專(zhuān)利名稱(chēng)：沙門(mén)氏菌微量mpn檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微量培養(yǎng)基培養(yǎng)和鑒別沙門(mén)氏菌，并根據(jù)MPN方法進(jìn)行樣品中沙門(mén)氏菌快速定量檢測(cè)，屬微生物培養(yǎng)與檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1885年沙門(mén)氏等在霍亂流行時(shí)分離 到豬霍亂沙門(mén)氏菌，故定名為沙門(mén)氏菌屬，沙門(mén)氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌，它們有的專(zhuān)對(duì)人類(lèi)致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病。沙門(mén)氏菌病則是指由各種類(lèi)型沙門(mén)氏菌所引起的對(duì)人類(lèi)、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱(chēng)，它是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門(mén)氏菌為首位。自19世紀(jì)后期，沙門(mén)氏菌首次被鑒定為人類(lèi)的一種病原以來(lái)，檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門(mén)氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門(mén)氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè)，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過(guò)加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門(mén)氏菌受到了尚不致命的損傷或稱(chēng)“致傷”。這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門(mén)氏菌的食品分析家來(lái)說(shuō)有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門(mén)氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，專(zhuān)門(mén)針對(duì)以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要3 5天才能完成。用于沙門(mén)氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟。第一步(預(yù)增菌)，將樣品加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37°C，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng)。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液PH值穩(wěn)定)，但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭(zhēng)論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點(diǎn)。目前應(yīng)用的主要有如下3種類(lèi)型連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒(méi)有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門(mén)氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對(duì)平板上肉眼可見(jiàn)的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè)，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)法全過(guò)程需時(shí)至少7 10天，才能得出明確的診斷結(jié)果。以上傳統(tǒng)的檢測(cè)方法即為GB4789. 4-2010是目前我國(guó)規(guī)定的對(duì)食品中沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要是根據(jù)沙門(mén)氏菌的生化特性，進(jìn)行前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型五個(gè)步驟。步驟繁瑣，所耗時(shí)間較長(zhǎng)，給食品檢驗(yàn)工作帶來(lái)很多不便。近年來(lái)也出現(xiàn)很多新的檢測(cè)方法分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法以及噬菌體裂解試驗(yàn)、葡萄球菌A蛋白協(xié)凝試驗(yàn)法、4-甲基傘形酮辛酯(MUCAP)試劑檢測(cè)方法、電阻抗法等等，但這些方法也存在成本較高、技術(shù)較難、不便于推廣等缺陷。而涉及到沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)的就比較少了，主要就是平板計(jì)數(shù)法和傳統(tǒng)MPN法。平板計(jì)數(shù)法是利用沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基或XLD瓊脂等，取樣品液直接涂布，培養(yǎng)24-48小時(shí)后，計(jì)數(shù)典型沙門(mén)氏菌菌落，并進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)鑒定，主要缺點(diǎn)是對(duì)于樣品中沙門(mén)氏菌含量比較少時(shí)，無(wú)法計(jì)數(shù)或計(jì)數(shù)結(jié)果相差太大，即靈敏度太低。傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌MPN計(jì)數(shù)法是9管法，即取三個(gè)連續(xù)樣品稀釋度，每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù)，用9管TTB或SC增菌18-24小時(shí)，然后分別接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基平板或XLD瓊脂平板，挑取可疑菌落鑒定后查MPN表。此法靈敏度可以，但是操作復(fù)雜繁瑣，需準(zhǔn)備大量試管、平皿等耗材，特別是樣品量大時(shí)，需要大量人力和物力。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種改良的MPN檢測(cè)方法，以便快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中沙門(mén)氏菌的污染程度。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過(guò)改變培養(yǎng)基成份把傳統(tǒng)的MPN檢測(cè)方法中的多個(gè)實(shí)驗(yàn)單元整合在一起，利用2塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板(4個(gè)梯度，3個(gè)重復(fù))進(jìn)行增菌、培養(yǎng)、檢測(cè)，舍棄了傳統(tǒng)的9管法，極大的減少了工作量，解決了傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大的問(wèn)題。技術(shù)方案包括如下步驟(1)在12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入適量改良TSB，然后將待測(cè)樣品接入孔中進(jìn)行增菌，采用三個(gè)以上連續(xù)梯度稀釋?zhuān)沃貜?fù)試驗(yàn)，利用增菌液的高營(yíng)養(yǎng)，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇、使所有微生物生長(zhǎng)；(2)在另一 12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入適量改良MSRV，將步驟⑴增菌后的樣品液對(duì)應(yīng)接到孔中，過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)樣品的顯色情況以及細(xì)菌遷移情況初步判斷樣品中是否含有沙門(mén)氏菌，之后利用顯色培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)；(3)將最終確認(rèn)的陽(yáng)性情況利用MPN軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到樣品中所含沙門(mén)氏菌的最大可能數(shù)量。具體步驟如下(I)配制改良TSB，滅菌后將其加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，然后取適量待測(cè)樣品分別加入Al、BI、Cl，移液槍吹打混勻，吸取其500 ii L于A2、B2、C2，移液槍吹打混勻，以此類(lèi)推，各做3組平行，36°C過(guò)夜培養(yǎng)。(2)配制改良MSRV，煮沸滅菌后將其加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對(duì)應(yīng)加入到每個(gè)孔中，42°C培養(yǎng)24h。當(dāng)顏色變?yōu)樽仙页霈F(xiàn)遷移現(xiàn)象的，視為陽(yáng)性，其他視為陰性。陽(yáng)性孔挑取紫色遷移菌落，接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，再進(jìn)行TSI/LIA/尿素和A-F-O血清試驗(yàn)，確認(rèn)陽(yáng)性樣品。(4)利用MPN軟件對(duì)陽(yáng)性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到樣品中所含沙門(mén)氏菌的最大可、能數(shù)量。改良TSB配方TSB30g/L ；土溫 80 (Tween 80)0. 5g/L ；改良MSRV配方MgCl25-8g/L ；酸水解酪蛋白4-10g/L;
大豆胨2-10g/L ；蛋白胨2-10g/L;NaCl5_8g/L ；KH2PO4I. 5g/L ；孔雀綠草酸鈉0. 04g/L ；抗生素0. Olg/L ；顯色劑0. 1-0. 8g/L ；瓊脂3_5g/L ；本發(fā)明有益效果是采用兩塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板，兩種改良培養(yǎng)基，兩個(gè)步驟，三大時(shí)間，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)出食品中沙門(mén)氏菌的含量，并且當(dāng)食品中沙門(mén)氏菌含量較低時(shí)，具有很好的靈敏度。


圖I為本發(fā)明所述12孔細(xì)菌培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明所述20h時(shí)，沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌增菌液效果照片；其中2-1為沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，2-2為鼠傷寒沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，2-3為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液增菌效果照片。圖3為本發(fā)明所述24h時(shí)，沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中3-1沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，3-2鼠傷寒沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，
3-3為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液增菌效果照片。圖4為本發(fā)明所述48h時(shí)，沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中4-1沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，4-2鼠傷寒沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，
4-3為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液增菌效果照片。圖5為本發(fā)明所述7 時(shí)，沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中5-1沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，5-2鼠傷寒沙門(mén)氏菌三組平行增菌效果照片，
5-3為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液增菌效果照片。圖6為本發(fā)明所述沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌液在沙門(mén)氏菌顯色板上劃線，36°C培養(yǎng)60h后各菌生長(zhǎng)情況照片。其中6-1為沙門(mén)氏菌效果照片，6-2為鼠傷寒沙門(mén)氏菌效果照片，6-3、6-4為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌很合菌液外圍遷移效果照片，6-5、6-6為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液內(nèi)圈菌落效果照片，6-7為沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合菌液落邊緣線效果照片。
具體實(shí)施例方式采用下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例(I)配制改良TSB，滅菌后加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，Al、BI、Cl加2. 5ml，其余加 2ml。稀釋沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌至10_7，吸取100 U I分別加入上述A1、B1、C1孔中，混勻后吸取500iU于A2、B2、C2，以此類(lèi)推。沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌各做3組平行。取沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌或產(chǎn)氣腸桿菌或阪崎腸桿菌或銅綠假單胞菌10211或陰溝腸桿菌的菌液各100 iil，混勻后進(jìn)行稀釋?zhuān)?0_6，吸取100 分別加入上述A1、B1、Cl孔中，混勻后吸取500iil于A2、B2、C2，以此類(lèi)推。做3組平行。以上均36°C培養(yǎng)16h。
取沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的適宜梯度菌液各lOOiU，PCA傾注計(jì)數(shù)。以上36°C 培養(yǎng) 24h。 PCA傾注計(jì)數(shù)結(jié)果如下
—~菌種名！平行計(jì)數(shù)(適宜梯度取IOO(Ld)平均值
沙門(mén)氏菌
(1(廣)220243254239
194203213203.3
菌(10")(2)配制改良MSRV，煮沸滅菌后加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，每孔加2. 5ml。待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對(duì)應(yīng)加入到孔中，42°C培養(yǎng)24h。所述的對(duì)應(yīng)加入指兩培養(yǎng)板之間Al、BI、Cl相對(duì)應(yīng)，A2、B2、C2相對(duì)應(yīng)，以此類(lèi)推。24h時(shí)，沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌有非常輕微的紫色，混合菌液紫色相對(duì)較明顯。見(jiàn)附圖3。MPN軟件計(jì)算得出沙門(mén)氏菌1(T6 菌液4500MPN/mL ；(沙門(mén)氏菌菌液4.5*109MPN/mL)鼠傷寒沙門(mén)氏菌1(T6菌液2200MPN/mL ；(鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液2.2*109MPN/mL)IO6混合菌液中沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌750MPN/mL ；(混合菌液中沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌7.5*108MPN/mL)PCA 計(jì)數(shù)沙門(mén)氏菌 1(T6 菌液2390cfu/mL ；(沙門(mén)氏菌菌液'2. 4*109cfu/mL)鼠傷寒沙門(mén)氏菌10_6菌液2033cfu/mL ；(鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液2.0*109cfu/mL)10_6混合菌液中沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌737MPN/mL ；(混合菌液中沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)(7.4*108MPN/mL)
總體來(lái)說(shuō)，MPN值與PCA計(jì)數(shù)很接近，說(shuō)明配方改良較好。只是紫色邊緣情況不是很理想，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。48h時(shí)，沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌有較明顯的紫色，混合菌液出現(xiàn)紫色邊緣，且比沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌都要更加明顯。(見(jiàn)圖4)72h時(shí)，沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、混合菌液的紫色均比較明顯，其中混合菌液遷移較慢，紫色更集中。(見(jiàn)圖5)挑取沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和混合菌液的7個(gè)點(diǎn)，在沙門(mén)氏菌顯色板上劃線，36°C培養(yǎng)60h。(見(jiàn)圖6) 從上述微生物生長(zhǎng)情況我們可以看出，在混合菌液中，沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌主要集中在外圈遷移，也就是說(shuō)沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的遷移速度是比較快的，這 跟單一純菌的遷移情況也一致。通過(guò)mini-MPN方法沙門(mén)氏菌的計(jì)數(shù)結(jié)果與加入的沙門(mén)氏菌計(jì)數(shù)結(jié)果基本一致。此發(fā)明可以用于樣品沙門(mén)氏菌計(jì)數(shù)。同時(shí)，此發(fā)明也可用副溶血性弧菌和0157菌的計(jì)數(shù)。所用改良TSB配方TSB30g/L ；土溫 80 (Tween80) 0. 5g/L ；所用改良MSRV配方MgCl28g/L ；酸水解酪蛋白 4g/L;大豆胨10g/L ；蛋白胨2g/L;NaCl8g/L ；KH2PO4I. 5g/L ；孔雀綠草酸鈉 0. 04g/L ；抗生素0. 01g/L ；顯色劑0. 8g/L ；瓊脂3g/L。所用TSB購(gòu)于市品，由如下成分組成胰蛋白胨15.0g/L大豆蛋白胨3.0g/L氯化鈉5.0g/L磷酸氫二鉀2. 5g/L葡萄糖2. 5g/L。
權(quán)利要求
1.沙門(mén)氏菌微量MPN檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)如下步驟(1)在12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中分別加入改良的TSB，然后將待測(cè)樣品接入孔中進(jìn)行增菌，采用三個(gè)以上連續(xù)梯度稀釋?zhuān)沃貜?fù)試驗(yàn)；(2)在另一 12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入改良的MSRV，將步驟(I)增菌后的樣品液對(duì)應(yīng)接到孔中，過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)樣品的顯色情況以及細(xì)菌遷移情況初步判斷樣品中是否含有沙門(mén)氏菌，之后利用顯色培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)；(3)將最終確認(rèn)的陽(yáng)性情況利用MPN軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到樣品中所含沙門(mén)氏菌的數(shù)量； 改良的TSB配方 TSB30g/L ； 土溫 800. 5g/L ； 改良的MSRV配方 MgCl25-8g/L ； 酸水解酪蛋白4-10g/L; 大豆胨2-10g/L ； 蛋白胨2-10g/L; NaCl5-8g/L ； KH2PO4I. 5g/L ； 孔雀綠草酸鈉0. 04g/L ； 抗生素0. 01g/L ； 顯色劑0. 1-0. 8g/L ； 瓊脂3-5g/L。
2.如權(quán)利要求I所述的沙門(mén)氏菌微量MPN檢測(cè)方法，其特征在于， 具體步驟如下(1)配制改良的TSB，滅菌后分別將其加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，然后取待測(cè)樣品分別加入到細(xì)菌培養(yǎng)板的A1、B1、C1孔中，移液槍吹打混勻，吸取其500 ii L分別加入到細(xì)菌培養(yǎng)板的A2、B2、C2孔中，移液槍吹打混勻，以此類(lèi)推，各做3組平行，36°C過(guò)夜培養(yǎng)；(2)配制的改良MSRV，煮沸滅菌后將其加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個(gè)孔中，待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對(duì)應(yīng)加入到每個(gè)孔中，42°C培養(yǎng)24h;當(dāng)顏色變?yōu)樽仙页霈F(xiàn)遷移現(xiàn)象，視為陽(yáng)性，其他視為陰性；陽(yáng)性孔挑取紫色遷移菌落，接種于沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，再進(jìn)行TSI/LIA/尿素和A-F-O血清試驗(yàn)，確認(rèn)陽(yáng)性樣品； (4)利用MPN軟件對(duì)陽(yáng)性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到樣品中所含沙門(mén)氏菌數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種沙門(mén)氏菌微量MPN檢測(cè)方法，涉及利用微量培養(yǎng)基培養(yǎng)和鑒別沙門(mén)氏菌，并根據(jù)MPN方法進(jìn)行樣品中沙門(mén)氏菌快速定量檢測(cè)，屬微生物培養(yǎng)與檢測(cè)領(lǐng)域。通過(guò)改變培養(yǎng)基成份把傳統(tǒng)的MPN檢測(cè)方法中的多個(gè)實(shí)驗(yàn)單元整合在一起，利用2塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板(4個(gè)梯度，3個(gè)重復(fù))進(jìn)行增菌、培養(yǎng)、檢測(cè)，舍棄了傳統(tǒng)的9管法，極大的減少了工作量，解決了傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大的問(wèn)題。能簡(jiǎn)便地檢測(cè)出食品中沙門(mén)氏菌的含量，并且當(dāng)食品中沙門(mén)氏菌含量較低時(shí)，具有很好的靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102732595SQ201110022319
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者廖興廣, 鄒長(zhǎng)軍 申請(qǐng)人:廖興廣, 鄒長(zhǎng)軍