘Primer sig6_2 5' -GGAGTTCGAGCCCAGGAGTCACCGAACCGAGCAACC-3 ‘Primer sig6_3 5' -GGTTGCTCGGTTCGGTGACTCCTGGGCTCGAACTCC-3‘Primer sig6_4 5' ~CGGAATTCGTCGATGCCGGTGACAAC~3‘引物sig6_l和sig6_4兩端分別引入HindIII和EcoRI酶切位點(下劃線部分)。 以阿維鏈霉菌ATCC 31267基因組DNA為模板，分別以sig6_l和sig6_2，sig6_3和sig6_4 進行PCR擴增。PCR反應條件:95°C,5min ； (95°C, Imin ；60°C, Imin ；72°C，0. 5min) X25個循環(huán)；72°C，5min。電泳檢測 PCR 產物，分別在 490bp(sig6_l 和 sig6_2)和 493bp(sig6_3 和 sig6_4)處有特異性的擴增條帶。然后以所獲的擴增條帶以1 1的摩爾比加入到PCR擴增體系中作為模板，以sig6_l和sig6_4進行PCR擴增，PCR反應條件:95°C, 5min ； (95°C, Imin ；60°C, Imin ；72°C, lmin) X25 個循環(huán)；72°C，5min。將 PCR 產物電泳檢測，在 947bp 處有特異性的擴增條帶。二、sig6缺失載體的構建電泳回收上述947bp片段，經PCR產物純化試劑盒純化后，經HindIII和EcoRI 酶切連接于經 HindIII 禾Π EcoRI 雙酶切的載體 pKC1139 (Bierman Μ, Logan R, 0，Brien K, 等.用于從大腸桿菌到鏈霉菌DNA接合轉移的質?？寺≥d體.基因，1992，116 :43-49)得質粒pLBll。測序表明所擴增的片段確實為sig6基因的上下游序列，且與所公布的序列一致。pLBll的質粒圖譜如圖1所示。實施例2重組質粒的轉化通過實施例1構建了 sig6基因的缺失質粒載體pLBll，作為對照的原始質粒為 PKC1139。由于阿維鏈霉菌中存在很強的限制修飾作用，用提取自E.ColiDH5a的質粒直接轉化阿維鏈霉菌，轉化效率極低，有時甚至得不到轉化子。而用來自沒有限制修飾作用的受體菌E.coliET12567的質粒，其轉化效率明顯提高。因此，將構建好的重組質粒轉化到 E. coliET12567 (Kieser Τ, Bibb M J, Buttner M J，等·實用鏈霉菌遺傳手冊，2000， Norwich 約翰英納斯基金會)中以獲得非甲基化的DNA，然后再用非甲基化的質粒DNA轉化阿維鏈霉菌的原生質體。本實施例選用阿維鏈霉菌菌株ATCC 31267作為出發(fā)菌株。ATCC 31267是阿維鏈霉菌野生型菌株，產灰色孢子。制備這種阿維鏈霉菌菌株的原生質體，用從E. coliET12567 中提取的質粒轉化原生質體，涂于已吹干的不加抗生素的RM14平板上培養(yǎng)16-20h 后，在平板上涂ImL含1000 μ g安普霉素的水溶液，在繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，長出的菌落即為轉化子。由于阿維鏈霉菌的轉化子在冊14再生培養(yǎng)基上不產孢，故各挑取三個轉化子， 接種于含10-15 μ g/mL安普霉素的YMS平板上，培養(yǎng)7_10天恢復產孢。轉化子經質粒提取及PCR驗證正確。本實施例中大腸桿菌的轉化、阿維鏈霉菌原生質體的制備及轉化方法、RM14及 YMS培養(yǎng)基的配制參見蔡玉娟的碩士論文(蔡玉娟.產綠孢子阿維鏈霉菌遺傳改造和發(fā)酵條件的研究.碩士學位論文，2006，北京中國農業(yè)大學)。實施例3sig6基因缺失突變株的獲得分別收集以上經驗證正確的含有pLBll質粒和對照質粒PKC1139轉化子的孢子， 以每培養(yǎng)皿約100個孢子涂布于含有安普霉素的YMS平板上，置于培養(yǎng)48-7池，當菌落直徑約2mm左右，即將形成氣生菌絲時，將平板轉移至39°C高溫培養(yǎng)7天后，含有pLBll 的一些菌落上出現扇形生長，而含有PKC1139的菌落移至39°C后不再生長。這是由于 pKCl 139為溫敏型的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，當溫度高于34°C時不能自我復制，因此在含有安普霉素的YMS培養(yǎng)基上無法生長；只有當重組質粒pLBll所攜帶的sig6基因上、下游序列與阿維鏈霉菌染色體上同源區(qū)段發(fā)生同源重組，并通過單交換整合到染色體上的菌株才能表達安普霉素的抗性基因，從而在含有安普霉素的YMS培養(yǎng)基上生長。將39°C長出的抗安普霉素的單交換突變株在不添加抗生素的YMS平板上傳代，共轉接2-4次后，篩選安普霉素敏感的雙交換重組體。挑取其中的10株菌，與阿維鏈霉菌ATCC 31267 —起在YEME 中振蕩培養(yǎng)48h，均未能從中提取出質粒，說明重組質粒pLBll已被消除。利用PCR 對Aprs突變株加以驗證。分別獲得多株ATCC 31267的sig6缺失突變株。sig6缺失載體 pLBll與阿維鏈霉菌ATCC 31267染色體的同源雙交換示意圖如圖2所示。實施例4阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267及sig6缺失突變株發(fā)酵生產阿維菌素一、阿維鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基可溶性淀粉30g，麥芽膏2g，大豆蛋白胨2g，CoCl2 ·6Η20 5mg，加蒸餾水至 1L，調 pH 至 7. 0-7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基I 可溶性淀粉 50g，酵母粉 12g，MgSO4 ·7Η20 0. 5g, K2HPO4 ·3Η20 0. 5g， KCl 4g, CaC032g, CoCl2 · 6H20 5mg，加蒸餾水至 1L，調 pH 至 7. 0-7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基II 可溶性淀粉70g，花生蛋白粉20g，麥芽糖30g，MgSO4 · 7H20 0. 3g， K2HPO4 · 3H20 0. 3g, KCl 3g, (MM)2SO4O. lg, CaCO3Ig, CoCl2 · 6H20 7. 5mg，加蒸餾水至 1L，調 pH 至 7· 0-7. 2。二、發(fā)酵產物的HPLC分析1.樣品處理取1. OmL發(fā)酵液，加入4. OmL甲醇，浸泡30分鐘以上，每隔10分鐘振蕩一次，4000rpm離心10分鐘，取上清液進樣分析；2. HPLC分析條件CW反相柱，柱長150mm，柱內徑4. 6mm,柱溫40°C，流動相為甲醇水(85 15)，流速1. OmL/min,進樣體積20 μ L，波長為246nm。三、ATCC 31267及其不同sig6缺失突變株的發(fā)酵結果阿維鏈霉菌野生型菌株ATCC 31267及其sig6缺失突變株在YMS培養(yǎng)基上長出豐富的孢子后接種于種子培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)中，28°C搖床培養(yǎng)M小時(轉速180rpm，偏心距2. 5em)。按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶) 中，培養(yǎng)10天(轉速250rpm，偏心距2. 5em)，放瓶，用甲醇提取-HPLC法測定阿維菌素的發(fā)酵單位，結果如圖3所示。圖3的發(fā)酵結果顯示，sig6基因的缺失突變株與出發(fā)菌株相比，阿維菌素發(fā)酵單位與出發(fā)菌株相比均明顯增加，缺失突變株的阿維菌素Bl組分產量是出發(fā)菌株的2. 11倍。 sig6基因缺失對阿維菌素合成有顯著促進作用。
四、ATCC 31267及其不同sig6缺失突變株在發(fā)酵培養(yǎng)基II中的發(fā)酵結果圖4的發(fā)酵結果顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)基II中，sig6基因的缺失突變株與出發(fā)菌株相比，阿維菌素發(fā)酵單位與出發(fā)菌株相比也明顯增加，缺失突變株的阿維菌素Bl組分產量是出發(fā)菌株的2. 21倍。sig6基因缺失在發(fā)酵培養(yǎng)基II中對阿維菌素合成也有顯著促進作用。實施例5工程菌株的穩(wěn)定性考察將實施例3中構建的sig6基因缺失的基因工程菌株分別在YMS斜面上連續(xù)轉接五次，發(fā)現所得菌株與出發(fā)菌株在形態(tài)特征和培養(yǎng)特征上相同，生長狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定。 經轉接五次后的各個工程菌株再進行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢驗阿維菌素產量均未發(fā)生明顯變化，說明所構建的工程菌是穩(wěn)定的。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.Sig6基因在提高菌種的阿維菌素產量中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，通過在菌種中缺失sig6基因，以提高阿維菌素產量。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述菌種為阿維鏈霉菌(Sti^ptomyces avermitilis).
4.一種缺失sig6基因的產阿維菌素的基因工程菌。
5.如權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，其出發(fā)菌為阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)。
6.如權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，其出發(fā)菌為阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)ATCC 31267。
7.一種制備權利要求4-6任一項所述基因工程菌的方法，其包括如下步驟構建sig6 基因的缺失載體，并將該缺失載體引入產阿維菌素的菌種中獲得sig6的缺失重組菌。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于構建sig6基因缺失載體的出發(fā)載體為任意一種含有鏈霉菌溫度敏感型復制子的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述穿梭載體為pKC1139、pGM160、pHZ132 或PCZA185。
10.一種提高阿維菌素產量的方法，其是利用權利要求4-6任一項所述的基因工程菌生產阿維菌素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高阿維菌素產量的方法及生產菌株，其是將阿維鏈霉菌中編碼細胞質外功能亞家族RNA聚合酶σ因子(ECFsubfamily RNA polymerase sigma factor)的sig6基因通過基因缺失載體引入阿維鏈霉菌中，獲得缺失sig6基因的重組菌，使其不再合成σ6，從而提高阿維菌素的產量。本發(fā)明的基因工程菌可直接用于阿維菌素的發(fā)酵生產，提高阿維菌素的發(fā)酵單位，降低生產成本。
文檔編號C12P19/62GK102162003SQ20111005011
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權日2011年3月2日
發(fā)明者姜利濱, 宋淵, 文瑩, 李季倫, 陳芝 申請人:中國農業(yè)大學