專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)和用于永生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)細(xì)胞或生物體的生理或病理狀態(tài)的方法。本發(fā)明還涉及疾病(例如癌癥)的診斷和治療。參考美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/713，992、12/065，549、12/065，551、60/878，222、12/377，398,61/066,671,61/227,865和61/257，121。還參考國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB2005/003206,PCT/SG2006/000233,PCT/SG2006/000232,PCT/SG2007/000257和PCT/SG2009/000062。前述申請(qǐng)、本申請(qǐng)和前述申請(qǐng)中(包括姆件前述申請(qǐng)審查過(guò)程中)引用或參考的每份文件(“申請(qǐng)和文章引用的文件”)，以及在每篇前述申請(qǐng)和文章中以及在任何申請(qǐng)和文章引用的文件中引用或提及的任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或目錄，均藉此通過(guò)引用納入本文。再者，本文中引用的所有文件，本文引用的文件中引用或參考的所有文件，以及本文或任何文件中引用或提及的任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或目錄，均藉此通過(guò)引用納入本文。通過(guò)引用納入本文的文件或其中的任何教導(dǎo)均可用于實(shí)施本發(fā)明。通過(guò)引用納入本文的文件不等同于現(xiàn)有技木。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一方面提供了ー種監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的方法，所述方法包括為所選擇的由所述細(xì)胞分泌的microRNA(miRNA)種類(lèi)建立(a)前體形式的所述miRNA種類(lèi)(前體miRNA)與(b)成熟形式的所述miRNA種類(lèi)(成熟miRNA)的比例，其中如此建立的所述前體miRNA與成熟miRNA的比例指示所述細(xì)胞狀態(tài)。所述細(xì)胞可以被包含在細(xì)胞塊、組織、器官或生物體中，所述前體miRNA與成熟miRNA的比例指示所述各個(gè)細(xì)胞塊、組織、器官或生物體的狀態(tài)。所述miRNA種類(lèi)可以被包含在所述細(xì)胞分泌的外核體中，并且所述方法可以包括獲得這類(lèi)外核體并且獲得來(lái)自其的前體和成熟形式的所述miRNA種類(lèi)。所述外核體可以從生物體的樣品中獲得。所述生物體可以包括所述細(xì)胞。所述樣品可以包括血液樣品、血清樣品、唾液樣品或尿樣。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以通過(guò)與包含核酸序列的陣列雜交而確立，所述核酸序列能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的所述miRNA種類(lèi)。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以通過(guò)實(shí)時(shí)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)而建立。所述方法可以包括建立包含對(duì)于多個(gè)所選擇的miRNA種類(lèi)的多個(gè)前體miRNA與成熟miRNA的比例的譜,姆個(gè)均指示所述細(xì)胞狀態(tài)。所述譜可通過(guò)與包含多個(gè)探針的陣列雜交而建立，所述探針能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的多個(gè)所選擇的miRNA種類(lèi)。所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括生理狀態(tài)，例如細(xì)胞周期狀態(tài)、分化狀態(tài)、發(fā)育狀態(tài)、代謝狀態(tài)或病理狀態(tài)，例如疾病狀態(tài)、人疾病狀態(tài)、糖尿病狀態(tài)、免疫紊亂狀態(tài)、神經(jīng)退行性疾病狀態(tài)、致癌狀態(tài)、癌性狀態(tài)或腫瘤狀態(tài)。本發(fā)明的第二方面提供了ー種方法(a)用于檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)變化，所述方法包括檢測(cè)所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)的變化，其中種類(lèi)變化指示所述細(xì)胞狀態(tài)的變化。本發(fā)明人提供了ー種用于確定細(xì)胞在具體狀態(tài)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)與已知處于該具體狀態(tài)的細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)進(jìn)行比較。本發(fā)明人提供了一種監(jiān)測(cè)有機(jī)體狀態(tài)的方法，所述方法包括從該生物體獲得樣品或者獲得該生物體的樣品，對(duì)所述樣品實(shí)施前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，并且從因此獲得的所述前體miRNA與成熟miRNA的比例確定所述生物體的狀態(tài)。本發(fā)明人提供了一種檢測(cè)生物體疾病的方法，所述方法包括從該生物體獲得樣品或者獲得該生物體的樣品，對(duì)所述樣品實(shí)施前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，并且將因此獲得的所述前體miRNA與成熟miRNA的比例與已知為患病生物體的樣品或來(lái)自患病生物體的樣品的前體miRNA與成熟miRNA的比例進(jìn)行比較。本發(fā)明人提供了一種治療或預(yù)防生物體的疾病的方法，所述方法包括如上文所示檢測(cè)生物體的疾病，并對(duì)所述生物體給予用于該疾病的治療物。所述細(xì)胞可以包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括未轉(zhuǎn)化的狀態(tài)和轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。所述轉(zhuǎn)化的狀態(tài)可以包括c-myc轉(zhuǎn)化狀態(tài)。所述microRNA可以包括hsa-let-7bmicroRNA(miRBase登錄號(hào)MI0000063)。轉(zhuǎn)化狀態(tài)下的所述比例可以是正常狀態(tài)的2.8倍。上述的任意組合都是可以的。本發(fā)明的第三方面提供了ー種包含多個(gè)核酸序列的陣列，所述核酸序列能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的多個(gè)miRNA種類(lèi)。本發(fā)明的第四方面提供了ー種包括以下步驟的方法(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC);并(13)將癌基因引入所述間充質(zhì)干細(xì)胞以從而轉(zhuǎn)化它，其中所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞不將所述癌基因的基因產(chǎn)物分泌至其在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。所述癌基因可以包括c-myc。所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以包括已建立的細(xì)胞系例如huES9.El。所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以來(lái)自于臍帯。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可能能夠繞過(guò)老化。與尚未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有增高的増殖速度。與尚未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有降低的群體倍增時(shí)間，例如24小吋。與尚未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有増加的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明的第五方面提供了ー種提供條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括上文示出的步驟，然后在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或其后代以條件化所述培養(yǎng)基，并從所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞分離所述條件化的培養(yǎng)基。本發(fā)明的第六方面提供了ー種提供外核體的方法，所述方法包括(a)通過(guò)權(quán)利要求12的方法得到間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM);(b)濃縮所述間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，例如通過(guò)在>1000kDa膜上超濾；(c)對(duì)所述濃縮的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行分子排阻色譜，例如使用TSKGuard柱SWXL，6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL，7.8x300mm柱；并且(d)選擇呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射的UV吸收級(jí)分，例如在220nm下，所述動(dòng)態(tài)光散射例如通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)檢測(cè)，其中步驟(d)例如包括收集以11-13分鐘(例如12分鐘)的保留時(shí)間洗脫出的級(jí)分。本發(fā)明的第七方面提供了一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括通過(guò)上文示出的方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)或外核體，井根據(jù)情況不同將所述MSC-CM或外核體與可藥用載體或稀釋劑混合。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可以包括間充質(zhì)干細(xì)胞的至少ー種生物學(xué)性質(zhì)。所述生物學(xué)性質(zhì)可以包括心臟保護(hù)作用。所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可能能夠減少梗塞面積，例如，如在小鼠或豬的心肌缺血和再灌注損傷模型中測(cè)定的。所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可能能夠減少氧化應(yīng)激，例如，如在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定法中測(cè)定的。本發(fā)明的第八方面提供了ー種可通過(guò)上文所述方法獲得的永生化的間充質(zhì)干細(xì)胞、條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施將運(yùn)用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力所能及的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有說(shuō)明。例如，參見(jiàn)J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaooratoryManual,SecondEaition，Books1—3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBi—ology，ch.9，13，and16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJames0，D.McGee，1990，InSituHybridization-PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress;D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartA!SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodiesALa-boratoryManual!PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,editedbyRama—krishnaSeethala，PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);和LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些一般性教材的每ー篇都通過(guò)引用的方式納入本文。圖1A、圖1B、圖1C、圖1D、圖IE和圖IF為示出了hESC-MSC的轉(zhuǎn)化的圖表。圖1A.對(duì)來(lái)自myc轉(zhuǎn)染的HuES9.ElMSC(El-myc21.I).GFP轉(zhuǎn)染的HuES9.ElMSC(El-GFP)和親本MSC、HuES9.El(El)的細(xì)胞DNA的PCR分析。使用分別對(duì)外顯子2和外顯子3特異的引物擴(kuò)增DNA。所述內(nèi)源性myc基因的預(yù)計(jì)PCR片段大小為1.7kb，所述轉(zhuǎn)染的myccDNA的是0.36kb，這由來(lái)自所述myc-慢病毒的擴(kuò)增片段表示。圖1B.在光學(xué)顯微鏡下觀察到的轉(zhuǎn)染的MSC的細(xì)胞形態(tài)。圖1C.在來(lái)自不同傳代的El-myc21.I和GFP-MSC的RNA上對(duì)所述c_mycmRNA水平進(jìn)行的定量RT-PCR。將所述相對(duì)myc轉(zhuǎn)錄物水平對(duì)GFP-MSC的相對(duì)myc轉(zhuǎn)錄物水平標(biāo)準(zhǔn)化。圖1D.相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。首先通過(guò)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性將IUg細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)用于延伸TS引物，然后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物定量。所述Ct值代表量所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物的量，因此間接與所述裂解物中端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性成比例。圖1E.通過(guò)G條紋染色法對(duì)El-myc16.3的核型分析。圖1F.細(xì)胞周期速率。用CFDA標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)它們的熒光。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞熒光的損失均用于計(jì)算所述細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分裂的數(shù)目，如材料和方法中所述。圖為示出了表面抗原作譜的圖表。將HuES9.El和El-myc16.3MSC用與熒光染料綴合的特異性抗體染色并通過(guò)FACS分析。El-myc16.3的熒光是pl6或p6細(xì)胞的平均細(xì)胞熒光。通過(guò)用異構(gòu)型匹配的小鼠單克隆抗體孵育所述細(xì)胞來(lái)評(píng)估非特異性熒光。圖3A、圖3B和圖3C為示出了Hus9El和El-myc16.3MSC的分化的圖。MSC被誘導(dǎo)發(fā)生(圖3A)骨發(fā)生井隨后用vonKossa染色劑染色；(圖3B)軟骨發(fā)生井隨后用阿辛藍(lán)染色；(圖3C)脂肪發(fā)生，其中El-mycl6.3和Hus9ElMSC被暴露于脂肪形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基2天。圖4A、圖4B和圖4C為示出了基因表達(dá)分析的圖表。將來(lái)自Hus9El和El_myc16.3MSC的RNA雜交于SentrixHumanRef-8ExpressionBeadChipVersion3并通過(guò)Beadstudio和GenespringGX10分析。圖4A.使用Beadstudio分析成對(duì)比較HuES9.El和Eliyc16.3MSC之間的基因表達(dá)。圖4B和圖4C.PANTHER分析。使用PANTHER算法分析El_mycl6.3MSC中的161個(gè)過(guò)表達(dá)>2倍的基因和226個(gè)低表達(dá)>2倍的低表達(dá)基因。將在每個(gè)基因集合中對(duì)每個(gè)生物過(guò)程的觀察基因頻率與參考頻率比較，所述參考頻率在該情形下是NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中該生物過(guò)程的基因頻率。那些觀察頻率以P〈0.05超過(guò)參考頻率的生物過(guò)程被認(rèn)為是顯著的。圖5A、圖5B和圖5C為示出了對(duì)分泌的分析的圖表。圖5A.蛋白質(zhì)印跡分析。將來(lái)自ElMSC或Elmyc-MSC的細(xì)胞裂解物、條件培養(yǎng)基(CM)和HPLC純化外核體的蛋白在SDS-PAGE上分離并用抗myc的抗體、抗Actin的抗體和抗⑶9的抗體探測(cè)。圖5B.對(duì)來(lái)自Elmyc-MSC的CM的HPLC分級(jí)分離和動(dòng)態(tài)光散射。使用BioS印S4000,7.8mmx30cm柱在HPLC上對(duì)CM分級(jí)分離。使用含150mMNaCl的pH7.2的20mM磷酸緩沖液洗脫CM中的組分。洗脫模式是等度的，運(yùn)行時(shí)間是40分鐘。對(duì)所述洗脫液在220nm下監(jiān)測(cè)UV吸光度。然后通過(guò)光散射分析每個(gè)洗脫峰。收集最快的洗脫峰(箭頭)用于在小鼠缺血/再灌注損傷模型中進(jìn)行測(cè)試。圖5C.將0.3ygHPLC純化的外核體靜脈給予小鼠急性心肌/缺血再灌注損傷模型，5分鐘后進(jìn)行再灌注。測(cè)量梗塞面積(IS)，形式為在用鹽水(n=10)、來(lái)自Elmyc21.I的外核體(n=5)和來(lái)自Elmyc16.3的外核體(n=4)處理時(shí)風(fēng)險(xiǎn)面積(AAR)的百分?jǐn)?shù)。在以El-myc21.I外核體或El-myc16.3外核體處理的小鼠中的相對(duì)梗塞面積(IS/AAR)分別是23.4±8.2%,和22.6±4.5%,它們的相對(duì)梗塞面積顯著低于鹽水處理小鼠中38.5±5.6%的相對(duì)梗塞面積(分別為P〈0.001和p〈0.002)。圖6為示出了hESC-MSC的轉(zhuǎn)化的圖。圖6示出了來(lái)自myc轉(zhuǎn)染的MSC(myc-MSC)、GFP轉(zhuǎn)染的MSC(GFP-MSC)和親本MSC——HuES9.El(MSC)的細(xì)胞DNA的PCR分析。使用分別對(duì)外顯子2和外顯子3特異性的引物擴(kuò)增DNA。所述內(nèi)源性myc基因的預(yù)計(jì)PCR片段大小是I.7kb,所述轉(zhuǎn)染的myccDNA的是0.36kb。圖7示出了在來(lái)自myc-MSC或GFP-MSC的RNA上對(duì)c-mycmRNA進(jìn)行定量RT-PCR。圖8示出了轉(zhuǎn)染后hESC-MSC的細(xì)胞形態(tài)。將第22次傳代的HuES9.EIESC-MSC以含有c-myc或GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染。在第22次傳代時(shí)的轉(zhuǎn)染之后以及在隨后一次傳代的第23次傳代在光學(xué)顯微鏡下觀察c-myc或GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的形態(tài)。圖9示出了相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。首先將IUg細(xì)胞裂解物蛋白質(zhì)利用端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性延伸TS引物，然后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR定量所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物。代表所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物量的Ct值因此間接與所述裂解物中的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性成比例。圖10為示出了細(xì)胞分泌中前體與成熟miRA的比例的圖表。收獲由親本MSC或myc-MSC條件化的培養(yǎng)基，提取RNA，然后測(cè)定成熟miRNA和前體miRNA。使用對(duì)所述前體形式和成熟形式的hsa_let_7b(miRBase登錄號(hào)MI0000063)和hsa_let_7gmiRNA特異性的引物在所述RNA上進(jìn)行定量RT-PCR，并計(jì)算hsa-let-7b(miRBase登錄號(hào)MI0000063)和hsa-let_7gmiRNA的前體和成熟形式的比例。圖11為示出了為鑒定原始形式的miRNA而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的圖。圖12為示出了為鑒定前體形式的miRNA而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的圖。圖13為示出了為鑒定成熟形式的miRNA而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的圖。具體實(shí)施例方式間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是這樣的多能干細(xì)胞，即其具有有限但強(qiáng)的分化成間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型(例如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)的潛能，同時(shí)畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)可以忽略不計(jì)。MSC移植已經(jīng)被用于治療骨骼肌損傷，改善心血管疾病中的心臟功能以及減輕移植物抗宿主疾病的嚴(yán)重度[I]。在最近幾年，MSC移植已被證明在治療不同疾病時(shí)具有治療效果，但背后的機(jī)制尚有爭(zhēng)議[2，3，4，5，6，7，8，9]。ー些報(bào)道已經(jīng)表明MSC分泌的因子[10]是對(duì)動(dòng)脈生成[11]、腸中干細(xì)胞隱窩[12]、缺血性損傷[9，13，14，15，16，17，18]和紅細(xì)胞生成[19，20]的治療效果的主因。作為對(duì)旁分泌假說(shuō)的支持，許多研究已經(jīng)觀察到MSC分泌可能潛在地主要通過(guò)心臟和血管組織生長(zhǎng)和再生來(lái)修復(fù)受損心臟組織的細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子[21，22]。該旁分泌假說(shuō)可能潛在地提供一種非基于細(xì)胞的一替代方案，用于在治療心血管疾病中使用MSC[23]。非基于細(xì)胞的治療與基于細(xì)胞的治療相比通常更易于制造并更安全，因?yàn)樗鼈兪遣换畹牟⑶也灰l(fā)免疫排斥。本發(fā)明人以前已經(jīng)證明由來(lái)自人胚胎干細(xì)胞或胎兒組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)條件化的培養(yǎng)基[24，25，26]能夠保護(hù)心臟免遭心臟心肌缺血/再灌注損傷，并減少豬和小鼠的MI/R損傷模型中的梗塞面積[25，26，27]。隨后的研究證明了該心臟保護(hù)作用被外核體或直徑約50-100nm的微粒介導(dǎo)，這些微粒攜帶蛋白質(zhì)和RNA負(fù)載[24，25，26，27，28]。這些外核體能夠通過(guò)在HPLC上進(jìn)行尺寸排阻而被純化為大小均勻的顆粒群[25，26]，并在所述條件培養(yǎng)基劑量的約十分之一下在小鼠的MI/R損傷模型中減少梗塞面積。將外核體鑒定為所述MSC分泌中的治療劑能夠潛在地提供生物治療模式，而非基于細(xì)胞的治療模式。不像細(xì)胞，外核體不誘發(fā)急性免疫排斥并且不是活的且小得多。它們具有更低的安全風(fēng)險(xiǎn)，例如腫瘤或栓塞形成。與需要保持存活性的基于細(xì)胞的治療不同，制造和保存非存活的外核體的復(fù)雜性更低，因此成本更低。除了作為治療劑之外，外核體已經(jīng)被提出作為“天然”藥物送遞載體[29]。這些脂質(zhì)囊泡能夠被裝載治療劑，并被用于以細(xì)胞類(lèi)型特異的方式送遞所述試劑。hESC-MSC可以是用于有效產(chǎn)生外核體的理想細(xì)胞源。本發(fā)明人已經(jīng)證明，這些細(xì)胞能夠在外核體產(chǎn)生和收獲過(guò)程中被以化學(xué)上確定地方式培養(yǎng)，并且這些外核體能夠通過(guò)HPLC純化以生成大小均勻的顆粒群[25，26，27]。另ー優(yōu)點(diǎn)是這些細(xì)胞來(lái)自于hESC——一種可無(wú)限擴(kuò)增細(xì)胞源。雖然hESC-MSC在培養(yǎng)中也是高度可擴(kuò)增的，但是與它們的親本hESC不同，它們僅可以發(fā)生有限次細(xì)胞分裂，然后它們的生長(zhǎng)停止且它們衰老。因此，需要從hESC持續(xù)分離成批的新MSC來(lái)補(bǔ)充所述外核體的細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)每次分離都需要產(chǎn)生用于分離、測(cè)試和確認(rèn)的重復(fù)費(fèi)用。為了避免這種再次分離的需求并確保無(wú)限供應(yīng)相同的MSC，用于足以在商業(yè)上可持續(xù)地產(chǎn)生外核體作為治療劑或送遞載體，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了使用致癌轉(zhuǎn)化繞過(guò)衰老。致癌轉(zhuǎn)化能夠潛在地改變細(xì)胞生物學(xué)并影響所述外核體的產(chǎn)生或性質(zhì)。以前已經(jīng)報(bào)道，將v-myc基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入胎兒MSC使所述細(xì)胞永生，但不改變這些MSC的基本特性[30]。這里，本發(fā)明人將含編碼MYC蛋白的c-myc基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至第22和16次傳代的已經(jīng)報(bào)道的huES9.ElMSC中[24]，來(lái)分別生成ー個(gè)混合細(xì)胞系和三個(gè)獨(dú)立衍生的克隆細(xì)胞系。本發(fā)明人依照ISCT對(duì)MSC的最低定義標(biāo)準(zhǔn)[31]檢查了所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述標(biāo)準(zhǔn)即塑料貼附；CD29+、CD44+、CD49a+、CD49e+、CD105+、CD166+、MHCI+、CD34'CD45-和HLA-DRr的表面抗原譜；以及分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的可能性。評(píng)估這些細(xì)胞的分泌中外核體的存在情況，如前述在小鼠心肌缺血/再灌注損傷(MI/R)模型中測(cè)試這些外核體的治療效果[27]。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自人ESC來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hESC-MSC)的外核體或分泌的雙層脂囊泡已經(jīng)被證明可減少動(dòng)物模型中的心肌缺血/再灌注損傷。然而，因?yàn)閔ESC-MSC不是可無(wú)限擴(kuò)增的，大規(guī)模產(chǎn)生這些外核體將需要通過(guò)從hESC分離hESC-MSC來(lái)補(bǔ)充hESC-MSC，并發(fā)生用于測(cè)試和確認(rèn)每一新批次的重復(fù)成本。在本文中，本發(fā)明人研究了hESC-MSC的c-myc無(wú)限増殖化是否將繞過(guò)該限制，同時(shí)又不危及治療有效的外核體的產(chǎn)生。Myc-轉(zhuǎn)化的MSC很大程度與親本hESC-MSC相似，主要差異是塑料貼附降低、生長(zhǎng)加快、不會(huì)衰老、myc表達(dá)增加、失去體外脂肪發(fā)生潛能，這在技術(shù)上使得所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為非MSC細(xì)胞。然而，來(lái)自myc-轉(zhuǎn)化的MSC的外核體能夠減少小鼠的心肌缺血/再灌注損傷模型中的相對(duì)梗塞面積，表明產(chǎn)生治療性外核體的能力被保持。因此，本發(fā)明人首先提供了一種轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以獲自或分離自間充質(zhì)干細(xì)胞，例如通過(guò)用合適的轉(zhuǎn)化劑(例如癌基因)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的后代、細(xì)胞培養(yǎng)物或者包含這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的后代或細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞系。這類(lèi)細(xì)胞在本文件中可以稱(chēng)為“轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞”或通過(guò)本文件中描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，本發(fā)明人描述了ー種方法，包括步驟(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)；^(b)將癌基因引入所述間充質(zhì)干細(xì)胞，從而將其轉(zhuǎn)化，其中所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞不將所述癌基因的基因產(chǎn)物分泌至其在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。所述癌基因可以包括c-myc。所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以包括已建立的細(xì)胞系例如huES9.El。所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以來(lái)自于臍帶。與未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠繞過(guò)老化。與未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞具有増加的増殖速度。與未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有降低的群體倍增時(shí)間例如24小吋。與未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有増加的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明人描述了ー種提供條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括上文示出的步驟，然后在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或其后代以將其條件化，并從所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞中分離所述條件化的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明人還描述了ー種提供外核體的方法，所述方法包括(a)通過(guò)上文示出的方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM);(b)濃縮所述間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，例如通過(guò)在>1000kDa膜上超濾；(c)對(duì)所述濃縮的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行分子排阻色譜，例如使用TSKGuard柱SWXL，6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL，7.8x300mm柱；并且(d)選擇例如在220nm下呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射的UV吸收級(jí)分，所述動(dòng)態(tài)光散射例如通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)檢測(cè)，其中步驟(d)例如包括收集以11-13分鐘(例如12分鐘)的保留時(shí)間洗脫的級(jí)分。本發(fā)明人描述了ー種制備藥物組合物的方法，所述方法包括通過(guò)上文示出的方法得到間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)或通過(guò)上文示出的方法得到外核體，并根據(jù)情況不同將所述MSC-CM或所述外核體與可藥用載體或稀釋劑混合。所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可以包括間充質(zhì)干細(xì)胞的至少ー種生物學(xué)性質(zhì)，例如間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)的生物學(xué)活性，例如心臟保護(hù)作用。所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可以能夠減少梗塞面積，例如，如在心肌缺血和再灌注損傷的小鼠或豬模型中測(cè)定的；或者其能夠減少氧化應(yīng)激，例如，如在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定中測(cè)定的。所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可以適合用于治療選自如下的疾病心臟衰竭、骨髓病、皮膚病、燒傷和退行性疾病例如糖尿病、阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、癌癥、心肌梗塞、皮膚傷ロ、皮膚科疾病、皮膚科損害、皮炎、銀屑病、濕疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮膚癌、特應(yīng)性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、潰瘍、以誘導(dǎo)炎癥和免疫功能失調(diào)(其導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失)的初始損傷為特征的病理病癥、腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎或矯形疾??；或者可以在如下情況用于輔助個(gè)體中的傷ロ愈合、瘢痕減少、骨形成、骨移植或骨髄移植，或者(i)在調(diào)節(jié)選自如下任何ー種或多種通路的通路時(shí)=RhoGTP酶的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、整聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥、FGF信號(hào)傳導(dǎo)通路、EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、血管發(fā)生、血纖維蛋白溶酶原活化的級(jí)聯(lián)、凝血、糖酵解、泛素蛋白酶體通路、嘌呤的從頭生物合成、TCA循環(huán)、苯丙氨酸生物合成、血紅素生物合成；(ii)在調(diào)節(jié)包括如下任何一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的過(guò)程時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞粘著、胞吞作用、有絲分裂、胞吐作用、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞周期、免疫力和防御、細(xì)胞因子/趨化因子介導(dǎo)的免疫力、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)因子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞粘著介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、JAK-STAT級(jí)聯(lián)、抗氧化和自由基清除、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、血液凝固、發(fā)育過(guò)程、中胚層發(fā)育、骨骼發(fā)育、血管發(fā)生、肌肉發(fā)育、肌收縮、蛋白質(zhì)代謝和修飾、蛋白質(zhì)酶解、蛋白質(zhì)折疊、蛋白復(fù)合體裝配、氨基酸活化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、其他蛋白的革巴向和定位、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)ニ硫鍵異構(gòu)酶反應(yīng)、碳水化合物代謝、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代謝、嘌呤代謝、磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)、維生素代謝、氨基酸生物合成、前體mRNA加工、翻譯調(diào)控、mRNA剪接；或者(iii)在提供包括如下任何一種或多種功能的功能時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、其他細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白、其他細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白、蛋白酶、金屬蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、氧化還原酶、脫氫酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白、伴侶素、Hsp70家族伴侶蛋白、其他伴侶蛋白、合成酶、合酶和合成酶、選擇性鈣結(jié)合蛋白、氨酰tRNA合成酶、裂解酶、異構(gòu)酶、其他異構(gòu)酶、ATP合酶、水合酶、轉(zhuǎn)氨酶、其他裂解酶、其他酶調(diào)節(jié)物、選擇性調(diào)節(jié)分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、非馬達(dá)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白、膜聯(lián)蛋白、微管蛋白、細(xì)胞粘著分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合馬達(dá)蛋白、中間絲、核糖核蛋白、核糖體蛋白質(zhì)、翻譯因子、其他RNA結(jié)合蛋白、組蛋白丐調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、囊泡外殼蛋白。本發(fā)明人還描述了可通過(guò)上文示出的方法得到的永生化的間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明人還描述了可通過(guò)上文示出的方法得到的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明人還描述了可通過(guò)上文示出的方法得到的外核體。本發(fā)明人還描述了可通過(guò)上文示出的方法得到的藥物組合物。本發(fā)明人還描述了用于遞送條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物的遞送系統(tǒng)，包括如上文示出的條件培養(yǎng)基的源、如上文示出的外核體的源或如上文示出的藥物組合物的源，以及可進(jìn)行遞送所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物至靶的操作的分配器。本發(fā)明人還描述了如上文示出的遞送系統(tǒng)在遞送所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物至靶的方法中的用途。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以包括心臟保護(hù)活性。所述心臟保護(hù)活性可以在急性心肌梗塞(AMI)的小鼠模型中測(cè)定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以通過(guò)轉(zhuǎn)化以任何方式獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞得到。作為所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以包括任何合適的間充質(zhì)干細(xì)胞，例如來(lái)源自胚胎干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞(例如尸胎細(xì)胞)或任何其他合適組織源。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以獲自或來(lái)源自胚胎干細(xì)胞系或胎兒細(xì)胞系。類(lèi)似地，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以從間充質(zhì)干細(xì)胞系建立。例如，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以從例如W02007/027157或W02007/027156中描述的胚胎干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞系建立。所述間充質(zhì)干細(xì)胞還可以從出生前細(xì)胞(例如妊娠頭三月或中三月的胎兒細(xì)胞)建立。所述胎兒細(xì)胞可以包括任何合適的年齡(例如最高至2、4、8、16或24周)的細(xì)胞。所述胎兒細(xì)胞可以包括來(lái)自任何組織的細(xì)胞，例如肢細(xì)胞、腎細(xì)胞或肝細(xì)胞。作為所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的所述出生前細(xì)胞可以包括在組織中。所述組織可以來(lái)自胎兒尸體。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以包括哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)或人間充質(zhì)干細(xì)胞。所述方法還可以包括在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。所述無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括諸如KnockoutDMEM培養(yǎng)基的無(wú)血清培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有10%血清替代培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有非必需氨基酸。該培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有10ng/mlFGF2。該培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有10ng/ml重組人EGF。該培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有55yM0-巰基こ醇。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以使得所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)一種或多種如下特征。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的一種或多種形態(tài)學(xué)特征。這類(lèi)特征可以包括匯合處的指紋螺環(huán)(fingerprintwhorl)。這類(lèi)特征可以包括形成具有成纖維細(xì)胞表型的附著單層。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可能能夠附著于塑料。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以顯示72至96小時(shí)的平均群體倍増時(shí)間。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以呈現(xiàn)包括如下ー個(gè)或多個(gè)(例如所有)物質(zhì)表達(dá)的表面抗原譜0)29、0)44、0)49&、0)496、0)105、CD166、MHCI。它可以呈現(xiàn)如下一個(gè)或多個(gè)物質(zhì)表達(dá)減少或無(wú)表達(dá)HLA-DR、⑶34和⑶45。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以是CD29+、CD44+、CD49a+、CD49e+、CD105+、CD166+、MHCI+、CD34-和CD45'所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以呈現(xiàn)HESX1、P0UFL5、S0X-2、UTF-I和ZFP42中ー個(gè)或多個(gè)(例如所有)的表達(dá)減少。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以呈現(xiàn)0CT4、NANOG和S0X2中ー個(gè)或多個(gè)(例如所有)的表達(dá)減少。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以呈現(xiàn)不可檢測(cè)的堿性磷酸酶活性。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)維持超過(guò)10、20,30,40或更多代。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)保持至少10代時(shí)，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以具有基本穩(wěn)定的核型或染色體數(shù)目。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以使得其當(dāng)移植至受體動(dòng)物中時(shí)基本不誘導(dǎo)畸胎瘤形成。所述受體動(dòng)物可以包括免疫妥協(xié)的受體動(dòng)物。所述時(shí)間期限可以是3周后，例如2-9月后。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以使得其當(dāng)移植至SCID小鼠中時(shí)基本不產(chǎn)生畸形的。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以使得其對(duì)小鼠特異性c-mos重復(fù)序列是陰性的，對(duì)人特異性alu重復(fù)序列是陽(yáng)性的。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可能能夠發(fā)生骨發(fā)生、脂肪發(fā)生或軟骨發(fā)生，例如能夠分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系從一代至另一代時(shí)可以具有基本穩(wěn)定的基因表達(dá)模式。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以使得通過(guò)所述方法獲得的任何兩種或多種(例如全部)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)基本相同的基因表達(dá)譜。其可以使得通過(guò)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化間充質(zhì)干細(xì)胞的任何兩種或多個(gè)分離物之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)大于0.9。其可以使得通過(guò)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化間充質(zhì)干細(xì)胞的任何兩個(gè)或多個(gè)(例如全部)分離物互相基本相似或相同(例如同源的)。其可以使得通過(guò)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化間充質(zhì)干細(xì)胞與親本培養(yǎng)物的細(xì)胞之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)大于0.8。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以包括哺乳動(dòng)物(例如小鼠或人)的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。本發(fā)明人還提供了這樣的條件培養(yǎng)基，其包含由如上文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系條件化的培養(yǎng)基。還提供了由上文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的顆粒，其包含轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的至少ー種生物學(xué)性質(zhì)(例如轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)的生物學(xué)活性，例如心臟保護(hù)作用)。這些在下文有進(jìn)ー步詳述。本發(fā)明人還提供了上文示出的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆粒用于治療疾病的方法中。所述疾病可以選自心臟衰竭、骨髓病、皮膚病、燒傷和退行性疾病例如糖尿病、阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、癌癥、與蛋白聚集或者細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外損害有關(guān)的疾??；亨丁頓舞蹈癥和酒精性肝病。所述疾病可以選自心肌梗塞、皮膚傷ロ、皮膚科疾病、皮膚科損害、皮炎、銀屑病、濕疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮膚癌、特應(yīng)性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、潰瘍、以誘導(dǎo)炎癥和免疫失調(diào)(其導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失)的初始損傷為特征的病理病癥、腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎或矯形疾病。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆?？梢杂糜趨f(xié)助傷ロ愈合、瘢痕減少、骨形成、骨移植或骨髄移植。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆粒可以用于調(diào)節(jié)或輔助選自如下的ー個(gè)或多個(gè)通路的通路=RhoGTP酶的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、整聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞通路、由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥、FGF信號(hào)傳導(dǎo)通路、EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、血管發(fā)生、血纖維蛋白溶酶原活化的級(jí)聯(lián)、凝血、糖酵解、泛素蛋白酶體通路、嘌呤的從頭生物合成、TCA循環(huán)、苯丙氨酸生物合成、血紅素生物合成。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆?？梢杂糜谡{(diào)節(jié)包括如下的任一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的過(guò)程細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞通信、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞粘著、胞吞作用、有絲分裂、胞吐作用、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞周期、免疫力和防御、細(xì)胞因子/趨化因子介導(dǎo)的免疫力、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)因子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞附著介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、JAK-STAT級(jí)聯(lián)、抗氧化作用和自由基除去、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、血液凝固、發(fā)育過(guò)程、中胚層發(fā)育、骨骼發(fā)育、血管發(fā)生、肌肉發(fā)育、肌收縮、蛋白質(zhì)代謝和修飾、蛋白質(zhì)酶解、蛋白質(zhì)折疊、蛋白復(fù)合體組裝、氨基酸活化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、其他蛋白的靶向和定位、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)ニ硫鍵異構(gòu)酶反應(yīng)、碳水化合物代謝、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代謝、嘌呤代謝、磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)、維生素代謝、氨基酸生物合成、前體mRNA加工、翻譯調(diào)控、mRNA剪接。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆粒可以用于提供包括如下一種或多種功能的功能信號(hào)傳導(dǎo)分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、其他細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白、其他細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白、蛋白酶、金屬蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、氧化還原酶、脫氫酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白、伴侶素、Hsp70家族伴侶蛋白、其他伴侶蛋白、合成酶、合酶和合成酶、選擇性鈣結(jié)合蛋白、氨酰-tRNA合成酶、裂解酶、異構(gòu)酶、其他異構(gòu)酶、ATP合酶、水合酶、轉(zhuǎn)氨酶、其他裂解酶、其他酶調(diào)節(jié)物、選擇性調(diào)節(jié)分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、非馬達(dá)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白、膜聯(lián)蛋白、微管蛋白、細(xì)胞粘著分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合馬達(dá)蛋白、中間絲、核糖核蛋白、核糖體蛋白質(zhì)、翻譯因子、其他RNA結(jié)合蛋白、組蛋白、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、囊泡外殼蛋白。還提供了用于遞送條件培養(yǎng)基或顆粒的遞送系統(tǒng)，包含上文描述的條件培養(yǎng)基或顆粒的源和能夠進(jìn)行將所述條件培養(yǎng)基或顆粒遞送至靶的操作的分配器。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)遞送系統(tǒng)在遞送條件培養(yǎng)基或顆粒至靶的方法中的用途。還提供了ー種獲得分化的間充質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括提供上文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系，并使所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。本發(fā)明人還提供了通過(guò)這類(lèi)方法獲得系分化的間充質(zhì)細(xì)胞。還提供了ー種藥物組合物，包含上文示出的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆?；蛘咚龅臈l件培養(yǎng)基和可藥用賦形劑或載體。本發(fā)明人還提供了ー種條件化細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系，并任選地分離所述細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明人還提供了一種治療疾病的方法，包括獲得上文示出的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆粒，并將所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、條件培養(yǎng)基或顆粒給予患者。所述疾病可以選自上文列出的疾病。獲得轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使用本文描述的方法和組合物從間充質(zhì)干細(xì)胞獲得或來(lái)源于其，例如通過(guò)基因工程。所述基因工程可以包括以合適的轉(zhuǎn)化劑(例如癌基因)轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明人描述了通過(guò)以包含至少ー種轉(zhuǎn)化基因的載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞而使這類(lèi)細(xì)胞系永生化或轉(zhuǎn)化這類(lèi)細(xì)胞系的方法。轉(zhuǎn)化基因的實(shí)例包括(I)核癌基因例如v-myc、N-myc、T抗原和尤因肉瘤癌基因(Fredericksenetal.(1988)Neuron1:439-448;Bartlett,P.etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3255-3259，和Snyder,E.Y.etal.(1992)Cell68:33-51)、(2)細(xì)胞質(zhì)癌基因例如bcr-abl和神經(jīng)纖維瘤蛋白(Solomon,E.etal.(1991)Science254:1153-1160)、(3)膜癌基因例如neu和ret(Aaronson,A.S.A.(1991)Science254:1153-1161)、(4)腫瘤抑制基因例如突變體p53和突變體Rb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)(Weinberg,R.A.(1991)Science254:1138-1146)和(5)其他轉(zhuǎn)化基因例如Notch顯性負(fù)相(Coffman,C.R.etal.(1993)Cell23:659-671)。癌基因的實(shí)例包括v_myc和所述SV40T抗原。轉(zhuǎn)化基因還可以包括端粒末端轉(zhuǎn)移酶基因(Tert)以及癌基因例如Akt、ras、EGF受體等。外源(異源)核酸(例如編碼轉(zhuǎn)化基因的核酸)可以被引入或轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞。攜帯外源DNA的間充質(zhì)干細(xì)胞稱(chēng)為基因工程細(xì)胞。所述外源DNA可以使用多種技術(shù)引入。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源DNA(包括編碼轉(zhuǎn)化基因的DNA)可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)引入間充質(zhì)干細(xì)胞。攜帯目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以用于引入標(biāo)記基因，例如大腸桿菌^-半乳糖苷酶(IacZ)基因或癌基因。所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在包裝細(xì)胞系中產(chǎn)生，以產(chǎn)生具有高病毒顆粒滴度(通常IO5至106pfu/ml)的培養(yǎng)物上清。通過(guò)將所述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物與包含病毒顆粒和g/ml聚凝胺(polybrene)的培養(yǎng)物孵育3小時(shí),所述重組病毒顆?？捎糜诟腥舅黾?xì)胞培養(yǎng)物。在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，將所述細(xì)胞沖洗并在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，分析所述感染的細(xì)胞對(duì)所述外源DNA的攝取和表達(dá)?？梢詫⑺黾?xì)胞用選擇性條件處理，所述條件可選擇已經(jīng)吸收和表達(dá)可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞。在另ー實(shí)施方案中，所述外源DNA可以使用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)引入。包含編碼目的基因(例如轉(zhuǎn)化基因)的DNA的磷酸鈣沉淀物可使用Wigleretal.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:1373-1376的技術(shù)制備。所述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物可在組織培養(yǎng)皿中建立。在鋪板所述細(xì)胞24小時(shí)后，加入包含大約20ug/ml所述外源DNA的磷酸鈣沉淀物。將所述細(xì)胞在室溫下孵育20分鐘。加入包含30iiM氯喹的組織培養(yǎng)基，并將所述細(xì)胞在37°C下孵育過(guò)夜。在轉(zhuǎn)染后，分析所述細(xì)胞對(duì)所述外源DNA的攝取和表達(dá)。可以將所述細(xì)胞用選擇性條件處理，所述條件可選擇已經(jīng)吸收和表達(dá)可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指這樣的細(xì)胞，即所述細(xì)胞能夠在體外生長(zhǎng)而無(wú)需通過(guò)以下方式使所述細(xì)胞永生化引入包含癌基因的病毒或病毒基因組的一部分，其能夠因?yàn)樵谒鲛D(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而病毒基因賦予所述細(xì)胞改變的生長(zhǎng)性質(zhì)。這些病毒基因一般已經(jīng)借助病毒感染或借助以包含分離的病毒基因的DNA載體轉(zhuǎn)染而被引入細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因工程細(xì)胞”是指已引入外源(S卩非天然出現(xiàn)的)核酸(例如DNA)的細(xì)胞。所述外源核酸可以通過(guò)多種技術(shù)引入，所述技術(shù)包括但不限于磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。所述基因エ程細(xì)胞可能以短暫或長(zhǎng)期的方式表達(dá)外源核酸。通常，短暫表達(dá)是在外源DNA未穩(wěn)定整合至所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體DNA中時(shí)發(fā)生。相反，外源DNA的長(zhǎng)期表達(dá)是在所述外源DNA已經(jīng)被穩(wěn)定地整合至所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的染色體DNA中時(shí)發(fā)生。本文使用的“永生化的細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指由于如下原因能夠在培養(yǎng)時(shí)無(wú)限生長(zhǎng)的細(xì)胞引入永生化基因”或“轉(zhuǎn)化基因”，所述基因能夠通過(guò)在所述基因工程細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述永生化基因或轉(zhuǎn)化基因而賦予所述細(xì)胞改變的生長(zhǎng)性質(zhì)。永生化基因和轉(zhuǎn)化基因可以借助病毒感染或者借助以包含編碼ー個(gè)或多個(gè)癌基因的分離病毒核酸的載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染而被引入細(xì)胞。選擇這樣的病毒或病毒癌基因，即其使得細(xì)胞永生化，但優(yōu)選不轉(zhuǎn)化細(xì)胞。永生化的細(xì)胞可以使得它們?cè)谂囵B(yǎng)時(shí)無(wú)限生長(zhǎng)，但當(dāng)被引入動(dòng)物中時(shí)不引起腫瘤。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指具有轉(zhuǎn)化基因引入其中并具有在培養(yǎng)時(shí)無(wú)限生長(zhǎng)的能力的細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化”是指產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞系明顯的是，通過(guò)本文描述的方法獲得的這類(lèi)轉(zhuǎn)化間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為細(xì)胞的形式得以維持或者發(fā)育成細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系。因此，在本文件中并且如果合適，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞”應(yīng)被認(rèn)為還包括提及相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，即轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物；或相應(yīng)的細(xì)胞系，即轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞系。通常，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系可以以相同或相似條件被保持培養(yǎng)和上文描述的培養(yǎng)基中用于衍生。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基本發(fā)明人還提供了被所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物條件化的培養(yǎng)基。這類(lèi)條件培養(yǎng)基在本文中被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基”，并且在下文進(jìn)ー步詳述。這類(lèi)條件培養(yǎng)基可以包括由所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌、排泄、釋放或產(chǎn)生的分子。所述條件培養(yǎng)基可以包括所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的ー種或多種分子，例如多肽、核酸、碳水化合物或者其他復(fù)雜或簡(jiǎn)單分子。所述條件培養(yǎng)基還可以包括所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的ー種或多種活性。所述條件培養(yǎng)基可以用于代替所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞本身，與所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞本身一起加入，或者補(bǔ)充所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞本身。因此，對(duì)于任何轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞適合用于其中的目的，條件化的培養(yǎng)基可以類(lèi)似地用于該目的。這類(lèi)條件培養(yǎng)基和其中包含的任何分子的組合(包括特別是蛋白或多肽)可以用于補(bǔ)充所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的活性或代替所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于例如治療或預(yù)防疾病的目的。因此，如果陳述了通過(guò)本文描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于具體目的，很明顯，這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的條件化的培養(yǎng)基可以同樣地用于該目的。條件培養(yǎng)基可以通過(guò)任何合適的方法制備。例如，它可以通過(guò)在培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞一段預(yù)定的時(shí)長(zhǎng)制備。可以使用任意數(shù)目的制備條件培養(yǎng)基的方法，包括下文列出的“條件培養(yǎng)基制備方案”。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以特別地包括由本文描述的任意方法產(chǎn)生的那些。所述條件培養(yǎng)基將包含由所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多肽，如實(shí)施例中所述。產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的方案的一個(gè)非限制性的具體實(shí)例如下。用于從轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基的示例性方案可以包括“條件培養(yǎng)基制備方案”，其如下所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基制備方案如上文和實(shí)施例以及參考文獻(xiàn)25中所述，所述分泌可以通過(guò)在化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的MSC三天而制備?？梢詫?0%匯合的培養(yǎng)物以PBS洗漆三次，然后在由添加IX胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-含硒蛋白(Insulin-Transferrin-Selenoprotein),10ng/ml重組人FGF2、10ng/ml重組人EGF、Ix谷氨酰胺-青霉素_鏈霉素和55uM^-巰基こ醇的無(wú)酚磺酞的DMEM培養(yǎng)基組成的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。然后可以將所述培養(yǎng)物以PBS洗滌三次，之后可以加入新鮮的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基組分可以獲自Invitrogen?？梢詫⑺雠囵B(yǎng)物在該培養(yǎng)基中維持三天。然后，可以將該條件培養(yǎng)基(CM)收集，通過(guò)離心使之澄清，使用截留分子量IOOkDa的正切流動(dòng)過(guò)濾(Satorius,Goettingen,Germany)濃縮50倍，并且通過(guò)過(guò)濾通過(guò)220nm濾器滅菌。所述條件培養(yǎng)基可以直接或者在一個(gè)或多個(gè)處理步驟后用于治療。例如，可以將所述條件培養(yǎng)基進(jìn)行UV處理、濾器滅菌等?？梢允褂靡粋€(gè)或多個(gè)純化步驟。具體而言，可以將所述條件培養(yǎng)基濃縮，例如通過(guò)透析或超濾。例如，可以將所述培養(yǎng)基使用具有例如3K的標(biāo)稱(chēng)分子量限值(NMWL)的膜超濾濃縮。對(duì)于本文描述的目的，例如治療或預(yù)防疾病，可以將包含15_750mg蛋白質(zhì)/IOOkg體重的條件培養(yǎng)基劑量給予需要這類(lèi)治療的患者。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒本發(fā)明人描述了可來(lái)源自轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的顆粒。這類(lèi)顆粒在本文中稱(chēng)為“轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?！?。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以通過(guò)數(shù)種方式中的任一種獲自所述轉(zhuǎn)化的MSC,例如通過(guò)從所述轉(zhuǎn)化的MSC分泌、出芽或擴(kuò)散。例如，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以從所述轉(zhuǎn)化的MSC產(chǎn)生、滲出、發(fā)出或脫落。如果所述轉(zhuǎn)化的MSC在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，那么所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢苑置谥了黾?xì)胞培養(yǎng)基中。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢蕴貏e包含囊泡。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄍ夂梭w。本文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园疚拿枋龅耐夂梭w的任一種或多種性質(zhì)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄖp層圍成的囊泡或扁平球。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以包括40-100nm的直徑。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢酝ㄟ^(guò)內(nèi)體膜向內(nèi)出芽而形成。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢跃哂屑sI.13-1.19g/ml的密度，可以懸浮于蔗糖梯度上。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以富含膽固醇和鞘磷脂以及脂質(zhì)後標(biāo)記物，例如GMl、GM3、flotillin和所述src蛋白激酶Lyn。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄔ谵D(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)中存在的ー種或多種蛋白，例如所述轉(zhuǎn)化的MSC或轉(zhuǎn)化的MSC-CM的特征性或特異性的蛋白。它們可以包含RNA，例如miRNA。本發(fā)明人提供了轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒，其包含在轉(zhuǎn)化的MSC或由轉(zhuǎn)化的MSC培養(yǎng)物條件化的培養(yǎng)基中存在的ー個(gè)或多個(gè)基因或基因產(chǎn)物。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄓ伤鲛D(zhuǎn)化的MSC分泌的分子。這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒和其中包含的任何分子的組合(包括特別是蛋白或多肽)可以用于補(bǔ)充所述轉(zhuǎn)化的MSC或由所述轉(zhuǎn)化的MSC的培養(yǎng)物條件化的培養(yǎng)基的活性，或者代替所述轉(zhuǎn)化的MSC或由所述轉(zhuǎn)化的MSC的培養(yǎng)物條件化的培養(yǎng)基，目的是例如治療或預(yù)防疾病。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园?xì)胞骨架中存在的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，例如微管蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白；細(xì)胞內(nèi)膜融合物和轉(zhuǎn)運(yùn)物，例如整聯(lián)蛋白和rab蛋白；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，例如蛋白激酶、14-3-3和異源三聚體G蛋白；代謝酶，例如過(guò)氧化物酶、丙酮酸鹽和脂質(zhì)激酶；以及烯醇酶-I和四次跨膜蛋白家族，例如⑶9、⑶63、⑶81和⑶82。特別地，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄒ环N或多種四次跨膜蛋白。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园╩RNA和/或microRNA。本文使用的術(shù)語(yǔ)“顆?！笨梢员徽J(rèn)為是指獨(dú)立的實(shí)體。所述顆?？梢允悄軓霓D(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的MSC)或轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)分離的物質(zhì)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以負(fù)責(zé)所述轉(zhuǎn)化的MSC或轉(zhuǎn)化的MSC-CM的至少ー種活性。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢载?fù)責(zé)并實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化的MSC或轉(zhuǎn)化的MSC-CM的基本大部分或全部功能。例如，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢允撬鲛D(zhuǎn)化的MSC或轉(zhuǎn)化的MSC-CM的替代物(或生物替代物)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢杂糜谒鲛D(zhuǎn)化的MSC或轉(zhuǎn)化的MSC-CM可以投入使用的任意治療目的。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄞD(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的至少ー種性質(zhì)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢跃哂猩飳W(xué)性質(zhì)，例如生物學(xué)活性。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢跃哂修D(zhuǎn)化的MSC的任何生物學(xué)活性。例如，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以具有轉(zhuǎn)化的MSC的治療或滋補(bǔ)活性。所述生物學(xué)活性可以包括心臟保護(hù)作用。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？赡苣軌驕p少梗塞面積。梗塞減少可以在小鼠或豬的心肌缺血和再灌注損傷模型中測(cè)定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢阅軌驕p少氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的減少可以在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定法中測(cè)定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？砂遗?。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄍ夂梭w。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢栽陂g充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)或轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)中包含至少70%的蛋白。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ǚ肿恿?gt;100kDa的復(fù)合體。所述分子量>100kDa的復(fù)合體可以包括〈lOOkDa的蛋白。所述顆?？梢园ǚ肿恿?gt;300kDa的復(fù)合體。所述分子量>300kDa的復(fù)合體可以包括<300kDa的蛋白。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ǚ肿恿?gt;1000kDa的復(fù)合體。所述顆?？梢跃哂?nm至200nm的大小。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢跃哂?0nm至150nm的大小。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢跃哂?0nm至IOOnm的大小。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的大小可以通過(guò)以0.2yM濾器過(guò)濾并以IOkDa的截留分子量的膜濃縮而確定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的大小可以通過(guò)電子顯微鏡確定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄐ∮贗OOnm的流體力學(xué)半徑。它可以包括約30nm至約70nm的流體力學(xué)半徑。其可以是約40nm至約60nm,例如約45nm至約55nm。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以包括約50nm的流體力學(xué)半徑。所述流體力學(xué)半徑可以通過(guò)激光衍射或動(dòng)態(tài)光散射確定。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄟx自如下的脂質(zhì)磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿、鞘磷脂(shingomyelin)、神經(jīng)酰胺、糖脂、腦苷脂、類(lèi)固醇、膽固醇。所述膽固醇磷脂比率可以大于0.3-0.4(mol/mol)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄖ|(zhì)筏。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒在非離子型去污劑(例如Triton-XlOO)中可以是不溶的。當(dāng)將所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒以非離子型去污劑處理時(shí)，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢允沟镁哂兄付ǚ肿恿康牡鞍踪|(zhì)基本保留在具有指定分子量的復(fù)合體中。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以對(duì)環(huán)糊精(例如20mM環(huán)糊精)敏感。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢允沟靡原h(huán)糊精進(jìn)行的處理導(dǎo)致所指定的復(fù)合物大量溶解。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ê颂呛怂?RNA)。所述顆?？梢跃哂蠭.9的吸光度比值(260:280nm)。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢园ㄟx自如下的表面抗原CD9、CD109和thy-I。本發(fā)明人還描述了一種產(chǎn)生如上所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的方法，所述方法包括從轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)分離所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒。所述方法可以包括基于分子量、大小、形狀、組成或生物學(xué)活性從其他組分分離所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒。所述重量可以選自上文示出的重量。所述大小可以選自上文示出的大小。所述組成可以選自上文示出的組成。所述生物學(xué)活性可以選自上文示出的生物活性。本發(fā)明人還描述了一種產(chǎn)生上文所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的方法。所述方法可以包括獲得轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)。它可以包括濃縮所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基還可以通過(guò)在>1000kDa膜上超濾而濃縮。所述方法可以包括對(duì)所濃縮的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行分子排阻色譜?？梢允褂肨SKGuard柱SWXL、6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL、7.8x300mm柱。所述方法可以包括選擇呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射的UV吸收級(jí)分，例如在220nm下。所述動(dòng)態(tài)光散射可以通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)檢測(cè)器檢測(cè)。所述方法可以包括收集以11-13分鐘(例如12分鐘)的保留時(shí)間洗脫的級(jí)分。本發(fā)明人還提供了ー種藥物組合物，包含所述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒和可藥用賦形劑、稀釋劑或載體。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒或這類(lèi)藥物組合物，用于治療疾病的方法中。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒用于制備治療疾病的藥物組合物的用途。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒用于治療個(gè)體中疾病的方法中的用途。所述疾病可以選自心臟衰竭、骨髓病、皮膚病、燒傷和退化性疾病例如糖尿病、阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥和癌癥。所述疾病可以選自心肌梗塞、皮膚傷ロ、皮膚科疾病、皮膚科損害、皮炎、銀屑病、濕疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮膚癌、特應(yīng)性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、潰瘍、以誘導(dǎo)炎癥和免疫功能失調(diào)(其導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失)的初始損傷為特征的病理病癥、腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎或矯形疾病。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以用于在個(gè)體中協(xié)助傷ロ愈合、瘢痕減少、骨形成、骨移植或骨髄移植。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以用于(i)調(diào)節(jié)選自如下的任何ー個(gè)或多個(gè)通路的通路RhoGTP酶的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、整聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞通路、由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥、FGF信號(hào)傳導(dǎo)通路、EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、血管發(fā)生、血纖維蛋白溶酶原活化的級(jí)聯(lián)、凝血、醣酵解、泛素蛋白酶體通路、嘌呤的從頭生物合成、TCA循環(huán)、苯丙氨酸生物合成、血紅素生物合成；(ii)調(diào)節(jié)包括如下的任一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的過(guò)程細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞通信、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞粘著、胞吞作用、有絲分裂、胞吐作用、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞周期、免疫力和防御、細(xì)胞因子/趨化因子介導(dǎo)的免疫力、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)因子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞附著介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、JAK-STAT級(jí)聯(lián)、抗氧化作用和自由基除去、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、血液凝固、發(fā)育過(guò)程、中胚層發(fā)育、骨骼發(fā)育、血管發(fā)生、肌肉發(fā)育、肌收縮、蛋白質(zhì)代謝和修飾、蛋白質(zhì)酶解、蛋白質(zhì)折疊、蛋白復(fù)合體組裝、氨基酸活化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、其他蛋白的靶向和定位、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)ニ硫鍵異構(gòu)酶反應(yīng)、碳水化合物代謝、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代謝、嘌呤代謝、磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)、維生素代謝、氨基酸生物合成、前體mRNA加工、翻譯調(diào)控、mRNA剪接；或者(iii)提供包括如下任何一種或多種功能的功能信號(hào)傳導(dǎo)分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、其他細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白、其他細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白、蛋白酶、金屬蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、氧化還原酶、脫氫酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白、伴侶素、Hsp70家族伴侶蛋白、其他伴侶蛋白、合成酶、合酶和合成酶、選擇性鈣結(jié)合蛋白、氨酰tRNA合成酶、裂解酶、異構(gòu)酶、其他異構(gòu)酶、ATP合酶、水合酶、轉(zhuǎn)氨酶、其他裂解酶、其他酶調(diào)節(jié)物、選擇性調(diào)節(jié)分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、非馬達(dá)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白、膜聯(lián)蛋白、微管蛋白、細(xì)胞粘著分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合馬達(dá)蛋白、中間絲、核糖核蛋白、核糖體蛋白質(zhì)、翻譯因子、其他RNA結(jié)合蛋白、組蛋白、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、囊泡外殼蛋白。本發(fā)明人還提供了用于遞送轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的遞送系統(tǒng)，包括轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒的源和能夠進(jìn)行將所述顆粒送遞至靶的操作的分配器。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)遞送系統(tǒng)在遞送顆粒至靶的方法中的用途。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)直徑約50_100nm的所分泌的大復(fù)合體介導(dǎo)心臟保護(hù)作用。這類(lèi)復(fù)合體或顆粒因此還可以代替所述細(xì)胞本身用于治療方法，包括用于心臟保護(hù)作用。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒、復(fù)合體或外核體可以用于多種目的，例如治療或預(yù)防心臟疾病或心臟病，例如缺血、心臟炎癥或心力衰竭。它們還可以用于修復(fù)如下灌注損傷。被轉(zhuǎn)化的MSC條件化的培養(yǎng)基(例如轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化的MSC-CM，如下文所述)可以包括轉(zhuǎn)化的MSC的生物學(xué)活性，能夠替代所述轉(zhuǎn)化的MSC本身。轉(zhuǎn)化的MSC的生物學(xué)性質(zhì)或生物學(xué)活性因此可以對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的生物學(xué)性質(zhì)或活性。因此，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒可以包括轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)的ー種或多種生物學(xué)性質(zhì)或活性。所述條件細(xì)胞培養(yǎng)基(例如轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM))可以通過(guò)以下方式得到在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的MSC)、其后代或源自其的細(xì)胞系；分離所述細(xì)胞培養(yǎng)基。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)以下方法產(chǎn)生所述方法包括通過(guò)分散胚胎干(ES)細(xì)胞集落獲得細(xì)胞。所述細(xì)胞或其后代在包含F(xiàn)GF2的無(wú)血清培養(yǎng)基中在無(wú)共培養(yǎng)物的情況下繁殖。其他詳情在本文他處提供。分離轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒所述轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢砸远喾N方式產(chǎn)生或分離。這類(lèi)方法可以包括將所述顆粒從轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的MSG)中分離。這類(lèi)方法可以包括將所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒從轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)分離。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢岳缤ㄟ^(guò)以下方式分離基于所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的任何性質(zhì)與無(wú)關(guān)組分分開(kāi)。例如，所述轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢曰诜肿恿?、大小、形狀、組成或生物學(xué)活性分離。所述條件培養(yǎng)基可以在分離過(guò)程之中、之前或之后過(guò)濾和/或濃縮。例如，它可以被過(guò)濾通過(guò)膜，例如具有ー個(gè)大小或分子量截留的膜。還可以對(duì)其進(jìn)行正切力過(guò)濾或超濾。例如，可以使用以具有合適分子量或大小截留的膜進(jìn)行的過(guò)濾，如本文他處的分子量測(cè)定法中所述?？梢詫?duì)所述條件培養(yǎng)基(任選地經(jīng)過(guò)濾和/或濃縮)進(jìn)行進(jìn)一步分離方法，例如柱色譜法。例如，可以使用具有不同柱的高效液相色譜(HPLC)。所述柱可以是尺寸排阻柱或結(jié)合柱。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的一種或多種性質(zhì)或生物學(xué)活性可以用于在對(duì)所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)化的MSC-CM)的分級(jí)分離過(guò)程中示蹤其活性。例如，光散射、折射率、動(dòng)態(tài)光散射或UV可見(jiàn)檢測(cè)器可用于跟蹤所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒。例如，治療活性(例如心臟保護(hù)活性)可以用于在分級(jí)分離過(guò)程中示蹤所述活性。下一段將提供可以如何獲得轉(zhuǎn)化的MSC間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒(例如外核體)的具體實(shí)例。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顆?？梢酝ㄟ^(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞以條件化它而產(chǎn)生；所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以包括轉(zhuǎn)化的HuES9.El細(xì)胞。所述培養(yǎng)基可以包含DMEM。所述DMEM可以使得其不包含酚磺酞。所述培養(yǎng)基可以補(bǔ)加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或含硒蛋白質(zhì)(ITS)或它們的任意組合。它可以包括FGF2。它可以包括TOGFAB。FGF2的濃度可以是約5ng/mlFGF2。PDGFAB的濃度可以是約5ng/ml。所述培養(yǎng)基可以包括谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素或P-巰基こ醇或它們的任意組合。所述細(xì)胞可以培養(yǎng)約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天，例如3天。所述條件培養(yǎng)基可以通過(guò)將所述細(xì)胞從所述培養(yǎng)基分離中而得到?？梢詫⑺鰲l件培養(yǎng)基離心，例如在500g下?？梢酝ㄟ^(guò)過(guò)濾通過(guò)膜將它濃縮。所述膜可以包括>1000kDa膜。所述條件培養(yǎng)基可以濃縮約50倍或更多。可以對(duì)所述條件培養(yǎng)基進(jìn)行液相色譜，例如HPLC。所述條件培養(yǎng)基可以通過(guò)尺寸排阻分離?？梢允褂萌魏纬叽缗抛杌|(zhì)例如Sapharose。例如，可以使用TSKGuard柱SffXL,6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL，7.8x300mm。所述洗脫緩沖液可以包括任何生理培養(yǎng)基例如鹽水。它可以包括20mM磷酸鹽緩沖液，其含150mM的NaCl，pH7.2?？梢詫⑺錾V系統(tǒng)以0.5ml/分鐘的流速平衡。洗脫模式可以是等強(qiáng)度。220nm下的UV吸光度可以用于示蹤所述洗脫過(guò)程?？梢允褂脺?zhǔn)弾性光散射(QELS)檢測(cè)器對(duì)檢查級(jí)分的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)0可以將被觀察到呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射的級(jí)分留下。例如，通過(guò)如上述的一般方法產(chǎn)生且以保留時(shí)間11-13分鐘(例如12分鐘)洗脫的級(jí)分被觀察到呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射。該峰值中所述顆粒的rh為約55-65nm。這類(lèi)級(jí)分包含轉(zhuǎn)化的MSC間充質(zhì)干細(xì)胞顆粒，例如外核體。遞送轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的途徑將本文所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒送遞至人或動(dòng)物體內(nèi)。因此，本發(fā)明人描述了用于遞送本文所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒至靶細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物體或人體的遞送系統(tǒng)，和用于使用所述遞送系統(tǒng)來(lái)遞送轉(zhuǎn)化的MSC顆粒至靶的方法。所述遞送系統(tǒng)可以包括轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的源，例如包含所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的容器。所述遞送系統(tǒng)可以包括用于分配所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒至靶的分配器。因此，本發(fā)明人提供了用于遞送轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的遞送系統(tǒng)，包含本文所述的轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的源和能進(jìn)行將所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒送遞至靶的操作的分配器。本發(fā)明人還提供了這類(lèi)遞送系統(tǒng)在遞送轉(zhuǎn)化的MSC顆粒至靶的方法中的用途。用于遞送流體至身體的遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的，包括注射、外科滴注、導(dǎo)管(包括灌注導(dǎo)管)，例如美國(guó)專(zhuān)利6，139，524中描述的導(dǎo)管，例如藥物送遞導(dǎo)管(例如美國(guó)專(zhuān)利7，122，019中所述的藥物送遞導(dǎo)管。向肺或鼻道中的遞送(包括鼻內(nèi)遞送)可以使用例如本領(lǐng)域中已知的鼻腔噴霧、吹入器、吸入器等實(shí)現(xiàn)(例如美國(guó)設(shè)計(jì)專(zhuān)利D544，957中所示)。向腎中的遞送可以使用主動(dòng)脈內(nèi)腎遞送導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利7，241，273中描述的那些。明顯的是，具體的遞送應(yīng)可構(gòu)造成以合適的間隔遞送所需量的轉(zhuǎn)化的MSC顆粒，目的是實(shí)現(xiàn)最佳治療。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢杂糜诶缰委熁蝾A(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。在本文中，轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的灌注可以在靜脈內(nèi)進(jìn)行，以穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊或減少斑塊中的炎癥。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒可以用于通過(guò)靜脈灌注治療或預(yù)防感染性休克。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒可用于治療或預(yù)防心力衰竭。這可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的慢性冠狀動(dòng)脈內(nèi)或心肌內(nèi)灌注以延緩重塑或延緩心カ衰竭。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆?？梢杂糜谕ㄟ^(guò)鼻內(nèi)遞送治療或預(yù)防肺部炎癥。所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒可以用于治療或預(yù)防皮膚科疾病例如銀屑病。轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的長(zhǎng)期遞送可以使用經(jīng)皮微注射針施用，直至所述病癥消退。明顯的是，所述遞送方法將依賴(lài)于待被給予所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒的具體器官，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定因此采用何種方式。例如，在心臟炎癥的治療中，所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒可以例如被通過(guò)以下方式遞送至心臟組織(即心肌膜、心包膜或心內(nèi)膜)通過(guò)透過(guò)胸壁的直接冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，或者使用基于標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)皮導(dǎo)管的方法在透視導(dǎo)向下用于直接注射至組織(例如心肌膜)內(nèi)或從植入體腔內(nèi)的支架或?qū)Ч芙鲆种苿?。任何的多種冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管或灌流導(dǎo)管可用于給予所述轉(zhuǎn)化的MSC顆粒?；蛘撸鲛D(zhuǎn)化的MSC顆?？梢员煌糠蠡蚪⒃谥糜诠跔钛苤械闹Ъ苌稀＋@得間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)本文所述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以從間充質(zhì)干細(xì)胞分離或制備。適合在產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞中使用的間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法制備。具體而言，MSC可以通過(guò)在包含F(xiàn)GF2的無(wú)血清培養(yǎng)基在不存在共培養(yǎng)物的情況下増殖細(xì)胞而制備，所述細(xì)胞是通過(guò)分散胚胎干(ES)細(xì)胞集落或其后代獲得的。還例如，間充質(zhì)干細(xì)胞可以來(lái)自于出生前組織。所述出生前組織(例如胎兒組織)可以經(jīng)過(guò)處理，例如通過(guò)剝離、切碎或清洗或者它們的任意組合處理。它們中的每ー種在下文段中有更詳細(xì)的描述。來(lái)自胚胎干細(xì)胞源的間充質(zhì)干細(xì)胞從hESC獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或MSC樣細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)方法涉及將人端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因轉(zhuǎn)染至分化的hESC(Xuetal.，2004)或與小鼠0P9細(xì)胞系共培養(yǎng)(Barberietal.，2005)。在這些衍生方案中使用外源遺傳物質(zhì)和小鼠細(xì)胞可引入致腫瘤性或異生物質(zhì)(xenozootic)傳染劑傳染的不可接受風(fēng)險(xiǎn)。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)使用臨床相關(guān)且可重復(fù)方案從分化的hESC中分離相似或相同(例如同源)MSC群來(lái)獲得。通常，所述方法包括將胚胎干(ES)細(xì)胞集落分散為細(xì)胞。然后，將所述細(xì)胞鋪板并繁殖。將所述細(xì)胞在含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)的無(wú)血清培養(yǎng)基中在不存在共培養(yǎng)物的情況下繁殖，目的是獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。因此，所述方案不需要血清、使用小鼠細(xì)胞或基因操作，并且需要較少操作和時(shí)間，因此是可高度擴(kuò)大的。所述方案可以用于從兩個(gè)不同的hESC系HuES9和H-I以及第3個(gè)Hes-3中分離MSC。通過(guò)本文所述方法和組合物獲得的來(lái)源自人ES的MSC(hESC-MSC)與來(lái)源自骨髓的MSC(BM-MSC)非常相似。所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物可以包括人胚胎干細(xì)胞(hESC)培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，生成間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法包括在補(bǔ)加FGF2和任選的TOGFAB的培養(yǎng)基中在無(wú)飼養(yǎng)層支持的情況下用胰蛋白酶消化并增殖hESC，然后分選CD105+CD24-細(xì)胞。所述方法可以包括在補(bǔ)加FGF2和任選的I3DGFAB的培養(yǎng)基中無(wú)飼養(yǎng)層繁殖后一周從胰蛋白酶消化的hESC中分選⑶105+、⑶24-細(xì)胞，以生成這樣的hESC-MSC細(xì)胞培養(yǎng)物，即其中至少一部分(例如基本全部或全部)細(xì)胞彼此相似或相同(例如同源)。以該方法產(chǎn)生的MSC可用于產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)，從中可分離。解聚胚胎干細(xì)胞集落一種產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可以包括將胚胎干細(xì)胞集落分散或解聚成細(xì)胞。所述胚胎干細(xì)胞集落可以包括huES9集落(CowanCA,KlimanskayaI,McMahonJ,AtienzaJ,WitmyerJ,etal.(2004)Deri-vationofembryonicstem-cel丄linesfromhumanblastocysts.NEnglJMed350:1353-1356)或HIESC集落(ThomsonJA,Itskovitz-EldorJ,ShapiroSS,WaknitzMA,SwiergielJJ,etal.(1998)EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocysts.Science282:1145-1147)。集落中的細(xì)胞可以解聚或分散至相當(dāng)大的程度，即至少成團(tuán)。集落可以解聚或分散至集落中所有細(xì)胞為單個(gè)的形式，即集落完全解聚。解聚可以以分散劑實(shí)現(xiàn)。分散劑可以為能夠使集落中至少ー些胚胎干細(xì)胞彼此分開(kāi)的任何物質(zhì)。分散劑可以包括可破壞集落中細(xì)胞之間或細(xì)胞并且/或者底物之間之間粘著的試劑。分散劑可以包括蛋白酶。分散劑可以包括胰蛋白酶。以胰蛋白酶進(jìn)行的處理可以在攝氏37度下持續(xù)例如約3分鐘。然后，可以將所述細(xì)胞中和、離心并再懸浮于培養(yǎng)基中，然后鋪板。所述方法可以包括以胰蛋白酶分散人胚胎干細(xì)胞的匯合平板，然后將所述細(xì)胞鋪板。解聚可以包括如下步驟順序中的至少ー些抽吸、沖洗、胰蛋白酶消化、孵育、取出、粹滅、再接種和取等分試樣。如下的方案可以改編自HedrickLab,UCSanDiego(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。在抽吸步驟中，將所述培養(yǎng)基吸出或輕輕從容器(例如燒瓶)中除去。在沖洗步驟中，將所述細(xì)胞以一個(gè)體積(例如5-10ml)的經(jīng)緩沖的培養(yǎng)基沖洗，所述經(jīng)緩沖的培養(yǎng)基可以不含Ca2+和Mg2+。例如，可以將所述細(xì)胞以無(wú)鈣和鎂的PBS沖洗。在胰蛋白酶消化步驟中，將ー個(gè)量的溶于緩沖劑中的分散劑加入容器中，并將所述容器翻滾以用所述分散劑溶液包被所述生長(zhǎng)表面。例如，可以將Iml溶解于Hank'sBSS中的胰蛋白酶加入燒瓶中。在孵育步驟中，將所述細(xì)胞在維持溫度下放置一段時(shí)間。例如，可以將所述細(xì)胞在37°C下放置數(shù)分鐘(例如2至5分鐘)。在取出步驟中，可用將所述細(xì)胞通過(guò)機(jī)械作用取出，例如通過(guò)刮除或通過(guò)以手敲打所述容器的ー側(cè)。所述細(xì)胞應(yīng)以片狀物形式脫離并從所述表面滑落。在猝滅步驟中，將ー個(gè)體積的培養(yǎng)基加入燒瓶中。所述培養(yǎng)基可以包含中和劑以終止所述分散劑的作用。例如，如果所述分散劑是蛋白酶例如胰蛋白酶，所述培養(yǎng)基可以包含蛋白例如血清蛋白，其將清除所述蛋白酶的活性。在ー個(gè)具體實(shí)例中，將3ml含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入燒瓶中以補(bǔ)足至共4ml。可以以吸量管吸所述細(xì)胞以取出或分散所述細(xì)胞。在再接種步驟中，將所述細(xì)胞再接種至新鮮培養(yǎng)容器且加入新鮮培養(yǎng)基。許多再接種可以以不同的平分比(splitratio)進(jìn)行。例如，所述細(xì)胞可以以1/15稀釋度和1/5稀釋度接種。在ー個(gè)具體實(shí)例中，可以通過(guò)以下方式再接種所述細(xì)胞將I滴細(xì)胞加入25cm2燒瓶并將3滴加入另ー燒瓶以再接種所述培養(yǎng)物，然后將7-8ml培養(yǎng)基加入每個(gè)燒瓶以從例如75cm2燒瓶中得到1/15稀釋度和1/5稀釋度。在取等分試樣的步驟中，可以將所述細(xì)胞取等分試樣至新皿中，或者至所需平分比，并加入培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟首先以非粘著的方式將人ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，以形成胚狀體(EB)。然后對(duì)5-10日齡EB進(jìn)行胰蛋白酶消化，之后作為粘著細(xì)胞鋪板于明膠涂敷的組織培養(yǎng)板上。維持為細(xì)胞培養(yǎng)物所述細(xì)胞(例如所述解聚的細(xì)胞或所述間充質(zhì)干細(xì)胞)可以鋪板并保持為細(xì)胞培養(yǎng)物。所述細(xì)胞可以鋪板至培養(yǎng)瓶或底物例如涂膠的板上。十分重要地，所述細(xì)胞在不存在共培養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)和繁殖，例如不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下?？梢詫⑺黾?xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基可以補(bǔ)充一種或多種生長(zhǎng)因子例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)和任選的血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(PDGFAB),例如以5ng/ml、IOng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml或30ng/ml。所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在匯合時(shí)可用分開(kāi)或繼代培養(yǎng)。可以將它們以任何合適的方式分開(kāi)，例如以胰蛋白酶處理、洗滌和再鋪板。平分比可以包括例如1:4。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以保持為細(xì)胞系。無(wú)共培養(yǎng)物在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明人的方法涉及在不存在共培養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“共培養(yǎng)物”是指在一塊培養(yǎng)的兩種或多種不同類(lèi)型的細(xì)胞的混合物，例如間質(zhì)飼養(yǎng)細(xì)胞。因此，在典型的ES細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述培養(yǎng)皿的內(nèi)表面通常涂敷有已經(jīng)被處理使得它們不分裂的小鼠胚胎皮膚細(xì)胞的飼養(yǎng)層。所述飼養(yǎng)層提供了ー個(gè)粘著表面，以使所述ES細(xì)胞能夠粘著和生長(zhǎng)。另外，所述飼養(yǎng)細(xì)胞可以將ES細(xì)胞生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)物釋放至所述培養(yǎng)基中。在本文描述的方法和組合物中，可以將ES和MSC細(xì)胞在不存在共培養(yǎng)物的情況下培養(yǎng)。所述細(xì)胞可以培養(yǎng)為單層或者在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)?？梢詫⑺雠咛ジ杉?xì)胞在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞下培養(yǎng)以建立間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)?？梢詫⑺鯩SC本身在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)?？梢詫⒎蛛x的或解聚的胚胎干細(xì)胞直接置于培養(yǎng)底物上?？梢詫⑺鲩g充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)底物上培養(yǎng)。所述培養(yǎng)底物可以包括組織培養(yǎng)容器，例如培養(yǎng)皿。所述容器可以是經(jīng)預(yù)處理的?？梢詫⑺黾?xì)胞置于膠化的組織培養(yǎng)皿上并在其上培養(yǎng)。以下是對(duì)皿進(jìn)行明膠涂敷的示例性方案。制備溶于蒸餾水中的0.1%明膠溶液并高壓滅菌?？梢詫⑵湓谑覝叵卤４?。將組織培養(yǎng)皿的底部以所述明膠溶液覆蓋并孵育5-15分鐘。除去明膠，將所述皿備用。應(yīng)在加入細(xì)胞之前加入培養(yǎng)基以防止低張溶胞。無(wú)血清培養(yǎng)某可以將分離的或解聚的胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基可以包括無(wú)血清培養(yǎng)基。可以將所述間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基可以包括無(wú)血清培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)“無(wú)血清培養(yǎng)基”可以包括不含血清蛋白(例如胎牛血清)的細(xì)胞培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中公知的，例如描述于美國(guó)專(zhuān)利5，631，159和5，661，034中。無(wú)血清培養(yǎng)基可從例如Gibco-BRL(Invitrogen)市購(gòu)。無(wú)血清培養(yǎng)基可以不含蛋白，因?yàn)樗梢匀狈Φ鞍?、水解產(chǎn)物和未知組合物的組分。無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括其中所有組分具有已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基是優(yōu)選的，因?yàn)樗商峁┩耆_定的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可消除變異性，允許改良的可重現(xiàn)性和更一致的性能并且可降低偶然物質(zhì)污染的可能性。無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括敲除DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen-Gibco,GrandIsland,NewYork)。無(wú)血清培養(yǎng)基可以補(bǔ)加ー種或多種組分，例如，具有例如5%、10%、15%等的濃度的血清替代培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括或補(bǔ)加有來(lái)自Invitrogen-Gibco(GrandIsland,NewYork)的10%血清替代培養(yǎng)基。牛長(zhǎng)因子分離的或解聚的胚胎干細(xì)胞可在其中培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括ー種或多種生長(zhǎng)因子。間充質(zhì)干細(xì)胞在其中培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基可以包括一種或多種生長(zhǎng)因子?，F(xiàn)有技術(shù)中已知許多生長(zhǎng)因子，包括H)GF、EGF、TGF-a、FGF、NGF、紅細(xì)胞生成素、TGF-b、IGF-I和IGF-II。所述生長(zhǎng)因子可以包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)。所述培養(yǎng)基還可以包含其他生長(zhǎng)因子，例如血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(H)GFAB)。這兩種生長(zhǎng)因子都是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。所述方法可以包括在包含F(xiàn)GF2和TOGFAB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。替代地或者另外地，所述培養(yǎng)基可以包含或還包含表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。使用EGF可以增強(qiáng)MSC的生長(zhǎng)。EGF可以以任何合適的濃度使用，例如5-10ng/mlEGF。EGF可以用于代替H)GF。EGF是本領(lǐng)域中公知的蛋白，被表示為符號(hào)EGF，別名符號(hào)URG、Entrez1950、HUGO3229、OM頂131530、RefSeqNM_001963、UniProtP01133。因此，本發(fā)明人公開(kāi)了包含(i)FGF2、(ii)FGF2和PDGF以及(iii)FGF2和EGF以及其他組合的培養(yǎng)基的用途。FGF2是ー種廣譜的促有絲分裂的、血管原性的和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的因子，在許多組織和細(xì)胞類(lèi)型中以低水平表達(dá)，并在腦和腦下垂體中達(dá)到高濃度。FGF2已經(jīng)涉及許多生理和病理過(guò)程，包括肢發(fā)育、血管發(fā)生、傷ロ愈合和腫瘤生長(zhǎng)。FGF2可以市購(gòu)獲得，例如從invitrogen-Gibco(GrandIsland,NewYoriO0血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)是ー種用于較寬范圍細(xì)胞類(lèi)型(包括成纖維細(xì)胞、平滑肌和結(jié)締組織)的強(qiáng)絲裂原。TOGF由被稱(chēng)為A鏈和B鏈的兩條鏈的ニ聚體組成，其可以作為AA或BB同型ニ聚體存在，或者作為AB異型ニ聚體存在。人I3DGF-AB是由13.3kDaA鏈和12.2B鏈組成的25.5kDa同型ニ聚體蛋白。I3DGFAB可以市購(gòu)獲得，例如從P印rotech(RockyHill,NewJersey)。表皮生長(zhǎng)因子或EGF是通過(guò)結(jié)合于其受體EGFR而在細(xì)胞生長(zhǎng)、增值和分化的調(diào)節(jié)中起重要作用的生長(zhǎng)因子。人EGF是6045-Da蛋白，有53個(gè)氨基酸殘基和3個(gè)分子內(nèi)ニ硫鍵。EGF通過(guò)以高親和カ結(jié)合于細(xì)胞表面上的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)并刺激所述受體的內(nèi)在蛋白酪氨酸激酶活性而發(fā)揮作用。酪氨酸激酶活性反過(guò)來(lái)可引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種生物化學(xué)變化——細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高、醣酵解和蛋白合成増加、某些基因(包括EGFR的基因)表達(dá)增加，所述變化最終可導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞増殖。EGF可以從許多制造商市購(gòu)獲得。生長(zhǎng)因子(例如FGF2和任選的TOGFAB)可以以如下濃度存在于所述培養(yǎng)基中約100pg/ml,例如約500pg/ml,例如約lng/ml,例如約2ng/ml,例如約3ng/ml,例如約4ng/ml,例如約5ng/ml。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含約5ng/ml的FGF2。所述培養(yǎng)基還可以包含I3DGFAB，例如以約5ng/ml。分開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞通常持續(xù)生長(zhǎng)至匯合，這時(shí)接觸抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止。然后，可以將這樣的細(xì)胞從底物或燒瓶中分離，并通過(guò)稀釋至組織培養(yǎng)基并再鋪板而“分開(kāi)(split)”、繼代培養(yǎng)或傳代。因此，本文描述的方法和組合物可以包括在培養(yǎng)過(guò)程中傳代或分開(kāi)。所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞可以以1:2或更大(例如1:3，例如1:4，1:5或更大)的比例分開(kāi)。術(shù)語(yǔ)“傳代”是指包括這樣的過(guò)程，即取細(xì)胞系的匯合培養(yǎng)物的等分試樣，接種于新鮮培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)所述細(xì)胞系至達(dá)到匯合或飽和。選擇、篩選或分選步驟所述方法還包括選擇或分選步驟，以進(jìn)ー步分離或選擇間充質(zhì)干細(xì)胞。所述選擇或分選步驟可以包括借助ー種或多種表面抗原標(biāo)記物從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中選擇間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。使用選擇或分選步驟還可增強(qiáng)MSC的分選和選擇特異性的嚴(yán)格性，此外有可能降低來(lái)自原材料的胚胎干細(xì)胞(例如hESC)和其他hESC衍生物的可能污染。然后，這將進(jìn)一歩降低畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)，并進(jìn)一步增加本發(fā)明人描述的方案的臨床相關(guān)性。已知許多方法可用于基于抗原表達(dá)的選擇或分選,這些方法的任一種均可以用于本文描述的選擇或分選步驟。所述選擇或分選可以借助熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)完成。因此，如本領(lǐng)域中已知的，F(xiàn)ACS涉及將細(xì)胞暴露于報(bào)告物，例如經(jīng)標(biāo)記的抗體，所述經(jīng)標(biāo)記的抗體可結(jié)合并標(biāo)記所述細(xì)胞表達(dá)的抗原。產(chǎn)生抗體并標(biāo)記其以形成報(bào)告物的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如記載于Harlow和Lane中。然后，使所述細(xì)胞通過(guò)FACS機(jī)器，其可基于所述標(biāo)記將所述細(xì)胞彼此分選開(kāi)。替代地或另外地，可以將磁性細(xì)胞分選(MACS)用于分選所述細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到，雖然大量候選表面抗原已知與MSC相關(guān)，例如⑶105、⑶73、ANPEP,ITGA4(CD49d)、PDGFRA，但所述MSC相關(guān)表面抗原中的ー些(例如CD29和CD49e)還在ES細(xì)胞(例如hESC)中高表達(dá)，它們的表達(dá)可通過(guò)FACS分析驗(yàn)證。表面抗原與MSC的關(guān)聯(lián)可能不足以使所述抗原具有作為從ES細(xì)胞(例如hESC)分離MSC的可選擇標(biāo)記物的資格。因此，所述選擇或分選步驟可以應(yīng)用MSC和ES細(xì)胞之間差異表達(dá)的抗原。本發(fā)明人的方法的選擇或分選步驟可以基于所述抗原的表達(dá)正向地選擇間充質(zhì)干細(xì)胞。這類(lèi)抗原可以通過(guò)例如比較hESC和hESCMSC的基因表達(dá)譜鑒定。在具體實(shí)施方案中，所述選擇和分選可以特異地利用如下表ElA和ElB中所示抗原的任ー種。本發(fā)明人的方法的選擇或分選步驟可以基于抗原的表達(dá)正向地選擇間充質(zhì)干細(xì)胞，所述抗原被鑒定在MSC上表達(dá)但不在ES細(xì)胞(例如hESC)上表達(dá)。CD73在MSC上高度表達(dá)，而在hESC上不高度表達(dá)。相對(duì)于hESC，CD73和CD105二者是MSC中的高度表達(dá)表面抗原，并且排在hESC-MSC中前20位高度表達(dá)表面抗原內(nèi)，使用⑶73或⑶105(或二者)作為推定MSC的可選擇標(biāo)記物在分選由分化hESC生成的推定MSC時(shí)將是等效的。替代地或者另外地，所述選擇或分選步驟可以基于表面抗原逆向地針對(duì)抗原進(jìn)行選擇，所述表面抗原在胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)例如hESC上作為高度表達(dá)的表面抗原，但在間充質(zhì)干細(xì)胞例如hESC-MSC上不作為高度表達(dá)的表面抗原。選擇或分選可以基于已知或已經(jīng)鑒定的hESC特異性表面抗原例如MIBP、ITGB1BP3和PODXL以及CD24。FACS分析確認(rèn)了CD24在hESC上表達(dá)，但不在hESC-MSC上表達(dá)。因此，CD24可以用作逆向選擇或分選標(biāo)記物，以其自身使用或者與作為正向選擇標(biāo)記物的CD105結(jié)合用于從分化hESC培養(yǎng)物中分離推定MSC。來(lái)自出生前源的間充質(zhì)干細(xì)胞從中可以制備所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞可以來(lái)自于出生前組織。所述出生前組織(例如胎兒組織)可以經(jīng)過(guò)處理，例如通過(guò)剝離、切碎或清洗或者它們的任意組合處理。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以基于任何合適的性質(zhì)(例如優(yōu)先粘著)來(lái)自于這類(lèi)出生前組織。例如，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以基于其粘著底物的能力而被選擇。所述底物可以包括例如塑料。因此，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)以下方式來(lái)自于出生前組織使所述出生前組織塊中的間充質(zhì)干細(xì)胞粘著于塑料。為此目的，可以將所述組織置于具有一個(gè)或多個(gè)塑料表面的容器中。這類(lèi)容器可以包括培養(yǎng)容器，例如組織培養(yǎng)皿。所述容器可以被膠化?？梢允顾鲩g充質(zhì)干細(xì)胞移動(dòng)出所述組織塊。可以使它們粘著于所述容器的表面?？梢詫⑹Ｓ嗟某錾敖M織除去，例如通過(guò)洗棹。因此，然后可以洗掉成塊的組織片，剩下同源的細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢詫⑺鼋M織培養(yǎng)在任何合適的培養(yǎng)基中，例如達(dá)爾伯克改良的伊格爾培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可以補(bǔ)加有任何合適的補(bǔ)充物，例如血清替代培養(yǎng)基、EGF、FGF2等。如果存在所述血清替代培養(yǎng)基，可以具有任何合適的濃度，例如10%。如果存在EGF，可以具有任何合適的濃度，例如5、10、15或20ng/ml。如果存在EGF2，可以具有任何合適的濃度，例如5、10、15或20ng/ml。可用于產(chǎn)生出生前間充質(zhì)干細(xì)胞的具體方案可以包括如下。所述培養(yǎng)物可以培養(yǎng)在無(wú)血清或有血清培養(yǎng)基中。當(dāng)匯合時(shí)，可以將所述培養(yǎng)物傳代，例如通過(guò)胰蛋白酶消化，然后以例如1:4分開(kāi)于膠化的組織培養(yǎng)皿上。無(wú)血清培養(yǎng)基可以由補(bǔ)加10%血清替代培養(yǎng)基、非必需氨基酸、10ng/mlFGF2、10ng/ml重組人EGF和55yMP-巰基こ醇的敲除DMEM培養(yǎng)基制成。含血清的培養(yǎng)基可以由補(bǔ)加青霉素-鏈霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10%胎牛血清的不含谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM制成?？梢允褂肨OGF代替EGF或者與EGF一起使用。所述培養(yǎng)物可以不包含共培養(yǎng)物例如飼養(yǎng)細(xì)胞，或者在不存在共培養(yǎng)物(例如不存在飼養(yǎng)細(xì)胞)的情況下建立。為此目的，可以將所述間充質(zhì)干細(xì)胞在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞層的情況下培養(yǎng)。這ー點(diǎn)在下文進(jìn)ー步詳述。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)以下方式產(chǎn)生基于細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)任選地從其他細(xì)胞中選擇間充質(zhì)干細(xì)胞，如下文中進(jìn)ー步詳述的。因此，所述細(xì)胞任選地可通過(guò)檢測(cè)例如CD105(登記號(hào)NMOOOl18.I)或CD73(登記號(hào)NM002526.I)或者二者的表達(dá)升高進(jìn)行選擇。所述細(xì)胞還可任選地通過(guò)檢測(cè)⑶24(登記號(hào)NM013230.I)的表達(dá)降低進(jìn)行選擇。因此，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)選擇CD105+CD24-的細(xì)胞而獲得。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)以抗合適表面抗原的抗體標(biāo)記所述細(xì)胞進(jìn)行選擇，并且可以通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選(FACS)或磁性細(xì)胞分選(MACS)進(jìn)行選擇。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征通過(guò)本文描述的方法和組合物獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的ー種或多種性質(zhì)或特征。它們可以滿(mǎn)足通常用于鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的任一種或多種形態(tài)學(xué)、表型和功能標(biāo)準(zhǔn)9，如本領(lǐng)域中已知的。所述性質(zhì)或特征可以由InternationalSocietyforCellularTherapy定義。具體而言,它們可以呈現(xiàn)Dominicietal(2006)中列出的ー種或多種特征。形態(tài)學(xué)通過(guò)本文所述的方法和組合物獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的ー種或多種形態(tài)學(xué)特征。通過(guò)本文所述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以在匯合處顯示典型的指紋螺環(huán)。所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以形成具有成纖維細(xì)胞表型的粘著單層。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以能夠粘著于塑料。它們可以具有72至96小時(shí)的平均群體倍增時(shí)間。最佳培養(yǎng)可以是25%至85%匯合，或者每cm215-50，000個(gè)細(xì)胞?？乖V此外，所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示與間充質(zhì)干細(xì)胞相似或相同的表面抗原譜。通過(guò)本文描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可能缺少ー種或多種多能性標(biāo)記物(例如0ct-4、SSEA-4和TRal-60)的表達(dá)或顯示其表達(dá)降低，例如在多肽水平。它們可以顯示0CT4和S0X2中一種或兩種的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但與胚胎干細(xì)胞(例如hES3人ESC)相比水平降低。表達(dá)水平可以是胚胎干細(xì)胞的二分之一、五分之一或十分之一或者更低。所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示“典型的”MSC樣表面抗原譜。例如，它們還可以顯示與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的ー種或多種標(biāo)記物的表達(dá)。這些可以包括如下的任ー種或多種的表達(dá)CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD105、CD166、MHCI。例如，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示其無(wú)表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的任一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)減少或缺失。因此，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示HLA-DR、⑶34和⑶45中的任ー個(gè)或多個(gè)的表達(dá)減少或缺失。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞特別可以包括CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、CD166+、MHCI+、CD34-和CD45-細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以是對(duì)小鼠特異性c-mos重復(fù)序列呈陰性的并且是對(duì)人特異性alu重復(fù)序列呈陽(yáng)性的。它可能能夠進(jìn)行骨發(fā)生、脂肪發(fā)生或軟骨發(fā)生中的任ー種或多種，特別是它可能能夠分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞中的任ー種或多種。分化潛能使用本領(lǐng)域中已知和下文所述的方法，所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成任何間充質(zhì)譜系。因此，通過(guò)本文所述方法和組合物獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示包括脂肪發(fā)生、軟骨發(fā)生和骨發(fā)生的分化潛能9。増殖能力如所述獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有很大的體外増殖能力。在一些實(shí)施方案中，所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以進(jìn)行至少10次群體倍増，同時(shí)保持正常二倍體核型。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可能能夠進(jìn)行至少20-30次群體倍増，同時(shí)保持正常二倍體核型。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞在整個(gè)該時(shí)間中顯示穩(wěn)定的基因表達(dá)和表面抗原譜。所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使得它們不顯示任何缺點(diǎn)，例如染色體畸變和/或基因表達(dá)改變。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)缺陷直到10代后(例如13代后，例如15代后)仍不明顯。同質(zhì)性所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示高度的一致性。換句話(huà)說(shuō)，從不同源獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示彼此共有的同樣或不同特征中的ー個(gè)或多個(gè)，例如數(shù)個(gè)。它們可以顯示與其他間充質(zhì)干細(xì)胞(例如人胚胎干細(xì)胞源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hESC-MSC)——如例如W02007/027157或W02007/027156中所述)共有的同樣或不同特征中的ー個(gè)或多個(gè)，例如數(shù)個(gè)。由本文所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞在性質(zhì)上可以相似或相同(例如同源)。也就是說(shuō)，通過(guò)所述方案分離的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞克隆彼此可以顯示高度的相似性或同一性，不管是在表型上或其他方面。相似性或同一性可以通過(guò)多種方式度量，并由ー種或多種特征測(cè)量。例如，所述克隆可以在基因表達(dá)上相似或相同。例如，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使得由所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞中的任兩種或多種(例如全部)呈現(xiàn)基本相似或相同的基因表達(dá)譜，也就是說(shuō)，所表達(dá)的基因類(lèi)型和它們所表達(dá)的水平的組合。通過(guò)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的兩個(gè)或多個(gè)隔離群(isolate)之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以大于0.8，例如大于0.85或0.9。通過(guò)所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的任何兩個(gè)或多個(gè)不同傳代(例如連續(xù)傳代)之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以大于0.8，例如大于0.85或0.9。由所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和hESC-MSC(例如W02007/027157或W02007/027156中所述的)之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以大于0.8，例如大于0.85或0.9。基因表達(dá)的同質(zhì)性可以通過(guò)多種方法測(cè)量。基因組規(guī)模的基因作譜可以使用例如實(shí)施例中所述的對(duì)提取的RNA的陣列雜交進(jìn)行?？梢蕴崛】俁NA并轉(zhuǎn)換成cDNA，cDNA可雜交于包含來(lái)自相關(guān)基因組的多個(gè)基因序列的陣列芯片。所述陣列可以包含NCBIReferenceSe-quence(RefSeq)基因，這些基因是由NationalCenterforBiotech-nologyInformation(NCBI)人員和合作者基于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證、注釋并整理的得到很好表征的基因。然后，可以將樣品之間的基因表達(dá)使用分析軟件進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)的相似性或同一性可以表示為“相關(guān)系數(shù)”。在這類(lèi)測(cè)量中，兩個(gè)樣品之間的高相關(guān)系數(shù)表示所述兩個(gè)樣品的基因表達(dá)模式之間的高相似度。相反，兩個(gè)樣品之間的低相關(guān)系數(shù)表示所述兩個(gè)樣品的基因表達(dá)模式之間的低相似度?？梢赃M(jìn)行歸ー化以在數(shù)據(jù)分析前除去系統(tǒng)變異或偏差(包括強(qiáng)度偏差、空間偏差、板偏差和背景偏差)。相關(guān)性檢驗(yàn)是本領(lǐng)域中公知的，包括T檢驗(yàn)和皮爾森檢驗(yàn)，如例如Hill,T.&Lewicki,P.(2006).Statistics:Methods和Applications.StatSoft,Tulsa,0K,ISBN:1884233597(alsoStatSoft,Inc.(2006).ElectronicStatisticsTextbook.Tulsa,OK:StatSoft.WEB:http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html)中所述。夢(mèng)考Khojastehetal.,2005,AstepwiseframeworkforthenormalizationofarrayCGHdata,BMCBioinformatics2005,6:274。還可以進(jìn)行組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)，如上文Khojastehetal中所述。例如，可以進(jìn)行皮爾森檢驗(yàn)以生成皮爾森相關(guān)系數(shù)。I.0的相關(guān)系數(shù)表示相同的基因表達(dá)模式。為了這類(lèi)目的，可以將cDNA與SentrixHumanRef_8ExpressionBeadChip雜交，并使用IlluminaBeadStation500x掃描。可以將數(shù)據(jù)使用IlluminaBeadStudio(Illumina,Inc,SanDiego,CA,USA)提取、歸ー化并分析。然而,對(duì)讀者來(lái)說(shuō)明顯的是,任何合適的芯片以及掃描硬件和軟件(其可輸出相關(guān)性測(cè)量值)均可以用于測(cè)定基因表達(dá)譜的相似性。任意兩個(gè)隔離群之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)(如例如通過(guò)上述方式測(cè)量的)可以為0.65或更大。所述基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以為0.70或更大，例如0.80或更大，例如0.85或更大，例如0.90或更大。所述系數(shù)可以為0.91或更大、0.92或更大、0.93或更大、0.94或更大、0.95或更大、0.96或更大、0.97或更大、0.98或更大、0.99或更大或I.O。在一些實(shí)施方案中，本文描述的方法可生成轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，如此得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的任兩個(gè)或多個(gè)隔離群之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)與一段時(shí)間間隔(例如I個(gè)月間隔)進(jìn)行的相同RNA樣品的技術(shù)重復(fù)物之間的相關(guān)系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)或比其稍微小。例如，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的任兩個(gè)或多個(gè)隔離群之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以為0.70或更大，例如0.80或更大，例如0.85或更大，例如0.90或更大.所述系數(shù)可以為0.91或更大、0.92或更大、0.93或更大、0.94或更大、0.95或更大、0.96或更大、0.97或更大、0.98或更大、0.99或更大或I.O。對(duì)于已經(jīng)進(jìn)行上文所述的衍生、選擇或分選步驟的細(xì)胞，所述基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以在這類(lèi)區(qū)間內(nèi)。大多數(shù)隔離群(例如所有隔離群)之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)可以在這類(lèi)區(qū)間內(nèi)。因此，本發(fā)明人提供了ー種生成彼此基本相似或相同(例如同源)的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。所述隔離群可以顯示幾乎相同的基因表達(dá)譜。除了上文所述的“內(nèi)部”同質(zhì)性(即來(lái)自所述方法的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的隔離群之間的同質(zhì)性)タト，還可以在這類(lèi)隔離群和其他細(xì)胞或細(xì)胞類(lèi)型之間評(píng)估同質(zhì)性。具體而言，可以與來(lái)自其他方法的間充質(zhì)干細(xì)胞例如人ESC-MSC培養(yǎng)物(例如W02007/027157或TO2007/027156中所述)進(jìn)行比較。因此，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)本文所述方法和組合物獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示與這類(lèi)人ESC-MSC培養(yǎng)物相似、同源或相同的基因表達(dá)譜。因此，所獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示與這類(lèi)人ESC-MSC培養(yǎng)物(例如W02007/027157或W02007/027156中所述的)之間大于0.5(例如大于0.6，例如大于0.7，例如大于0.8,例如大于0.9)的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)。端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性如此得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以包括端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性與對(duì)照細(xì)胞(例如非間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞)相比可以增加或上調(diào)。例如，所述對(duì)照細(xì)胞可以包括分化細(xì)胞，例如間質(zhì)譜系中的分化細(xì)胞，例如骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方式確定，例如使用TRAP活性測(cè)定法(Kimetal.,Science266:2011，1997)，使用市購(gòu)試劑盒(TRAPeze.RTM.XKTelomeraseDetectionKit,Cat.s7707;IntergenCo.,PurchaseN.Y.;orTeloTAGGG.TM.TelomerasePCRELISAplus,Cat.2,013,89;RocheDiagnostics,Indianapolis)。hTERT表達(dá)還可以通過(guò)RT-PCR在mRNA水平評(píng)估?？墒匈?gòu)LightCyclerTeloTAGGG.TM.hTERT定量試劑盒(Cat.3,012,344;RocheDiag-nostics)用于研究目的。例如，相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性可以通過(guò)實(shí)時(shí)定量端粒重復(fù)擴(kuò)增法測(cè)量。該基于qPCR的測(cè)定法可定量由所述樣品中存在的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性在體外生成的產(chǎn)物。所述相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性與端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物的量直接成比例，并且可以通過(guò)IUg蛋白細(xì)胞裂解物的閾值循環(huán)數(shù)(或Ct值)測(cè)定。Hues9.El是指以前記載的hESC-MSC系，HEK是人胚腎細(xì)胞系。每個(gè)胎兒MSC的Ct值可以取多個(gè)傳代(例如2、3、4個(gè)傳代等)的平均值。傳代可以包括例如3個(gè)傳代，例如P16、P18和P20。對(duì)于對(duì)照細(xì)胞例如Hues9.E1，所述平均值可以是對(duì)2個(gè)傳代，例如P20和P22。所述測(cè)定可以進(jìn)行多次，例如對(duì)每個(gè)傳代進(jìn)行3次。端粒末端轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)方法的具體實(shí)例在實(shí)施例中提供。來(lái)自本文所述方法的所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有25或更大，例如26或更大或27或更大的Ct值(通過(guò)這類(lèi)方法測(cè)定的)。所述Ct值可以為例如28或更大、29或更大、30或更大、31或更大或32或更大。維持自我更新所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可能能夠保持自我更新。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞系(來(lái)源自它們的分化細(xì)胞)可以使得它們不顯示胚胎干細(xì)胞的一種或多種特征。這類(lèi)特征可以包括表達(dá)0CT4基因、SSEA-4基因、Tral-60基因以及堿性磷酸酶活性。所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以呈現(xiàn)ー種或多種特征性多能標(biāo)記物的表達(dá)減少。這類(lèi)多能標(biāo)記物可以包括Nanog、BMP4、FGF5、0ct4、Sox-2和UtfI等。由本文所述方法制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以是非致瘤和/或非致畸形的。因此，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使得當(dāng)它們被移植至受體動(dòng)物時(shí)基本不誘導(dǎo)畸胎瘤的形成。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使得當(dāng)其被植入免疫妥協(xié)或免疫缺陷宿主動(dòng)物中時(shí)不導(dǎo)致腫瘤。所述受體動(dòng)物可以包括免疫妥協(xié)的受體動(dòng)物。免疫妥協(xié)或免疫缺陷宿主動(dòng)物可以包括SCID小鼠或Ragl-/-小鼠。所述細(xì)胞可以使得轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞被轉(zhuǎn)化至其中的受體動(dòng)物在植入后合適的時(shí)間期間(例如3周或2-9個(gè)月)不顯示畸胎瘤形成。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使得在植入較長(zhǎng)時(shí)期(例如大于2周，例如大于2個(gè)月，例如大于9個(gè)月，)后不形成腫瘤。致腫瘤性測(cè)試的詳細(xì)方案如下。將IXIO6個(gè)胚胎干細(xì)胞皮下移植至SCID小鼠中。在3周時(shí)當(dāng)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的腫瘤直徑約Icm時(shí)，使用Qtracker㊣細(xì)胞標(biāo)記試劑盒(QuantumDotCorp,Hayward,CA)將以Qdot㊣納米晶體(655nm發(fā)射)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞注射至所述胚胎干細(xì)胞來(lái)源的畸胎瘤中。3天后，將所述小鼠用超劑量的麻醉劑安樂(lè)處死，并取出腫瘤。將所述腫瘤在4%的低聚甲醒中固定并以20iim的厚度冷凍切片。通過(guò)以下方式測(cè)定所述切片的pecam-1免疫反應(yīng)性使用大鼠抗pecaml的抗體(Pharmingen,SanDiego,California),然后是FITC-綴合的兔抗大鼠的抗體(Chemicon,Temecula,California),并且以DAPI復(fù)染。通過(guò)共聚焦顯微鏡分析所述切片。由本文所述的方法制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞還可以顯示一種或多種如下特性。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以維持在細(xì)胞培養(yǎng)物中較長(zhǎng)的期間，例如大于40個(gè)世代。它們可以具有由染色體數(shù)目評(píng)估的基本穩(wěn)定的核型，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中維持至少10個(gè)世代時(shí)如此。它們還可以顯示世代與世代之間基本穩(wěn)定的基因表達(dá)模式。對(duì)于這一點(diǎn)，本發(fā)明人是指所選擇的基因集合中的ー個(gè)或多個(gè)(例如基本全部)的表達(dá)水平在ー個(gè)世代的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和下ー個(gè)世代的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞之間沒(méi)有顯著變化。所述基因集合可以包括如下中的ー個(gè)或多個(gè)、亞集或全部cerberus(GenBank登錄號(hào)NM009887，AF031896，AF035579)、FABP(GenBank登錄號(hào)NM_007980，M65034,AY523818，AY523819)、Foxa2(GenBank登錄號(hào)NM_01-0446，X74937,L10409)、Gata-1(GenBank登錄號(hào)NM008089，X15763,BC052653)、Gata_4(GenBank登錄號(hào)NM_008092，AF179424,U85046,M98339,AB075549),Hesxl(GenBank登錄號(hào)NM010420，X80040,U40720,AK082831)、HNF4a(GenBank登錄號(hào)NM_008261,D29015,BC039220)、c_kit(GenBank登錄號(hào)NM_021099,Y00864,AY536430,BC075716,AK047010,BC026713,BC052457,AK046795)、PDGFRa(匪_011058，M57683,M84607,BC053036)、0ct4(GenBank登錄號(hào)NM013633,X52437,M34381,BC068268),Runxl(GenBank登錄號(hào)NM009821,D26532,BC069929，AK051758)、Soxl7(GenBank登錄號(hào)NM_011441，D49474,L29085,AK004781),Sox2(GenBank登錄號(hào)NM011443,U31967,AB108673),Brachyury(NM_009309,X51683)、TDGFl(GenBank登錄號(hào):NM_011562，M87321)和Tie-2(GenBank登錄號(hào)NM013690,X67553,X71426,D13738,BC050824)o本文描述的方法使得能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞以及分化細(xì)胞，所述分化細(xì)胞包含轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)性后代。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞的“無(wú)性后代”是指基本沒(méi)有發(fā)生任何轉(zhuǎn)化處理或遺傳改變的所述細(xì)胞的后代。未發(fā)生實(shí)質(zhì)性基因組變化的這類(lèi)無(wú)性后代與親代細(xì)胞或祖先(例如所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞)在遺傳上基本相同。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞”應(yīng)被認(rèn)為包括來(lái)源自轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞系，即轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞系，反之亦然。長(zhǎng)期保持培養(yǎng)可以將所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或其后代培養(yǎng)多于ー個(gè)世代。例如，可以將所述細(xì)胞培養(yǎng)多于5、多于10、多于15、多于20、多于25、多于50、多于40、多于45、多于50、多于100、多于200、多于500或多于800個(gè)世代。具體地，可以將所述細(xì)胞系保持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200,500或更多個(gè)世代。培養(yǎng)中的細(xì)胞通常將持續(xù)生長(zhǎng)至匯合，這時(shí)接觸抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止。然后，可以將這樣的細(xì)胞從底物或燒瓶上分離，并通過(guò)稀釋至組織培養(yǎng)基并再鋪板來(lái)“分開(kāi)”或傳代。因此，所述培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中傳代或分開(kāi)。它們可以以1:2或更大(例如1:3或1:4，1:5或更大)的比率分開(kāi)。術(shù)語(yǔ)“傳代”是指包括這樣的過(guò)程，即取細(xì)胞系的匯合培養(yǎng)物的等分試樣，接種于新鮮培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)所述細(xì)胞系直至達(dá)到匯合或飽和。然而，根據(jù)本文描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以保持許多世代。另ー方面，已經(jīng)確定的是，直接來(lái)自生物體的“正常”細(xì)胞(即未轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞)不是永生的。換言之，這類(lèi)體細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)具有有限壽命(它們是非永生的)。它們將不持續(xù)無(wú)限生長(zhǎng)，而是在某一數(shù)目的世代后將最終失去増殖或分裂的能力。在達(dá)到“關(guān)鍵期”吋，這類(lèi)細(xì)胞在約50個(gè)世代后死亡。因此，這類(lèi)體細(xì)胞僅可以傳代有限次。根據(jù)本文描述的方法，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以繁殖多于50個(gè)世代。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞系無(wú)限繁殖。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以是譜系限制性的。具體而言，它們可以是使得它們不能產(chǎn)生所有三個(gè)胚層。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞系可以是非多能性的。本發(fā)明人還提供了包含多個(gè)細(xì)胞的組合物，其中大多數(shù)所述細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。例如，至少60%的所述細(xì)胞可以包括間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，本發(fā)明人提供了分離的間充質(zhì)干細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞系可以被認(rèn)為指可以在培養(yǎng)時(shí)被維持并培養(yǎng)，并且顯示永生或無(wú)限壽命的細(xì)胞。心臟保護(hù)能力如此得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以包括心臟保護(hù)能力，如實(shí)施例中所述。所述心臟保護(hù)作用可以包括在缺血和/或再灌注過(guò)程中恢復(fù)或維持心臟功能。心臟保護(hù)作用可以在任何合適的模型系統(tǒng)(例如急性心肌梗塞(AMI)的小鼠模型)中測(cè)定。在這類(lèi)測(cè)定中，AMI是通過(guò)永久結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支而在小鼠中誘導(dǎo)，如Salto-TellezM,YungLimS,El-OakleyRM,TangTP,ZAAL,etal.(2004)MyocardialinfarctionintheC57BL/6Jmouse:aquantifiableandhighlyreproducibleexperi-mentalmodel.CardiovascPathol13:91-97中所述。然后，將100UI如上文所述制備的IOX濃縮的條件培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基(對(duì)照)經(jīng)置于頸靜脈處的滲透泵在72小時(shí)內(nèi)給予小鼠。這個(gè)小鼠中的心臟功能在3周后通過(guò)MRI評(píng)估。心臟保護(hù)作用還可以在心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷的豬/小鼠模型中測(cè)定(TimmersL,LimS-K,ArslanF，etal.Reductionofmy-ocardialinfarctsizebyhumanmesenchymalstemcellconditionedmedium,^temCel丄Research.2008;1:129-137)。在該測(cè)定中，損傷是通過(guò)暫時(shí)阻塞豬冠狀動(dòng)脈左旋支或小鼠LAD而誘導(dǎo)，然后除去阻塞以開(kāi)始再灌注。上文描述的心臟保護(hù)作用測(cè)定法還可以用于測(cè)試心臟保護(hù)作用，尤其在慢性缺血中。該MI/R損傷模型和其他MI/R損傷模型本質(zhì)上評(píng)估在不同臨床適應(yīng)癥中的心臟保護(hù)作用。如此得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基或者從它們分離的顆?？赡苣軌驕p輕再灌注損傷。這可以使用如W02008/020815中所述的豬缺血-再灌注模型測(cè)定。如下是用于測(cè)定間充質(zhì)干細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞)條件培養(yǎng)基的心臟保護(hù)能力的簡(jiǎn)單方案。MI可以是通過(guò)用縫線(xiàn)結(jié)扎動(dòng)脈阻塞左冠狀動(dòng)脈(LCA)30分鐘來(lái)誘導(dǎo)。后面的再灌注可以通過(guò)釋放所述縫線(xiàn)開(kāi)始。再灌注之前5分鐘，經(jīng)尾靜脈給小鼠靜脈輸注200uI鹽水稀釋的條件培養(yǎng)基(包含來(lái)自Hues9.El(hESC-MSC)CM的3yg蛋白或胎兒MSCCM的150iig蛋白)。對(duì)照動(dòng)物被輸注200200ill鹽水。在24小時(shí)的再灌注后，作為風(fēng)險(xiǎn)面積(AAR)百分比的梗塞面積(IS)可以使用以前在參考文獻(xiàn)26中描述的伊凡斯藍(lán)染料(Evans’bluedye)注射和TTC染色進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)而言之，僅在切除心臟用于分析之前，如在誘導(dǎo)缺血時(shí)那樣再結(jié)扎LCA，伊凡斯藍(lán)染料可以被注入主動(dòng)脈，AAR可以確定為不被伊凡斯藍(lán)染色的區(qū)域。然后，可以將心臟切下，并且以TTC染色心臟的橫切面。活心肌膜被TTC染色為紅色，而死心肌膜不被染色。相對(duì)梗塞面積可以被測(cè)量為不被TTC染色的死心肌膜面積與不被伊凡斯藍(lán)染料染色的面積確定的AAR風(fēng)險(xiǎn)的比。梗塞面積所得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以具有減少梗塞面積的能力。與以非條件培養(yǎng)基或鹽水處理的動(dòng)物相比，所述梗塞面積可以減少10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或更多或者70%或更多。測(cè)定梗塞面積梗塞面積例如可以使用如下的方法測(cè)定。就在切除心臟之前，將LCxCA(豬)或LCA(小鼠)在與用于誘導(dǎo)MI的位置完全相同的位置處再結(jié)扎。將伊凡斯藍(lán)染料注入整個(gè)冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)以描述出風(fēng)險(xiǎn)面積(AAR)。然后將心臟切除，將LV分離并從頂部至基部切成5片。將所述切片以溶于37°CSlirenseil緩沖液(13.6g/LKH2P04+17.8g/LNa2HP042H20,pH7.4)中的1%氯化三苯四唑(TTC,Sigma-AldrichChemicals,Zwijndrecht,theNetherlands)孵育15分鐘，以區(qū)分梗塞組織與活心肌膜。對(duì)所有切片均掃描兩面，在每一面，通過(guò)使用數(shù)字面積法軟件(ImageJ)將梗塞面積與風(fēng)險(xiǎn)面積和總面積比較。在對(duì)所述切片重量校正后，梗塞面積被計(jì)算為AAR和LV的百分?jǐn)?shù)。氧化應(yīng)激通過(guò)本文描述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可能能夠減少氧化應(yīng)激。與以非條件培養(yǎng)基或鹽水處理的動(dòng)物相比，所述氧化應(yīng)激可以減少10%或更多、20%或更多、25%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、60%或功能更多或者70%或更多。氧化應(yīng)激的減少可以以過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激的減少例如可以使用在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定法迸行測(cè)定?？傊?，過(guò)氧化氫(H2O2)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在人白血病CEM細(xì)胞中被誘導(dǎo)，并且通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法監(jiān)測(cè)細(xì)胞生活力。將人白血病CEM細(xì)胞與條件培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(以鹽水作為對(duì)照)孵育，并以50uMH2O2處理以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。細(xì)胞生存カ是在H2O2處理后12、24、36和48小時(shí)使用臺(tái)盼藍(lán)排除法進(jìn)行評(píng)估。氧化應(yīng)激的減少還可以使用DNA氧化的體內(nèi)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。體內(nèi)氧化應(yīng)激還可以如下進(jìn)行測(cè)定。將豬以所述顆粒、條件培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(以鹽水作為對(duì)照)處理。獲得豬心臟的組織切片。通過(guò)對(duì)氧化的DNA的8-0hdG免疫染色來(lái)定量處理的和未處理的豬的組織切片中的核氧化應(yīng)激。對(duì)組織切片測(cè)定指示DNA氧化和氧化應(yīng)激的強(qiáng)核染色。用途根據(jù)本文描述的方法制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以用于多種商業(yè)上重要的研究、診斷和治療目的。這些用途是本領(lǐng)域中公知的，但將在本文中簡(jiǎn)單描述。間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞群可以用于再生性療法。間充質(zhì)干細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和從其制備的分化細(xì)胞)可以通過(guò)離體擴(kuò)增制備或者直接給予患者。它們還可以用于在創(chuàng)傷后受損組織的再増殖。因此，脂肪細(xì)胞或來(lái)自其的脂肪組織可以用于在重建或整形手術(shù)過(guò)程中填充腔或凹陷。軟骨細(xì)胞可以用于軟骨修復(fù)，而骨細(xì)胞可以用于骨修復(fù)。由本文描述的方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成任何的這些細(xì)胞類(lèi)型，并且可以用于所述目的。本文描述的方法和組合物可以用于產(chǎn)生分化細(xì)胞，用于治療如下任ー種疾病或制備用于治療如下ー種疾病的藥物組合物可通過(guò)再生療法治療的疾病、心カ衰竭、骨髄病、皮膚病、燒傷、退行性疾病例如糖尿病、阿爾茨默病、帕金森病和癌癥。由本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以用于治療疾病或者用于制備治療疾病的藥物組合物。這類(lèi)疾病可以包括可通過(guò)再生療法治療的疾病，包括心カ衰竭、骨髓病、皮膚病、燒傷、退行性疾病例如糖尿病、阿爾茨默病、帕金森病等和癌癥。例如，干細(xì)胞可以用作間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞的源，用于癌癥的免疫療法的NK或樹(shù)狀細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以通過(guò)本文描述的方法和組合物制備。明顯的是，本文所述方法和組合物使得能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，其理所當(dāng)然可以使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行分化。因此，分化細(xì)胞的任何用途將同樣地隸屬于作為它們來(lái)源的這些轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞。分化細(xì)胞分化細(xì)胞(例如終末分化細(xì)胞)可以來(lái)自于根據(jù)所述方法制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞系。因此，本發(fā)明人公開(kāi)了用于生成分化細(xì)胞的方法，所述方法包括生成所述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞系，并從它們得到分化細(xì)胞。由本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成任何這些細(xì)胞類(lèi)型，并用于所述目的?？梢愿鶕?jù)本文所述方法制備的分化細(xì)胞可以包括如下的任意或全部i)脂肪細(xì)胞脂肪或脂肪組織的功能性細(xì)胞類(lèi)型，出現(xiàn)在整個(gè)身體，特別是在皮膚下。脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存并合成脂肪用于能量、熱調(diào)節(jié)和抗機(jī)械沖擊的緩沖ii)心肌細(xì)胞使心臟持續(xù)并有節(jié)律跳動(dòng)的心臟的功能性肌肉細(xì)胞類(lèi)型iii)軟骨細(xì)胞制備關(guān)節(jié)、耳道、氣管、會(huì)厭、喉、椎骨之間椎間盤(pán)和肋末端的軟骨的功能性細(xì)胞類(lèi)型iv)成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在身體大多數(shù)組織中的結(jié)締組織細(xì)胞或支持細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可提供指導(dǎo)性的支持骨架，以幫助具體器官的功能性細(xì)胞類(lèi)型正確發(fā)揮功能。v)肝細(xì)胞制備用于解毒代謝廢物、破壞紅細(xì)胞并回收其組分以及合成血漿蛋白的酶的肝的功能性細(xì)胞類(lèi)型vi)造血細(xì)胞制備血液的功能性細(xì)胞類(lèi)型。造血細(xì)胞存在于成年骨髄中。在胎兒中，造血細(xì)胞存在于肝、脾、骨髓以及子宮中胎兒周?chē)闹С纸M織中。vii)肌細(xì)胞肌肉的功能性細(xì)胞類(lèi)型viii)神經(jīng)元專(zhuān)門(mén)傳導(dǎo)沖動(dòng)的腦的功性能細(xì)胞類(lèi)型ix)成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)制造骨的功能性細(xì)胞類(lèi)型X)胰島細(xì)胞負(fù)責(zé)分泌胰島素、胰高血糖素、促胃液素和促生長(zhǎng)素抑制素的胰的功能性細(xì)胞?？傊?，這些分子可調(diào)節(jié)包括碳水化合物和脂肪代謝、血糖水平和至胃中的酸分泌的多個(gè)過(guò)程。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞的用途根據(jù)本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以用于多種商業(yè)上重要的研究、診斷和治療目的。例如，分化細(xì)胞的群可以用于制備對(duì)所述分化表型特異性的抗體和cDNA文庫(kù)。用于提高、純化和修飾抗體的常用技術(shù)以及它們?cè)诿庖邷y(cè)定和免疫分離方法中的用途記載亍HandbookofExperimentalImmunology(ffeir&Blackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmu-nologyCしoliganetal.,eds.);和MethodsofImmunologicalAnalysis(Masseyeffetal.,eds.，Weinheim:VCHVerlagsGmbH)。制備mRNA和cDNA文庫(kù)中涉及的常用技術(shù)記載于RNAMethodologies:ALa-boratoryGuideforIsolationandCharacterization(R.E.Farrell,AcademicPress,1998);cDNALibraryProtocols(Cowell&Austin,eds.,HumanaPress);和FunctionalGenomics(Hunt&Livesey,eds.，2000)。相對(duì)同源的細(xì)胞群特別適合用于藥物篩選和治療應(yīng)用。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞的這些用途和其他用途更詳細(xì)記載于下文和本文他處。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以特別用于制備用于治療疾病的藥物組合物。這類(lèi)疾病可以包括可通過(guò)再生療法治療的疾病，包括心カ衰竭、骨髄病、皮膚病、燒傷、退行性疾病例如糖尿病、阿爾茨默病、帕金森病等和癌癥。由本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞具有與來(lái)源自人胚胎干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(hESC-MSC)(例如W02007/027157或W02007/027156中所述的)相似或相同的性質(zhì)。因此，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和從其制備的任何分化細(xì)胞可以用于任何這樣的應(yīng)用，即已知使用間充質(zhì)干細(xì)胞(例如hESC-間充質(zhì)干細(xì)胞)的應(yīng)用或者可能使用它們的應(yīng)用。藥物篩選根據(jù)本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞還可以用于篩查影響轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或分化細(xì)胞的特征的因子(例如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸等)或環(huán)境條件(例如培養(yǎng)條件或操作)。在一些應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可用于篩查在長(zhǎng)期培養(yǎng)中促進(jìn)這類(lèi)細(xì)胞成熟或者促進(jìn)這類(lèi)細(xì)胞的増殖和維持的因子。例如，候選成熟因子或生長(zhǎng)因子通過(guò)以下方式進(jìn)行測(cè)試將它們加入不同孔的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或分化細(xì)胞中，然后根據(jù)用于進(jìn)ー步培養(yǎng)和使用所述細(xì)胞的所需標(biāo)準(zhǔn)確定這導(dǎo)致的任何表型變化。此外，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞的基因表達(dá)譜可以用于鑒定這些細(xì)胞中特異的或高度表達(dá)的受體、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳導(dǎo)分子。所述受體、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳導(dǎo)分子的特異性配體、小分子抑制劑或激活劑可以用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞的分化和性質(zhì)。具體的篩查應(yīng)用涉及藥物研究中測(cè)試藥物化合物。除了本文他處關(guān)于藥物篩選的一般性描述之外，讀者通?？蓞⒖紭?biāo)準(zhǔn)教科書(shū)'InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch',AcademicPress,1997和U.S.Pat.No.5,030,015。評(píng)估候選藥物化合物的活性一般涉及將所述分化細(xì)胞與所述候選化合物相結(jié)合，確定所述化合物造成的所述細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、標(biāo)記物表型或代謝活性的任何變化(與未處理的細(xì)胞或以惰性化合物處理的細(xì)胞相比)，然后將所述化合物的效應(yīng)與觀察到的變化相關(guān)聯(lián)。可以進(jìn)行所述篩選，例如因?yàn)樗龌衔锉辉O(shè)計(jì)成對(duì)某些細(xì)胞類(lèi)型具有藥理效應(yīng)，或者因?yàn)楸辉O(shè)計(jì)成在別處具有效應(yīng)的化合物可能具有不想要的副作用。兩種或多種藥物可以組合測(cè)試(通過(guò)同時(shí)或相繼與所述細(xì)胞相結(jié)合)，以檢測(cè)可能的藥物-藥物相互效應(yīng)。在一些應(yīng)用中，最初篩選化合物的潛在毒性(Castelletal.,pp.375-410in/InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,1AcademicPress,1997)。細(xì)胞毒性在第一情況中可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞生存力、存活率、形態(tài)學(xué)以及某些標(biāo)記物、受體或酶的表達(dá)或釋放的效應(yīng)而確定。藥物對(duì)染色體DNA的效應(yīng)可以通過(guò)測(cè)量DNA合成或修復(fù)進(jìn)行確定。[3H]胸苷或BrdU整合(特別是在細(xì)胞周期中不定時(shí)間或者高于細(xì)胞復(fù)制所需的水平吋)與藥物效應(yīng)一致。不利效應(yīng)還可以包括不常見(jiàn)的姐妹染色単體互換率，這通過(guò)細(xì)胞分裂中期涂片確定。讀者可以參考A.Vickers(PP375-410in/InvitroMethodsinPharmaceuticalResearch,'AcademicPress,1997)獲得更詳細(xì)描述。組織再生根據(jù)本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞還可以用于在需要它的人患者中進(jìn)行組織重建或再生。將所述細(xì)胞以使它們能夠移植至目標(biāo)組織部位并重建或再生所述功能缺陷區(qū)域的方式給予。例如，本文所述方法和組合物可以用于調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以用于組織工程，例如用于生成皮膚移植物。對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)可以用于人造器官或組織的生物工程，或者用于修復(fù)學(xué)例如支架。癌癥由本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞可以用于治療fe怔。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性的”是指或者描述一般以不受控細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的哺乳動(dòng)物中的生理病癥。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這類(lèi)癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀上皮細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和神經(jīng)纖維瘤病、宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎臟癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤和多種類(lèi)型的頭頸癌。進(jìn)ー步的實(shí)例是實(shí)體瘤癌，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌；造血系統(tǒng)惡性腫瘤，包括白血病和淋巴瘤、霍奇金病、再生障礙性貧血、皮膚癌和常見(jiàn)的腺瘤性息肉病。進(jìn)ー步的實(shí)例包括腦腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、乳腺腫瘤、宮頸腫瘤、眼腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、睪丸腫瘤、腫瘤、骨腫瘤、滋養(yǎng)層腫瘤、輸卵管腫瘤、直腸腫瘤、結(jié)腸腫瘤、腎腫瘤、胃腫瘤和副甲狀腺腫瘤。還包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、惡性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巣癌、宮頸癌和膽管癌。根據(jù)本文所述方法和組合物制備的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化細(xì)胞還可以與抗癌劑(例如內(nèi)皮他丁和血管他丁)或細(xì)胞毒劑或化學(xué)治療劑結(jié)合使用。例如，藥物，例如阿霉素、道諾霉素、順鉬、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇；以及生物堿類(lèi)，例如長(zhǎng)春新堿；以及抗代謝物，例如甲氨蝶呤。本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能并/或造成細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意欲包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化學(xué)治療劑和毒素，例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物源的酶活性毒素或其片段。同吋，該術(shù)語(yǔ)包括癌基因產(chǎn)物/酪氨酸激酶抑制劑，例如W094/22867中所公開(kāi)的雙環(huán)安沙霉素類(lèi)；EP600832中公開(kāi)的1，2-雙(芳基氨基)苯甲酸衍生物；EP600831中公開(kāi)的6，7-ニ氨基-酞嗪-I-酮衍生物；EP516598中公開(kāi)的4，5-雙(芳基氨基)-酞酰亞胺衍生物；或抑制酪氨酸激酶結(jié)合于含SH2的底物蛋白的肽(例如，參見(jiàn)WO94/07913)?！盎瘜W(xué)治療劑”是用于治療癌癥的化合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿喃唳(5-FU)、胞喃唳阿糖胞苷、(Ara-C)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消安、Cytoxin、紫杉醇、甲氨蝶呤、順鉬、美法侖、長(zhǎng)春堿、博來(lái)霉素、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、VP-16、長(zhǎng)春瑞濱、卡鉬、替尼泊甙、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、更生霉素、絲裂霉素、煙酰胺、埃斯培拉霉素(Esperamicins)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4，675，187)、美法侖和其他相關(guān)氮芥和內(nèi)分泌治療物(例如己烯雌酚(DES)、他莫昔芬、LHRH拮抗藥物、黃體酮、抗孕激素等)?？芍委煹募膊】梢詫?duì)通過(guò)本文所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分析。如此獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有與間充質(zhì)干細(xì)胞(例如W02007/027157或TO2007/027156中描述的hESC-MSC)類(lèi)似的表達(dá)譜。因此，由本發(fā)明人的方法得到的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有與其對(duì)應(yīng)物明顯的生物相似性，例如在它們分泌旁分泌因子的能力方面。因此，本文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于hESC-MSC(例如W02007/027157或TO2007/027156中描述的那些)適合的任何目的所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于治療代謝、防御反應(yīng)以及組織分化(包括血管生成、造血作用和骨骼發(fā)育)的疾病，或者其修復(fù)或治療涉及任一個(gè)或多個(gè)這些生物過(guò)程的疾病。類(lèi)似地，由所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)(例如分泌)的蛋白可以單獨(dú)地或結(jié)合地(例如以條件培養(yǎng)基的形式)用于補(bǔ)充所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的活性或者替代所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于例如治療或預(yù)防這類(lèi)疾病的目的。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于在心血管生物學(xué)、骨發(fā)育和造血作用中活化信號(hào)傳導(dǎo)通路，例如Jak-STAT、MAPK,Toll樣受體、TGF-^信號(hào)傳導(dǎo)和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此，所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、其表達(dá)的蛋白等可以用于預(yù)防或治療這樣的疾病，即其中涉及這些信號(hào)傳導(dǎo)通路中的任一種或其病因涉及這些信號(hào)傳遞通路的任一種或多種中的ー種或多種缺陷。因此，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于治療心カ衰竭、骨髄病、皮膚病、燒傷和退行性疾病例如糖尿病、阿耳茨海默病、帕金森病和癌癥。轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于治療心肌梗塞、皮膚傷ロ、皮膚科疾病、皮膚損害、皮炎、銀屑病、濕疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮膚癌、特應(yīng)性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、潰瘍、以誘導(dǎo)炎癥和免疫功能失調(diào)(其導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失)的初始損傷為特征的病理病癥、腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎或矯形疾病。它們可以用于協(xié)助個(gè)體中的傷ロ愈合、瘢痕減少、骨形成、骨移植或骨髄移植。本發(fā)明人提供了本文獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基在調(diào)節(jié)包括如下任ー種或多種通路的通路中的用途RhoGTP酶的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、整聯(lián)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路、由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥、FGF信號(hào)傳導(dǎo)通路、EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、血管發(fā)生、血纖維蛋白溶酶原活化的級(jí)聯(lián)、凝血、醣酵解、泛素蛋白酶體通路、嘌呤的從頭生物合成、TCA循環(huán)、苯丙氨酸生物合成、血紅素生物合成。本發(fā)明人還提供了本文獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基在調(diào)節(jié)包括如下任一種或多種過(guò)程的過(guò)程中的用途細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞粘著、胞吞作用、有絲分裂、胞吐作用、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞周期、免疫力和防御、細(xì)胞因子/趨化因子介導(dǎo)的免疫力、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)因子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞粘著介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、JAK-STAT級(jí)聯(lián)、抗氧化和自由基清除、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、血液凝固、發(fā)育過(guò)程、中胚層發(fā)育、骨骼發(fā)育、血管發(fā)生、肌肉發(fā)育、肌收縮、蛋白質(zhì)代謝和修飾、蛋白質(zhì)酶解、蛋白質(zhì)折疊、蛋白復(fù)合體裝配、氨基酸活化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、其他蛋白的靶向和定位、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)ニ硫鍵異構(gòu)酶反應(yīng)、碳水化合物代謝、糖酵解、戊糖磷酸支路、其他多糖代謝、嘌呤代謝、磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)、維生素代謝、氨基酸生物合成、前體mRNA加工、翻譯調(diào)控、mRNA剪接。本發(fā)明人還提供了本文獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基在提供包括如下任一種或多種功能的功能中的用途信號(hào)傳導(dǎo)分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、其他細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白、其他細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白、蛋白酶、金屬蛋白酶、其他蛋白酶、蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、氧化還原酶、脫氫酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白、伴侶素、Hsp70家族伴侶蛋白、其他伴侶蛋白、合成酶、合酶和合成酶、選擇性鈣結(jié)合蛋白、氨酰tRNA合成酶、裂解酶、異構(gòu)酶、其他異構(gòu)酶、ATP合酶、水合酶、轉(zhuǎn)氨酶、其他裂解酶、其他酶調(diào)節(jié)物、選擇性調(diào)節(jié)分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、非馬達(dá)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白、膜聯(lián)蛋白、微管蛋白、細(xì)胞粘著分子、肌動(dòng)蛋白結(jié)合馬達(dá)蛋白、中間絲、核糖核蛋白、核糖體蛋白質(zhì)、翻譯因子、其他RNA結(jié)合蛋白、組蛋白、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、囊泡外殼蛋白。再者，本文獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或由這類(lèi)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以用于治療這樣的疾病，即這些功能可能在其中發(fā)揮作用或者其修復(fù)或治療涉及任一個(gè)或多個(gè)這些生物過(guò)程。類(lèi)似地，由所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的蛋白可以單獨(dú)地或結(jié)合地(例如以條件培養(yǎng)基的形式)用于補(bǔ)充所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞的活性或者替代所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于例如治療或預(yù)防這類(lèi)疾病的目的。由本文獲得的所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的基因產(chǎn)物可以用于活化心血管生物學(xué)、骨發(fā)育和造血作用中的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，例如Jak-STAT、MAPK,Toll樣受體、TGF-^信號(hào)傳導(dǎo)和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此，所述hESC-MSC、其表達(dá)的蛋白等可以用于預(yù)防或治療這樣的疾病，即其中涉及這些信號(hào)傳遞通路任一種或其病因涉及這些信號(hào)傳遞通路的任ー種或多種中ー種或多種缺陷。因此，這類(lèi)條件培養(yǎng)基可以用于治療心カ衰竭、骨髄病、皮膚病、燒傷和退行性疾病例如糖尿病、阿耳茨海默病、帕金森病和癌癥。這類(lèi)條件培養(yǎng)基還可以用于治療心肌梗塞、皮膚傷ロ、皮膚科疾病、皮膚損害、皮炎、銀屑病、濕疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮膚癌、特應(yīng)性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、潰瘍、以誘導(dǎo)炎癥和免疫功能失調(diào)(其導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失)的初始損傷為特征的病理病癥、腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎或矯形疾病。所述條件培養(yǎng)基可以用于協(xié)助個(gè)體中的傷ロ愈合、瘢痕減少、骨形成、骨移植或骨髓移植。特別地，所述條件培養(yǎng)基可以用于調(diào)節(jié)涉及血管形成、血液學(xué)(特異性免疫過(guò)程)或肌肉骨骼發(fā)育等的過(guò)程。這樣的組合物可以用于任何可以使用所述條件培養(yǎng)基的目的。除非上下文另外指出，術(shù)語(yǔ)“條件培養(yǎng)基”應(yīng)被認(rèn)為不僅包括暴露于MSC的細(xì)胞培養(yǎng)基，而且包括這樣的組合物，即其包含存在于所述條件培養(yǎng)基中的ー種或多種(例如基本全部)多肽。此外，由本文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(包括條件培養(yǎng)基的形式)分泌的任ー種或多種蛋白可以用于與W02007/027157或W02007/027156中描述的hESC-MSC相同的目的。所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞還可以用作由它們分泌或表達(dá)的任一蛋白的源。因此，本發(fā)明人提供了一種產(chǎn)生多肽的方法，包括如所述獲得轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞，并從所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞中分離所述多肽，例如從所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。皮膚科疾病由通過(guò)本文中所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以用于治療皮膚科疾病。因此，將這類(lèi)條件培養(yǎng)基局部應(yīng)用于皮膚傷ロ或皮膚科損害或疾病(例如皮炎或銀屑病)可改善愈合并減少瘢痕形成。還應(yīng)保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。所述條件培養(yǎng)基可以在基于脂質(zhì)體的乳劑、凝膠或者乳膏制劑和標(biāo)準(zhǔn)傷ロ敷料的一部分。所述條件培養(yǎng)基還可以被用作化妝護(hù)膚產(chǎn)物中的補(bǔ)充物，以促進(jìn)皮膚修復(fù)和愈合。測(cè)試這類(lèi)條件培養(yǎng)基對(duì)皮膚疾病的效カ的合適動(dòng)物模型有小鼠皮炎模型。小鼠真皮致敏如早前的描述進(jìn)行[A72，A73]。簡(jiǎn)而言之，將溶于100uIPBS中50yg的Blot5或僅PBS應(yīng)用于Icm2線(xiàn)網(wǎng)(gauze)并以透明敷料(SmithNephew)貼于所述皮膚。經(jīng)50天的時(shí)長(zhǎng)重復(fù)該步驟兩次。然后，將CM和NCM應(yīng)用于Icm2線(xiàn)網(wǎng)并如上所述貼于所述皮膚，持續(xù)不同的時(shí)長(zhǎng)。為了對(duì)皮膚炎癥進(jìn)行組織檢查，從所述貼片的皮膚獲得樣本并立即在10%緩沖的中性福爾馬林中固定。哮喘和變態(tài)反應(yīng)由通過(guò)本文中所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)。哮喘是具有等同復(fù)雜的病因?qū)W的復(fù)雜疾病，由表征很少的一組遺傳和環(huán)境因子引起。所導(dǎo)致的病狀是導(dǎo)致氣道的慢性炎癥和上皮下纖維化的免疫失調(diào)，以平滑肌量増加和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增加以及隨后肺功能降低為特征?，F(xiàn)在的治療包括調(diào)整多個(gè)因子或信號(hào)傳導(dǎo)通路，例如所述ECM、整聯(lián)蛋白和間充質(zhì)細(xì)胞功能[A74],toll樣受體[A75]、生長(zhǎng)因子例如TGF-^和EGF[A76,A77]和所述IL6通路[A78]。hESC-MSC的CM已經(jīng)被預(yù)測(cè)對(duì)這些靶區(qū)域具有生物學(xué)效應(yīng)，本發(fā)明人預(yù)測(cè)所述CM可幫助恢復(fù)哮喘肺中的免疫調(diào)節(jié)，并促進(jìn)組織修復(fù)并使肺組織瘢痕形成最小化。為了研究這類(lèi)條件培養(yǎng)基(CM)和所述非條件培養(yǎng)基(NCM)對(duì)慢性氣道炎癥和氣道的效應(yīng)，如上文所述進(jìn)行小鼠的皮內(nèi)致敏[A72，A73]。在50天后，將所述貼片的小鼠麻酔，并連續(xù)三天使之接受以50yg的Blot5進(jìn)行的鼻內(nèi)激發(fā)。最后ー劑后24小時(shí)，使用侵入性BUXC0[A79]進(jìn)行測(cè)量氣道高反應(yīng)性(AHR)。將所述小鼠麻酔，并連續(xù)三天經(jīng)鼻內(nèi)給予條件培養(yǎng)基或非條件培養(yǎng)基。最后ー劑后24小時(shí)，測(cè)量氣道高反應(yīng)性(AHR)。再過(guò)24小時(shí)后收集BAL流體。在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗收集后，將肺以10%的中性福爾馬林固定。為了研究CM和所述NCM對(duì)急性氣道炎癥和氣道的效應(yīng)。分泌高水平IL-4、IL-5、IL_13并具有不可檢測(cè)水平的IFN-y的Blott5特異性Th2細(xì)胞系可以用于建立小鼠變態(tài)反應(yīng)模型。簡(jiǎn)而言之，將對(duì)首次接受試驗(yàn)的小鼠(naivemice)的致敏是通過(guò)在每只小鼠中經(jīng)靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移2.5x106B1ot5特異性Th2細(xì)胞進(jìn)行。將這些小鼠麻酔，并連續(xù)三天以50Ug的Blot5進(jìn)行鼻內(nèi)(IN)激發(fā)。最后一次IN激發(fā)后24小時(shí)，使用侵入性BUXCO[A79]進(jìn)行測(cè)量氣道高反應(yīng)性(AHR)。然后，將所述小鼠麻酔，并連續(xù)三天鼻內(nèi)給予CM或NCM。在最后一次Blot5激發(fā)后48小時(shí)收集BAL流體。在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗收集后，將肺以10%的中性福爾馬林固定用于組織病理學(xué)分析。在臨床實(shí)踐中，使用CM來(lái)治療肺病時(shí)可以使用標(biāo)準(zhǔn)氣溶膠療法[A80-86]有效地給予。其他疾病由通過(guò)本文所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以用于治療其他疾病。通常，本發(fā)明人預(yù)計(jì)，這類(lèi)條件培養(yǎng)基可用于在這樣的病理病癥中恢復(fù)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)組織修復(fù)，所述病理病癥即其中初始損傷的誘導(dǎo)炎癥和免疫功能失調(diào)可導(dǎo)致慢性組織重塑，包括纖維化和功能喪失。其他疾病包括腎局部缺血性損傷、囊性纖維化病、鼻竇炎和鼻炎。矯形外科由通過(guò)本文所述方法獲得的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基可以用于治療矯形病癥?，F(xiàn)行用于修復(fù)肌肉骨骼組織的治療策略經(jīng)常包括使用生物材料(陶瓷或聚合物)，以不僅提供機(jī)械支持而且作為支架來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘著、増殖和分化以起始血管生成和最終新骨形成[A87-90]?；趯?duì)這類(lèi)條件培養(yǎng)基的計(jì)算分析，將CM整合進(jìn)入所述支架設(shè)計(jì)可以增強(qiáng)所述支架的細(xì)胞遷移、増殖、粘著、骨骼分化和血管生成。為了測(cè)試CM對(duì)將另外導(dǎo)致萎縮性不愈合的缺陷中骨再生的效應(yīng)，使NewZealand白兔在ー個(gè)半徑接受15-mm臨界大小的缺陷[A91]，其充以合適的基質(zhì)例如被CM或NCM涂覆的膠原綿狀物或水凝膠。每3周獲得放射照片。在6或12周后，將動(dòng)物殺死。通過(guò)microCT掃描測(cè)量新骨，并且通過(guò)使用抗CD31的抗體染色在所述植入物中的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)測(cè)量維管狀態(tài)。至少在初期(atleastinitially)應(yīng)存在増加的維管狀態(tài)，并且增加的新骨形成。為了測(cè)試CM對(duì)軟骨修復(fù)的效應(yīng)，使用了兔的骨軟骨損傷模型[A92]。將CM涂覆于合適的支架上例如膠原和水凝膠，并植入3-mm的骨軟骨膝缺陷[A93]。對(duì)于臨床應(yīng)用，可以通過(guò)將所述CM整合進(jìn)入已有支架或骨移植物中而使用CM[A94]。骨髄移植MSC已被證明可增強(qiáng)骨髄移植[A95]，減輕移植物抗宿主疾病。MSC的移植已被證明通過(guò)促進(jìn)造血的移植物移入[A96]并限制GVHD[A97，A98]改善同種異體移植的結(jié)果?，F(xiàn)在認(rèn)為，MSC通過(guò)增強(qiáng)所述造血干細(xì)胞環(huán)境[A99]和誘導(dǎo)耐受介導(dǎo)這些效應(yīng)，并降低GVHD、同種異體組織移植排斥和炎癥調(diào)節(jié)[A98]，有可能通過(guò)分泌可溶性因子[A100]。MSC的這類(lèi)條件培養(yǎng)基的可能臨床應(yīng)用通過(guò)在培養(yǎng)基中添加CM在體外或者通過(guò)在移植過(guò)程中注入具有造血干細(xì)胞的CM在體內(nèi)而擴(kuò)增造血干細(xì)胞群，通過(guò)靜脈注入CM減輕GVHD，或者通過(guò)靜脈注入CM作為移植治療前和后的一部分誘導(dǎo)對(duì)所移植的細(xì)胞或組織的免疫耐受。心臟病本文描述的轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以用于治療或預(yù)防心臟病。心臟病是影響心臟的多種不同疾病的總括性術(shù)語(yǔ)。到2007年為止，它是美國(guó)、英格蘭、加拿大和威爾士的第一死亡原因，僅在美國(guó)就34秒死亡一人。心臟病包括如下的任ー種。冠心病冠狀動(dòng)脈疾病是動(dòng)脈粥樣化斑在供應(yīng)心肌膜的動(dòng)脈壁中積聚引起的動(dòng)脈疾病。心絞痛(胸痛)和心肌梗塞(心臟病發(fā)作)是冠心病引起的癥狀和病癥。每年有超過(guò)459，000名美國(guó)人死于冠心病。在英國(guó)，每年有101，000死亡病例是由于冠心病。心肌病心肌病是由任何原因引起的心肌膜(即實(shí)際的心肌)的功能衰退?；加行募〔〉娜私?jīng)常有心律失常和/或突然心源性死亡的風(fēng)險(xiǎn)。其中主病理學(xué)在心肌膜本身以外的外部心肌病-心肌病包括大部分的心肌病。到目前為止，心肌病的最常見(jiàn)誘因是缺血。世界衛(wèi)生組織包括具體的心肌病酗酒心肌病、冠心病、先天性心臟病、影響心臟的營(yíng)養(yǎng)病、缺血性(或缺血)心肌病、高血壓心肌病、心瓣膜心肌病、炎癥性心肌病。還包括繼發(fā)于全身代謝病的心肌病內(nèi)在心肌病(并非由于可識(shí)別的外部原因引起的心臟的肌肉虛弱)擴(kuò)張性心肌病(DCM，最常見(jiàn)形式，心臟移植的主要指征之一。在DCM中，心臟(特別是左心室)擴(kuò)大并且泵功能減小)肥大性心肌病(HCM或H0CM，由編碼肌節(jié)蛋白的基因中的多種突變導(dǎo)致的遺傳病。在HCM中，心肌增厚，這可能阻塞血流并阻礙心臟正常發(fā)揮功能)，致心律失常性右心室心肌病(ARVC，其起因于對(duì)其中心肌被纖維性疤組織替代的心臟的電干擾。右心室通常受影響最大)限制性心肌病(RCM，其是最少見(jiàn)心肌病。心室的壁僵硬，但可能不增厚，阻止正常的心臟充血)。致密化不全心肌病-從出生開(kāi)始左心室就不能正常生長(zhǎng)，在超聲心動(dòng)圖中觀察到其具有海綿狀表象。心血管疾病心血管疾病是影響心臟本身和/或血管系統(tǒng)(特別是通向心臟和從心臟伸出的靜脈和動(dòng)脈)的許多具體疾病之一。對(duì)疾病ニ態(tài)性的研究表明，患心血管疾病的女性通常具有影響血管的形式，而男性通常具有影響心肌本身的形式。心血管疾病的已知或相關(guān)原因包括糖尿病、高血壓、高同型半胱氨酸血癥和血膽脂醇過(guò)多。心血管疾病的類(lèi)型包括動(dòng)脈粥樣硬化。缺血性心臟病缺血性心臟病是心臟本身的疾病，以向器官的血液供應(yīng)減少為特征。這出現(xiàn)在供應(yīng)氧和營(yíng)養(yǎng)物的動(dòng)脈停下來(lái)時(shí)，心臟將得不到足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)物并將最終停止跳動(dòng)。心カ衰竭心カ衰竭也稱(chēng)為充血性心カ衰竭(或CHF)和充血性心臟衰竭(CCF)，是ー種可能由損害心臟充盈或泵送足夠量的血液至全身的能力的任何結(jié)構(gòu)或功能性心臟疾病引起的病癥。肺源性心臟病是心臟右側(cè)的衰竭。高血壓心臟病高血壓心臟病是由高血壓(特別是局部高血壓)引起的心臟病?？捎筛哐獕盒呐K病導(dǎo)致的病癥包括左心室肥大、冠心病、(充血性)心カ衰竭、高血壓心肌病、心律失常、炎性心臟病等。炎性心臟病涉及心肌和/或其周?chē)M織的炎癥。心內(nèi)膜炎包括心臟內(nèi)層——心內(nèi)膜——的炎癥。所涉及的最常見(jiàn)結(jié)構(gòu)為心臟瓣膜。炎性心臟擴(kuò)大癥。心肌炎包括心肌膜——心臟的肌肉部分——的炎癥。瓣膜性心臟病瓣膜性心臟病是影響ー個(gè)或多個(gè)心臟瓣膜的疾病過(guò)程。心臟右側(cè)的瓣膜是三尖瓣和肺動(dòng)脈瓣。心臟左側(cè)的瓣膜是ニ尖瓣和主動(dòng)脈瓣。包括主動(dòng)脈瓣狹窄、ニ尖瓣脫垂和瓣膜性心肌病。[上述文字修改自Heartdisease.(2009,February3).InWik-ipedia,theFreeEncyclopedia.Retrieved06:33,February20,2009,fromhttp://en.wikipedia.org/w/index.phptitle=Heart_disease&oldid=268290924]前體miRNA/成熟miRNA的比例在實(shí)施例中，本發(fā)明人還證明前體與成熟miRNA的比例變化取決于所述細(xì)胞狀態(tài)。因此，本發(fā)明人命名為“前體miRNA/成熟miRNA的比例”的該比例可以用作監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記物。所述實(shí)施例通過(guò)使用定量RT-PCR(qRT-PCR)分析顯示，由來(lái)源自人胚胎干細(xì)胞(hESC)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分泌的外核體包含miRNA。這類(lèi)miRNA主要以前體(前)-miRNA的形式存在，同時(shí)不具有可檢測(cè)的原始(原)miRNA的水平。因此，外核體中hsa-let-7b(miRBase登錄號(hào)MI0000063)和hsa_let_7g(miRBase登錄號(hào)MI0000433)的前體miRNA與成熟miRNA的比例分別是所述細(xì)胞中的169倍和1078倍。在實(shí)施例中，本發(fā)明人證明，以c-myc基因轉(zhuǎn)化的MSC不衰老，持續(xù)增殖并保持高水平的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明人使用實(shí)時(shí)RT-PCR分析證明，相對(duì)于親本MSC的分泌物，hsa-let-7bmiRNA(miRBase登錄號(hào)MI0000063)的myc-轉(zhuǎn)化的MSC分泌物中前體miRNA與成熟miRNA的比例增加至2.8倍。在另一方面,hsa-let_7gmiRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例不因轉(zhuǎn)化而變化。hsa_let_7b在本文他處有詳述。因此，以癌基因轉(zhuǎn)化MSC可導(dǎo)致所述細(xì)胞顯示致癌狀態(tài)；在這類(lèi)致癌狀態(tài)下，相對(duì)于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中前體與成熟hsa-let-7bmiRNA(miRBase登錄號(hào)MI0000063)的比例，前體與成熟hsa_let_7bmiRNA的比例增加。因此，前體與成熟hsa_let_7bmiRNAmiRNA的比例可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞的致癌狀態(tài)。還觀察到其他miRNA種類(lèi)的前體與成熟miRNA的比例因?yàn)檗D(zhuǎn)化而變化。因此，可以使用這些其他miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例替代hsa-let_7bmiRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例或者與其共同使用，作為致癌轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ー些miRNA種類(lèi)的前體與成熟miRNA的比例隨細(xì)胞狀態(tài)的變化而變化，所述細(xì)胞狀態(tài)的變化例如生理狀態(tài)的變化或病理狀態(tài)的變化或者在生理狀態(tài)與病理狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。因此，細(xì)胞狀態(tài)的變化可以通過(guò)監(jiān)測(cè)這些miRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本發(fā)明人描述了ー種監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的方法，所述方法包括對(duì)由所述細(xì)胞分泌的所選microRNA(miRNA)種類(lèi)建立(a)所述miRNA種類(lèi)的前體形式(前體miRNA);與(b)所述miRNA種類(lèi)的成熟形式(成熟miRNA)的比例，其中如此建立的前體miRNA與成熟miRNA的比例指示所述細(xì)胞的狀態(tài)。所述細(xì)胞可以包括在細(xì)胞塊、組織、器官或生物體中。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以指示所述各個(gè)細(xì)胞塊、組織、器官或生物體的狀態(tài)。所述miRNA種類(lèi)可以包括在由所述細(xì)胞分泌的外核體中。所述方法可以包括獲得這類(lèi)外核體，并獲得來(lái)自這類(lèi)外核體的前體和成熟形式的miRNA種類(lèi)。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以通過(guò)雜交于包含核酸序列的陣列建立，所述核酸序列能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的miRNA種類(lèi)。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)建立。所述方法可以包括建立包含多個(gè)所選擇的miRNA種類(lèi)的多個(gè)前體miRNA與成熟miRNA的比例的譜，每個(gè)均指示所述細(xì)胞的狀態(tài)。所述方法可以包括建立包含多個(gè)所選擇的miRNA種類(lèi)的多個(gè)前體miRNA與成熟miRNA的比例的譜，所述譜是通過(guò)雜交于包含多個(gè)探針的陣列建立，所述探針能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的所選miRNA種類(lèi)。所述外核體可以從生物體樣品獲得，所述生物體包括細(xì)胞。所述樣品可以包括血液樣品、血清樣品、唾液樣品或尿液樣品。所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括生理狀態(tài)，例如細(xì)胞周期狀態(tài)、分化狀態(tài)、發(fā)育狀態(tài)或代謝狀態(tài)。所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括病理狀態(tài)，例如疾病狀態(tài)、人疾病狀態(tài)、糖尿病狀態(tài)、免疫疾病狀態(tài)、神經(jīng)變性疾病狀態(tài)、致癌狀態(tài)、癌性狀態(tài)或腫瘤狀態(tài)。本發(fā)明人還描述了ー種上文示出用于檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)變化的方法，所述方法包括檢測(cè)所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例的變化(或包含這類(lèi)比例的譜)，其中這類(lèi)變化指示所述細(xì)胞狀態(tài)的變化。本發(fā)明人還描述了ー種上文示出用于確立細(xì)胞處于具體狀態(tài)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)與已知處于該具體狀態(tài)的細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)進(jìn)行比較。本發(fā)明人還描述了一種監(jiān)測(cè)生物體的狀態(tài)的方法，所述方法包括從所述生物體獲得樣品，對(duì)所述樣品進(jìn)行上文示出的方法，根據(jù)如此獲得的前體miRNA與成熟miRNA的比例確立所述生物體的狀態(tài)。本發(fā)明人還描述了一種檢測(cè)生物體的疾病的方法，所述方法包括從該生物體獲得樣品或獲得該生物體的樣品，對(duì)所述樣品進(jìn)行上文示出的方法，并且將如此獲得的前體miRNA與成熟miRNA的比例與疾病生物體的已知樣品或來(lái)自疾病生物體的已知樣品的前體miRNA與成熟miRNA的比例進(jìn)行比較。本發(fā)明人還描述了一種治療或預(yù)防生物體的疾病的方法，所述方法包括檢測(cè)權(quán)利要求14的生物體的疾病，并將用于該疾病的治療給予所述生物體。所述細(xì)胞可以包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括未轉(zhuǎn)化的狀態(tài)和轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，例如c-myc轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。所述microRNA可以包括hsa-let-7bmicroRNA。轉(zhuǎn)化的狀態(tài)的比值與正常狀態(tài)相比可以高2.8。上述的任意組合都是可能的。本發(fā)明人還描述了包含多個(gè)核酸序列的陣列，所述核酸序列能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的多個(gè)miRNA種類(lèi)。HSA-LET-7Bhsa-let-7b具有miRBASE登記號(hào)MI0000063。前體hsa_let_7b具有如下序列>hsa_let_7bMI0000063CGGG⑶GAG⑶A⑶AG⑶腳⑶G⑶UUCAGGGCA⑶GA腳UGCC(XUCGGAAGAUAA(UAUACAACCUACUGCCUUCCCUG前體hsa-let_7b具有如下結(jié)構(gòu)uucaaggcagugauqcgggggagguaguagguugugugguuugucccuuccgucauccaacauaucaau-uagaaggcuccccg成熟hsa-let_7b具有miRBase登記號(hào)MIMAT0000063和如下序列>hsa_let_7bMIMAT0000063UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUhsa_let_7b詳細(xì)記載于如下出版物中"IdentificationoinovelgenescodingforsmallexpressedRNAs"Lagos-QuintanaM,RauhutR,LendeckelW,TuschlT.Science.294853-858(2001)；"ReducedaccumulationofspecificmicroRNAsincolorectalneoplasia"MichaelMZ,0'ConnorSM,vanHolstPellekaanNG,YoungGP,JamesRJ.MolCancerRes.I:882-891(2003)；"AlteredexpressionprofilesofmicroRNAsduringTPA-induceddifferentiationofHL_60cells"KasashimaK,NakamuraY,KozuT.BiochemBiophysResCommun.322:403-410(2004)；"AmammalianmicroRNAexpressionatlasbasedonsmallRNAlibrarysequencing"LandgrafP,RusuM,SheridanR,SewerA,IovinoN,AravinA,PfefferS,RiceA,KamphorstA0,LandthalerM,LinC,SocciND,HermidaL,FulciV,ChiarettiS,FoaR,SchliwkaJ,FuchsU,NovoselA,MullerRU,SchermerB,BisselsU,InmanJ,PhanQ,ChienM.Cell.1291401-1414(2007)and〃PatternsofknownandnovelsmallRNAsinhumancervicalcancer"LuiWO,PourmandN,PattersonBK,FireA.CancerRes.67:6031-6043(2007).細(xì)胞狀態(tài)的變化根據(jù)本文所述方法和組合物，所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于監(jiān)測(cè)多種細(xì)胞狀態(tài)的變化。這類(lèi)細(xì)胞狀態(tài)的變化可以包括生理狀態(tài)(例如細(xì)胞周期狀態(tài))的變化。因此，監(jiān)測(cè)miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞的Gl狀態(tài)、M狀態(tài)、G2狀態(tài)或S狀態(tài)。所述生理狀態(tài)可以包括分化狀態(tài)；換句話(huà)說(shuō)，miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于確定細(xì)胞是分化的或未分化的。這可以用于例如檢測(cè)細(xì)胞的多能性。例如，這可以用于檢測(cè)細(xì)胞是否是干細(xì)胞，或者細(xì)胞是否是分化細(xì)胞或者細(xì)胞是否是終末分化的。所述生理狀態(tài)可以包括發(fā)育狀態(tài)或發(fā)育階段。因此，miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于確定細(xì)胞是否是胚胎狀態(tài)或階段、胎兒狀態(tài)或階段、新生兒狀態(tài)或階段、嬰兒狀態(tài)或階段、幼年?duì)顟B(tài)或階段、學(xué)步期狀態(tài)或階段、青春期狀態(tài)或階段、成年?duì)顟B(tài)或階段等。監(jiān)測(cè)病理狀態(tài)所述細(xì)胞狀態(tài)可以包括病理狀態(tài)，例如疾病狀態(tài)。因此，miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞的病理狀態(tài)或者正常狀態(tài)向病理狀態(tài)的改變。所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于檢測(cè)細(xì)胞是處于正常(未患病)狀態(tài)或患病狀態(tài)。這可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞從正常未患病狀態(tài)向患病狀態(tài)的發(fā)展。這可以用于監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述疾病可以包括生物體患有或可能患有的多種疾病的任ー種。通常，所述疾病狀態(tài)可以包括肥大性心肌病、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、無(wú)腦回、肌萎縮側(cè)索硬化、頭暈、法洛四聯(lián)癥、心肌炎、酒精中毒、貧血、臂叢神經(jīng)病變、痔瘡、先天性心臟缺損、斑禿、錸狀細(xì)胞貧血、ニ尖瓣脫垂、植物神經(jīng)系統(tǒng)疾病、異常、阿爾茨海默病、心絞痛、直腸疾病或致心律失常性右室發(fā)育異常的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括心室發(fā)育異常、痤瘡酒渣鼻、弱視、強(qiáng)直性脊柱炎、房顫、心臟壓塞、獲得性免疫缺陷綜合征、淀粉樣變、食欲缺乏、焦慮、孤獨(dú)癥、腦腫瘤、中央神經(jīng)系統(tǒng)疾病、色覺(jué)缺陷、動(dòng)脈硬化、背痛、乳腺疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、結(jié)腸直腸腫瘤、關(guān)節(jié)炎、白塞氏綜合征、乳腺腫瘤、大腦性癱瘓、感冒、哮喘、雙相型障礙、燒傷或?qū)m頸腫瘤的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括溝通障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、失明、念珠菌病、腓骨肌萎縮病(charcot-mariedisease)、克羅恩病、注意力缺陷障礙、腦損傷、白內(nèi)障、潰瘍性結(jié)腸炎、累積性創(chuàng)傷失調(diào)、囊性纖維化病、發(fā)育殘疾、進(jìn)食障礙、丹毒、纖維肌痛、褥瘡、糖尿病、肺氣腫、大腸桿菌感染、毛囊炎、吞咽障礙、糖尿病足或腦炎的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括食管疾病、食物超敏反應(yīng)、癡呆、唐氏綜合征、日本腦炎、眼腫瘤、食物中毒、登革熱、誦讀困難、子宮內(nèi)膜異位癥、法布里病、胃腸炎、抑郁癥、張カ失常、癲癇、慢性疲乏綜合征、胃食管反流、高歇氏病、血液病、希爾施普龍病、腦積水、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、齦炎、血友病、組織細(xì)胞增生癥、多汗癥、低血糖、青光眼、肝炎和hiv感染的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括高草酸尿、甲狀腺功能減退癥、糖原累積病、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒒羝娼鸩?、超敏感性、免疫缺陷綜合癥、頭痛、疝、心手綜合征、高血壓、陽(yáng)痿、充血性心力衰竭、生殖器皰疹、亨廷頓氏病、肺動(dòng)脈高壓、失禁、不育、白血球過(guò)多癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、足分支菌病、智力低下、炎癥、肝腫瘤、萊姆病、瘧疾或先天性代謝缺陷的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括炎性腸病、長(zhǎng)QT綜合征、淋巴管肌瘤病、麻疹、偏頭痛、流行性感冒、腰背痛、淋巴水腫、黑色素瘤、口腔異常、乳膠變態(tài)反應(yīng)、阻塞性肺病、淋巴瘤、腦膜炎、粘多糖貯積癥或麻風(fēng)病的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括肺腫瘤、黃斑變性、絕經(jīng)期、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮癥、肌筋膜疼痛綜合征、骨性關(guān)節(jié)炎、胰腺腫瘤、消化性潰瘍、重癥肌無(wú)力、惡心、骨質(zhì)疏松癥、恐慌癥、波斯灣綜合征、骨髄瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、中耳炎、截癱、苯丙酮尿癥、骨髓增生病、眼震、卵巢腫瘤或帕金森病的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括嗜鉻細(xì)胞瘤、心肌病、機(jī)會(huì)性感染、疼痛、扁平部睫狀體炎、恐怖障礙、心肌梗塞、遺傳性視神經(jīng)萎縮、胰腺疾病、虱病、鼠疫、毒漆藤皮炎、朊病毒疾病、反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良癥、精神分裂癥、羞怯、脊髓灰質(zhì)炎、前列腺病、呼吸道病、硬皮病、干燥綜合征或風(fēng)濕性多肌痛的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括前列腺腫瘤、多動(dòng)腿、脊柱側(cè)凸、皮膚病、脊髄灰質(zhì)炎后綜合征、銀屑病、視網(wǎng)膜疾病、壞血病、皮膚腫瘤、癌前病癥、狂犬病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、性功能障礙、睡眠障礙、妊娠、罕見(jiàn)疾病、結(jié)節(jié)病、性傳播疾病、痙攣性斜頸或脊髄損傷的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括ロ吃、睪丸腫瘤、拔毛狂、尿路感染、脊柱裂病、物質(zhì)相關(guān)性障礙、地中海貧血癥、三叉神經(jīng)痛、泌尿生殖器疾病、脊髄小腦變性、嬰兒猝死、血栓形成、結(jié)核病、血管疾病、斜視、自殺、耳鳴、結(jié)節(jié)性硬化癥、病毒病、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、脊髄空洞癥、抽動(dòng)移1語(yǔ)綜合征(tourettesyndrome)、特納氏綜合征(turner’ssyndrome)或視カ障礙的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括心理應(yīng)激、顳下頜關(guān)節(jié)功能障礙綜合征、沙眼、尿失禁、嘔吐、馮維勒布蘭德的病、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良癥、細(xì)菌感染、消化系統(tǒng)腫瘤、骨腫瘤、外陰病、異位妊娠、蜱傳疾病、馬方綜合征、老化、威廉斯綜合征、血管發(fā)生因子、蕁麻疹、敗血癥、吸收不良綜合征或傷口和損傷的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括腦血管意外、多個(gè)化學(xué)敏感性、頭暈、腎積水、黃熱病、神經(jīng)性關(guān)節(jié)病、肝細(xì)胞癌、多形性腺瘤、法特壺腹、麥克爾憩室(Meckel'sdiverticulum)、圓錐角膜、皮膚瘰粒、有害建筑綜合征、泌尿系統(tǒng)疾病、缺血性視神經(jīng)病變、膽總管結(jié)石、耳鼻喉病、上腔靜脈綜合征、鼻竇炎、橈骨骨折、畸形性骨炎、滋養(yǎng)層腫瘤、軟骨肉瘤或閱讀和頸動(dòng)脈狹窄的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括靜脈曲張、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、膽囊疾病、關(guān)節(jié)替換、白癜風(fēng)、鼻疾病、環(huán)境病、巨結(jié)腸、肺炎、前庭病、隱球菌病、帯狀皰疹、輸卵管腫瘤、感染、心律失常、葡萄糖耐受不良、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、疥瘡的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括酒精性肝炎、寄生蟲(chóng)病、輸卵管炎、隱球菌性腦膜炎、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、悲傷、結(jié)石、色素痣、直腸腫瘤、真菌病、血管瘤、結(jié)腸腫瘤、維生素A過(guò)多癥、腎鈣沉著癥、腎腫瘤、維生素、類(lèi)癌腫瘤、乳糜瀉、腦下垂體病、腦死亡、膽道病或前列腺炎的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括醫(yī)源性疾病、胃腸出血、腺癌、中毒性巨結(jié)腸、截肢者、脂溢性角化病、骨髄炎、巴雷特食管、出血、胃腫瘤、水痘、膽嚢炎或軟骨瘤的任ー種或多種。所述疾病狀態(tài)可以包括細(xì)菌感染和真菌病、甲狀旁腺腫瘤、精索扭轉(zhuǎn)、腺瘤、扁平苔蘚、肛腺腫瘤、脂肪瘤、足癬、酒精性肝病、神經(jīng)纖維瘤病、淋巴疾病、老人虐待、濕疹、憩室炎、癌、胰腺炎、阿米巴病、妊娠并發(fā)癥、腎盂腎炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥或動(dòng)脈瘤的任一種或多種。具體而言，所述疾病狀態(tài)可以包括疾病例如糖尿病、免疫病癥、神經(jīng)變性病癥或者癌癥或腫瘤。因此，所述前體miRNA與成熟miRNA的比例可以用于監(jiān)測(cè)患有或者傾向于患有上文所列任一疾病的生物體的細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)。應(yīng)了解，細(xì)胞可以包括在組織、組織塊、器官或生物體中。在該情形下，所述前體與成熟miRNA的比例除了可以用于確定細(xì)胞狀態(tài)外，還可以用于確定其中包含所述細(xì)胞的組織、組織塊、器官或生物體的狀態(tài)。外核體外核體是直徑30-100nm的分泌的微粒，最初發(fā)現(xiàn)由網(wǎng)狀細(xì)胞釋放(1A)。它們實(shí)質(zhì)上是包含蛋白和RNA的磷脂囊泡?，F(xiàn)在已知外核體由許多細(xì)胞類(lèi)型分泌，包括血液來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型(B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和血小板)和非血血液來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型(腸上皮細(xì)胞、Schwann細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系(它們包括鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、間皮瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、卵巣癌細(xì)胞))以及精子((2A)綜述)。然而，對(duì)它們的功能仍然知道的很少。最近的研究已表明，它們可能在健康和疾病(例如腫瘤轉(zhuǎn)移)中、在抗原呈遞中以及在傳染劑傳送中發(fā)揮作用(3A，4A)。外核體的生物發(fā)生是通過(guò)多種高度調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程進(jìn)行，包括通過(guò)良好表征的ESCRT(轉(zhuǎn)運(yùn)需要的內(nèi)體分選復(fù)合體)-介導(dǎo)的對(duì)貨物的側(cè)分離和內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽(5A)在內(nèi)體多泡體(MVB)中形成管腔內(nèi)囊泡。由于這樣的高度調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程通常對(duì)細(xì)胞的生理或病理狀態(tài)變化敏感，因此可以想象外核體的生物發(fā)生還將連帶受到影響，并且這些影響將表現(xiàn)在所述外核體的數(shù)量或組成上。通常認(rèn)為，我們身體中細(xì)胞分泌的至少部分外核體會(huì)釋放至循環(huán)系統(tǒng)中。實(shí)際上，在容易獲得的體液(例如血液和尿液)中的外核體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)起源于許多細(xì)胞類(lèi)型(2A)，并且已經(jīng)證明，腫瘤患者中循環(huán)系統(tǒng)的外核體和腫瘤來(lái)源的microRNA是類(lèi)似的(6A)?？傊@些特征使得循環(huán)系統(tǒng)的外核體是鑒定生物標(biāo)記物的理想靶(7A)。由于外核體攜帶蛋白質(zhì)和RNA負(fù)載，體液(例如尿液和血液)中的外核體蛋白和RNA都被評(píng)估為疾病的生物標(biāo)記物(7A)。尿的外核體的蛋白組學(xué)已經(jīng)對(duì)可能的生物標(biāo)記物作譜(8A-11A)。外核體胎球蛋白A已經(jīng)被鑒定為用于檢測(cè)急性腎損傷的新型尿生物標(biāo)記物(12A)。生物樣品本文所述方法和組合物涉及細(xì)胞分泌的前體與成熟miRNA的比例，目的是監(jiān)測(cè)其狀態(tài)。方便地，所述比例可以通過(guò)取包含所述細(xì)胞的分泌物的生物樣品進(jìn)行確定。如果所述細(xì)胞包括在生物體中，則所述樣品可以包括任何數(shù)目的物質(zhì)，包括但不限于基本上任何生物體的體液(包括但不限于血液、鼻咽分泌物、尿液、血清、淋巴、唾液、直腸和陰道分泌物、汗液和精液)。制備外核體外核體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法制備。通常，可以將包含細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)基在IOOOrpm下離心。然后，將上清液相對(duì)IOOOkDa截留分子量的超濾膜濃縮。替代地或者另外地，美國(guó)專(zhuān)利6，899，863描述了ー種使用柱色譜法制備膜載體(例如外核體)的方法。外核體還可以使用Szeetal(17A)中所述的技術(shù)制備。該方案可以簡(jiǎn)單地總結(jié)如下為了收獲MSC分泌物，將80%的匯合的HuES9.EI培養(yǎng)物以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，轉(zhuǎn)移至化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)夜孵育，以PBS洗滌并在新鮮配制的化學(xué)成分確定無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天。收集包含MSC分泌物的所述條件培養(yǎng)基，通過(guò)離心澄清，使用100-kDaMW截留的超濾膜(Satorius)濃縮50倍并通過(guò)過(guò)濾通過(guò)220_nm濾器滅菌。對(duì)用于分離和制備外核體的方法的更詳細(xì)描述在本文他處給出。制備miRNAmiRNA可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式的任ー種從由細(xì)胞分泌物收集的外核體制備。制備miRNA的示例性方案如下通過(guò)將三倍體積的TrizolLS(Invitrogen)加入到一倍體積的條件培養(yǎng)基并依照制造商的方案完成提取，從條件培養(yǎng)基分離RNA?？俁NA和小RNA分別使用Trizol(Invitrogen)和mirVanamiRNAIsolationKit(AppliedBiosystems)純化。RNA是使用Quant-iTTMRiboGreenRNAAssayKit(Invitrogen)純化并在含8%こニ醒或15%NovexTris-borate-EDTA(TBE)-脲凝膠(Invitrogen)的I.5%瓊脂糖凝膠上分離。在所述凝膠中的分離RNA是通過(guò)溴化こ啶(EB)染色來(lái)顯示。替代地或者另外地，將條件培養(yǎng)基以等體積的PBS、細(xì)胞裂解緩沖液(Biovision)、40mM環(huán)糊精(Sigma-Aldrich)或4000U/ml憐酸酯酶A2(Sigma-Aldrich)在37°C下預(yù)孵育30分鐘，然后加入十分之一體積的1-mg/mlRNaseA(Roche)。然后，將這些混合物在37°C下再孵育5分鐘。以TrizolLS提取RNA，并在TBE-脲凝膠上分離，然后進(jìn)行EB染色。前體miRNA和成熟miRNA的定量實(shí)施例詳細(xì)描述了制備和分離miRNA的方案，所述miRNA可以與本文所述方法和組合物的ー塊使用。用于本文所述方法和組合物的miRNA還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量方法制備。例如，可以使用測(cè)序、RNA印跡雜交、改良的Invader測(cè)定法、實(shí)時(shí)PCR、環(huán)狀引物RT-PCR和陣列雜交等檢測(cè)和定量microRNA。這些技術(shù)在下文有更詳細(xì)描述?？梢詫?duì)樣品中microRNA進(jìn)行測(cè)序，以鑒定并定量地解碼樣品中全部的microRNA。這類(lèi)服務(wù)由例如LCSciences(www.lcsciences.com)提供。RNA印跡雜交已經(jīng)被用于檢測(cè)和定量miRNA，如L.etal.2003.Genes&Development17:991-1008中所述。或者，RNA酶保護(hù)可以用于該目的。用于RNA酶保護(hù)和RNA印跡雜交的探針可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式制備。試齊Li盒例如mirVanamiRNAProbeConstructionKitAM1550(CataloguenumberAM1550,Ambion,Ap-pliedBiosystems,Austin,Texas,USA)可用于該目的。Allawi1H.T.etal.2004.RNA10:1153-1161所述的改良的Invader測(cè)定法還可以用于檢測(cè)和定量miRNA。所述改良的Invader測(cè)定法是定量、敏感且快速的miRNA測(cè)定法，可以成功用于分析miRNA，使用少至50-100ng的總細(xì)胞RNA或少至1，000個(gè)裂解細(xì)胞。該測(cè)定法能夠區(qū)分具有單核苷酸差異的miRNA以及前體和成熟miRNA。可以在未分級(jí)分離的洗滌劑裂解物中進(jìn)行的InvadermiRNA測(cè)定法在微量滴定板中使用熒光檢測(cè)，并且僅需要2-3小時(shí)的孵育時(shí)間，使得可以在高通量篩查分析中平行分析多個(gè)樣品。對(duì)前體miRNA和成熟miRNA的檢測(cè)和定量還可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法(例如美國(guó)專(zhuān)利7，601，495(Chen)中描述的方法)實(shí)現(xiàn)。再者，實(shí)施例詳細(xì)描述了用于檢測(cè)和定量成熟和前體miRNA的方案，其可以與本文描述的方法和組合物ー塊使用。美國(guó)專(zhuān)利7，601,495(Chen)的方法適合用于成熟miRNA。用于檢測(cè)和定量前體和成熟miRNA的大量試劑盒是可以市購(gòu)的，也可以使用這些試劑盒。這類(lèi)試劑盒的實(shí)例有mirPremiermi-croRNAIsolationKit(CataloguenumbersSNClO和SNC50,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)?？梢杂糜诜蛛x和制備miRNA的另一試劑盒是RNAqueous㊣-MicroKitCCatalogueNoAM1931,Am-bion,AppliedBiosystems,Austin,Texas,USA)。例如，miRNA檢測(cè)和定量可以使用miRCURYLNAUniversalRTmicroRNAPCR(Exiqon)進(jìn)行。它包括即用型板，包含在384孔PCR板中的預(yù)先分成等分的microRNAPCR引物組。加入cDNA并將PCR主混合物加入所述孔，可以實(shí)現(xiàn)最高至730個(gè)microRNA的實(shí)時(shí)PCR作譜?？梢允褂胢icroRNAReady-to-UsePCR,HumanpanelI+II,VI.M(Cataloguenumber203601,ExiqonA/S,VedbaeK,Denmark；或microRNAReady-to-UsePCR,HumanpanelI+II,VI.R(Cataloguenumber203602,ExiqonA/S,Vedbaek,Denmark),取決于檢測(cè)裝置。作為替代，可以使用mirVanaqRT-PCRmiRNADetectionKitCCatalogueNoAM1558,Ambion,AppliedBiosystems,Austin,Texas,USA)來(lái)檢測(cè)和定量miRNA。環(huán)狀引物RT-PCR例如，被稱(chēng)為環(huán)狀引物RT-PCR的實(shí)時(shí)定量方法可以用于準(zhǔn)確且敏感地檢測(cè)成熟miRNA。該測(cè)定法能夠區(qū)分差異少至單核苷酸的兩個(gè)miRNA，以及成熟miRNA和其前體。簡(jiǎn)而言之，使用mirVanamiRNAIsolationKit(CataloguenumberAMI560或AMI561,Ambion,AppliedBiosystems,Austin,Texas,USA)從培養(yǎng)的細(xì)胞中純化miRNA。然后進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所述測(cè)定法包括兩個(gè)步驟反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反轉(zhuǎn)錄步驟包括莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄，其中莖環(huán)RT引物退火至miRNA祀并在存在逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下延伸。將包含RNA樣品、環(huán)狀引物、IX緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑的RT反應(yīng)物各在16°C和42°C下孵育30分鐘。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟中，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。microRNA特異性正向引物、TaqMan㊣探針和反向引物被用于PCR反應(yīng)。實(shí)時(shí)PCR在AppliedBiosystems7900HTReal-TimePCRSystem上進(jìn)行。對(duì)于數(shù)據(jù)分析，基于合成lin_4miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)估計(jì)每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)。miRNA的定量是基于測(cè)量的CT值進(jìn)行估計(jì)。還可以進(jìn)行RNA印跡分析?？梢允褂胢irVanaTMmiRNADe-tectionKit(CataloguenumberAMI552，Ambion,AppliedBiosystems,Austin,Texas,USA)溶液雜交的RNA印跡分析。圖解該方法的簡(jiǎn)圖如圖13所示。微陣列分析miRNA檢測(cè)和定量還可以通過(guò)微陣列雜交進(jìn)行?？梢允褂玫氖纠苑桨溉缦聦NA以Cy5或Cy3標(biāo)記，并與預(yù)載的探針雜交。使用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括確定可檢測(cè)信號(hào)、計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度和計(jì)算差分率。首先，減去背景。使用基于回歸的背景作圖方法確定背景。回歸在排除空白點(diǎn)的最低強(qiáng)度數(shù)據(jù)點(diǎn)的5-25%上進(jìn)行。然后，從原始數(shù)據(jù)矩陣減去背景矩陣。背景減除后，使用LOWESS(局部加權(quán)回歸)方法在減去背景的數(shù)據(jù)上進(jìn)行Cy3/Cy5通道歸ー化。歸ー化可除去系統(tǒng)相關(guān)偏差，例如樣品量差異、不同標(biāo)記染料和掃描儀的信號(hào)增益差異，使得生物學(xué)上的變異可以忠實(shí)地顯示。如果轉(zhuǎn)錄物符合至少兩個(gè)條件，那么它被列為可檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度高于3(背景SD)和點(diǎn)CV<0.5。CV通過(guò)(SD)/(信號(hào)強(qiáng)度)計(jì)算。當(dāng)陣列上有重復(fù)探針時(shí)，僅當(dāng)來(lái)自至少50%的重復(fù)探針的信號(hào)高于檢測(cè)水平吋，轉(zhuǎn)錄物被列為可檢測(cè)的。微陣列雜交服務(wù)可以由商業(yè)化的提供商進(jìn)行，例如LCSciences(www.lcsciences.com)。該服務(wù)是使用UParaflo.技術(shù)和專(zhuān)有引物設(shè)計(jì)的全基因組microRNA(miRNA)表達(dá)作譜服務(wù)，這使得能夠高敏感且特異性地直接檢測(cè)miRNA。可以使用用于在最新版本的SangermiRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(Release14.0)中可獲得的所有物種的成熟miRNA的標(biāo)準(zhǔn)陣列。microRNAmicroRNA(miRNA)可以選自has_miR-424(miRBaseAccessionNumberMIOOOl446)，hsa-miR-424^(miRBaseAccessionNumberMI0001446)，hsa-miR-425(miRBaseAccessionNumber:MI0001448)，hsa_miR-425*(miRBaseAccessionNumberMI0001448)，hsa-miR-454(miRBaseAccessionNumber:MI0003820)，hsa-miR-455_3p(miRBaseAccessionNumber:MI0003513)，hsa-miR-483_5p(miRBaseAccessionNumberMI0002467),hsa-miR-484(miRBaseAccessionNumberMI0002468),hsa-miR-491_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0003126)，hsa-miR-503(miRBaseAccessionNumber:MI0003188)，hsa-miR-505*(miRBaseAccessionNumberMI0003190),hsa-miR-532_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0003205)，hsa-miR-574-15_3p(miRBaseAccessionNumber:MI0003581)，hsa-miR-584(miRBaseAccessionNumber:MI0003591)，hsa-miR-612(miRBaseAccessionNumber:MI0003625)，hsa-miR-625(miRBaseAccessionNumberMI0003639)，hsa-miR-629(miRBaseAccessionNumberMI0003643)，hsa-miR-708(miRBaseAccessionNumber:MI0005543)，hsa-miR-744(miRBaseAccessionNumberMI0005559)，hsa-mir-766(miRBaseAccessionNumberMI0003836)，hsa-miR-768_3p(miRBaseAccessionNumber:MI0005117)，hsa-miR-768_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0005117)，hsa-miR-769_5p(miRBaseAccessionNumberMI0003834)，hsa-miR-877(miRBaseAccessionNumber:MI0005561)，hsa-miR-92，hsa-mir-92a-l(miRBaseAccessionNumber:MI0000093)，hsa-mir-92a_2(miRBaseAccessionNumber:MI0000094)，hsa_miR-92b(miRBaseAccessionNumber:MI0003560)，hsa-miR-93(miRBaseAccessionNumberMI0000095),hsa-miR-98(miRBaseAccessionNumberMI0000100),hsa_miR-99a(miRBaseAccessionNumberMI0000101),hsa-miR-99b(miRBaseAccessionNumberMI0000746)，hsa_let_7a，hsa-let-7a_l(miRBaseAccessionNumberMI0000060)，hsa-let-7a_2(miRBaseAccessionNumberMI0000061)，hsa-let-7a_3(miRBaseAccessionNumber:MI0000062)，hsa-miR-151_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000809)，hsa_miR-23a(miRBaseAccessionNumber:MI0000079)，hsa_let_7b(miRBaseAccessionNumber:MI0000063)，hsa-miR-151_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000809)，hsa-miR-23a*(miRBaseAccessionNumberMI0000079)，hsa-let-7b*(miRBaseAccessionNumber:MI0000063)，hsa-miR-152(miRBaseAccessionNumberMI0000462)，hsa-mir-23b(miRBaseAccessionNumberMI0000439)，hsa-let-7c(miRBaseAccessionNumber:MI0000064)，hsa-miR-155(miRBaseAccessionNumberMI0000681)，hsa-miR-24，hsa-mir-24-1(miRBaseAccessionNumberMI0000080)，hsa-let_7d(miRBaseAccessionNumber:MI0000065)，hsa_miR-15a(miRBaseAccessionNumberMI0000069),hsa-miR-24-2^(miRBaseAccessionNumberMI0000081)，hsa-20，let_7d*，hsa-let_7d(miRBaseAccessionNumber:MI0000065)，hsa_miR-15b(miRBaseAccessionNumber:MI0000438)，hsa-miR-25(miRBaseAccessionNumberMI0000082),hsa_let_7e(miRBaseAccessionNumberMI0000066),hsa-miR-16，hsa-mir-16-1(miRBaseAccessionNumberMI0000070)，hsa-mir-16-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000115)，hsa_miR-26a，hsa-mir-26a_l(miRBaseAccessionNumberMI0000083)，hsa-mir-26a-2(miRBaseAccessionNumberMI0000750)，hsa-1et-7f,hsa-let_7f-l(miRBaseAccessionNumberMI0000067)，hsa-let-7f-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000068)，hsa-miR-17(miRBaseAccessionNumberMI0000071)，hsa_miR-26b(miRBaseAccessionNumberMI0000084)，hsa-1et_7g(miRBaseAccessionNumber:MI0000433)，hsa_miR-I8Ia，hsa-mir-181a-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000269)，hsa_miR-27a(miRBaseAccessionNumberMI0000085)，hsa_let_7i(miRBaseAccessionNumberMI0000434)，hsa-miR-18la*，hsa-mir-181a_l(miRBaseAccessionNumberMI0000289)，has-miR-27b(miRBaseAccessionNumber:MI0000440)，hsa-miR-100(miRBaseAccessionNumberMI0000102)，hsa-miR-181a_2*(miRBaseAccessionNumberMI0000269)，hsa_miR-27b*(miRBaseAccessionNumberMI0000440)，hsa-miR-103，hsa-mir-103-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000108)，hsa-mir-103-1(miRBaseAccessionNumber:MI0000109)，hsa-mir-103-l-as3(miRBaseAccessionNumberMI0007261)，hsa-mir-103-2_as(miRBaseAccessionNumber:MI0007261)，hsa_miR-181b，hsa-mir-181b-l(miRBaseAccessionNumber:MI0000270)，hsa-mir-181b_2(miRBaseAccessionNumberMI0000683),hsa-miR-28_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000086)，hsa-miR-106a(miRBaseAccessionNumberMI0000113)，hsa-miR-181c(miRBaseAccessionNumberMI0000271)，hsa-miR-28_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0000086)，hsa-miR-572(miRBaseAccessionNumber:MI0003579)，hsa-miR-106b(miRBaseAccessionNumber:MI0000734)，hsa_miR-181d(miRBaseAccessionNumber:MI0003139)，hsa-miR-296_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000747)，hsa-miR-107(miRBaseAccessionNumberMI0000114)，hsa-miR-185(miRBaseAccessionNumber:MI0000482)，hsa_miR-29a(miRBaseAccessionNumberMI0000087),hsa-miR-574_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0003581)，hsa_25miR-10a，hsa-miR-186(miRBaseAccessionNumber:MI0000483)，hsa_miR-29c(miRBaseAccessionNumberMI0000735),hsa-miR-575(miRBaseAccessionNumberMI0003582),hsa-miR-122(miRBaseAccessionNumber:MI0000442)，hsa_miR-187*(miRBaseAccessionNumberMI0000274)，hsa_miR-30a(miRBaseAccessionNumberMI0000088)，hsa-miR-1224_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0003764)，hsa_miR-18a(miRBaseAccessionNumber:MI0000072)，hsa-miR_30a*(miRBaseAccessionNumberMI0000088),hsa-miR-1228(miRBaseAccessionNumberMI0006318)，hsa_miR-18b(miRBaseAccessionNumber:MI0001518)，hsa_miR-30b(miRBaseAccessionNumberMI0000441),hsa-miR-1234(miRBaseAccessionNumberMI0006324)，hsa-miR-191(miRBaseAccessionNumber:MI0000465)，hsa_miR-30c，hsa-mir-30c_2(miRBaseAccessionNumberMI0000254)，hsa-mir-30c-l(miRBaseAccessionNumberMI0000736)，hsa-miR-1237(miRBaseAccessionNumberMI0006327)，hsa-miR-19(miRBaseAccessionNumber:MI0000465)，hsa_miR-30d(miRBaseAccessionNumber:MI0000255)，hsa-miR-638(miRBaseAccessionNumberMI0003653)，hsa-miR-1238(miRBaseAccessionNumber:MI0006328)，hsa-miR-192(miRBaseAccessionNumber:MI0000234)，hsa_miR-30e(miRBaseAccessionNumber:MI0000749)，hsa-miR-663(miRBaseAccessionNumber:MI0003672)，hsa-miR-124，hsa-mir-124-1(miRBaseAccessionNumberMI0000443)，hsa-mir-124-2(miRBaseAccessionNumberMI0000444)，hsa-mir-124-3(miRBaseAccessionNumber:MI0000445)，hsa-mir_124b(miRBaseAccessionNumber:MI0000260)，hsa-miR-193a_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000487)，hsa_miR-30e*(miRBaseAccessionNumberMI0000749)，hsa-miR-671_5p(miRBaseAccessionNumber:MI0003760)，hsa-miR-125a_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000469),hsa-miR-195(miRBaseAccessionNumberMI0000489),hsa-miR-31(miRBaseAccessionNumberMI0000089)，hsa-miR-30，hsa-mir-30c-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000254)，hsa-mir-30c-l(miRBaseAccessionNumber:MI0000736)，hsa-miR-125a_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000469)，hsa-miR-197(miRBaseAccessionNumberMI0000239)，hsa_miR-31*(miRBaseAccessionNumberMI0000089)，hsa-miR-125b,hsa-mir-125b_l(miRBaseAccessionNumber:MI0000446)，hsa-mir-125b_2(miRBaseAccessionNumberMI0000470),hsa-miR-198(miRBaseAccessionNumberMI0000240),hsa-miR-320，hsa_mir_320a(miRBaseAccessionNumberMI0000542)，hsa-mir-320b-l(miRBaseAccessionNumberMI0003776)，hsa-mir-320c-l(miRBaseAccessionNumber:MI0003778)，hsa-mir-320b_2(miRBaseAccessionNumberMI0003839)，hsa-mir-320d_l(miRBaseAccessionNumberMI0008190)，hsa-mir-320c-2(miRBaseAccessionNumberMI0008191)，hsa-mir-320d-2(miRBaseAccessionNumber:MI0008192)，hsa-mir_320e(miRBaseAccessionNumber:MI0014234)，hsa-miR-765(miRBaseAccessionNumber:MI0005116)，hsa-miR-126(miRBaseAccessionNumber:MI0000471)，hsa-miR-199a_3p，hsa-miR-199a_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000242)，hsa-mir-199a_2(miRBaseAccessionNumberMI000028I)，hsa-miR-324-5p(miRBaseAccessionNumber:MI0000813)，hsa-miR-128，hsa-mir-128-1(miRBaseAccessionNumberMI0000447)，hsa-mir-128-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000727)，hsa_miR-199a875p，hsa-miR-328(miRBaseAccessionNumberMI0000804)，hsa-miR-130a(miRBaseAccessionNumberMI0000448)，hsa-miR-199b_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000282),hsa-miR-330_3p(miRBaseAccessionNumber:MI0000803)，hsa_miR-130b(miRBaseAccessionNumber:MI0000748)，hsa_miR-19b，hsa-mir-19b_l(miRBaseAccessionNumberMI0000074)，hsa-mir-19b-2(miRBaseAccessionNumber:MI0000075)，hsa-miR-331_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000812),hsa-miR-132(miRBaseAccessionNumberMI0000449),hsa_miR-20a(miRBaseAccessionNumber:MI0000076)，hsa-miR-335(miRBaseAccessionNumberMI0000816)，hsa-miR-137(miRBaseAccessionNumberMI0000454)，hsa-miR-20b(miRBaseAccessionNumber:MI0001519)，hsa-miR-342_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000805),hsa-miR-923(miRBaseAccessionNumberMI0005715),hsa-miR-140_3p(miRBaseAccessionNumberMI0000456)，hsa-miR-21(miRBaseAccessionNumber:MI0000077)，hsa-miR-345(miRBaseAccessionNumber:MI0000825)，hsa-miR-143(miRBaseAccessionNumber:MI0000459)，hsa-miR-210(miRBaseAccessionNumberMI0000286)，hsa_miR-34a(miRBaseAccessionNumberMI0000268)，hsa-miR-145(miRBaseAccessionNumber:MI0000461)，hsa-miR-212(miRBaseAccessionNumberMI0000288)，hsa_miR-34a*(miRBaseAccessionNumberMI0000268)，hsa-miR-145*(miRBaseAccessionNumber:MI0000461)，hsa-miR-214(miRBaseAccessionNumberMI0000290)，hsa-miR-361_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000760)，hsa-miR-933(miRBaseAccessionNumberMI0005755)，hsa_miR-146a(miRBaseAccessionNumber:MI0000477)，hsa-miR-22(miRBaseAccessionNumberMI0000078),hsa-miR-362_3p，5，hsa-miR-940(miRBaseAccessionNumberMI0005762)，hsa-miR-146b_5p(miRBaseAccessionNumberMI0003129)，hsa-miR-22^(miRBaseAccessionNumberMI0000078),hsa-miR-362_5p(miRBaseAccessionNumberMI0000762)，hsa-miR-148b(miRBaseAccessionNumber:MI0000811)，hsa-miR-221(miRBaseAccessionNumber:MI0000298),hsa-miR-365,hsa-mir-365-1(miRBaseAccessionNumberMI0000767),hsa-mir-365-2(miRBaseAccessionNumberMI0000769),hsa-miR-149(miRBaseAccessionNumberMI0000478),hsa-miR-221*(miRBaseAccessionNumberMI0000298),hsa_miR-374b(miRBaseAccessionNumberMI0005566),hsa-miR-149*(miRBaseAccessionNumberMI0000478),hsa-miR-222(miRBaseAccessionNumberMI0000299),hsa-miR-421(miRBaseAccessionNumberMI0003685),hsa-miR-150*(miRBaseAccessionNumberMI0000479),hsa-miR-222*andhsa-miR-423_5p(miRBaseAccessionNumberMI0001445).在上文中！AccessionNumber為登錄號(hào)。所述miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)是已發(fā)表的miRNA序列和注釋的可檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，可以通過(guò)http://www.mirbase.org進(jìn)入。miRBase記載于以下論文中miRBasemicroRNAsequences,targetsandgenenomenclature.Griffiths-JonesS,GrocockRJ,vanDongenS,BatemanA,EnrightAJ.NAR,2006,34,DatabaseIssue,D140-D144；ThemicroRNARegistry.Griffiths-JonesS.NAR,2004,32,DatabaseIssue,D109-D111。如下出版物提供了miRNA注釋的指導(dǎo)原則AuniformsystemformicroRNAannotation.AmbrosV,BartelB,BartelDP,BurgeCB,CarringtonJC,ChenX,DreyfussG,EddySR,Griffiths-JonesS,MarshalIM,MatzkeM,RuvkunG,TuschlT.RNA,2003,9(3),277-279。微陣列本發(fā)明人描述了包含核酸序列的集合，所述核酸序列能夠特異性結(jié)合并區(qū)分上文所列每ーmiRNA的前體和成熟形式之。所述核酸序列的集合可以方便地以有序方式排列。它們可以被連接在基質(zhì)上。例如，可以提供包含這類(lèi)核酸集合的微陣列。微陣列可以包括能夠雜交于并檢測(cè)前體形式的所述microRNA的引物或探針集合，以及能夠雜交于并檢測(cè)成熟形式的所述microRNA的引物或探針集合。構(gòu)建這類(lèi)微陣列可以使用SangermiRBaseRelease10.I中列出的miRNA轉(zhuǎn)錄物表。前體miRNA與成熟miRNA的比例前體miRNA與成熟miRNA的比例可以簡(jiǎn)單地計(jì)算為前體形式的miRNA種類(lèi)與成熟形式的miRNA種類(lèi)的量的比例。替代地或者另外地，已知不隨細(xì)胞狀態(tài)變化而改變的前體形式與成熟形式的miRNA種類(lèi)的比例可以用作內(nèi)部對(duì)照。因此，第一比例與第二比例的比例可以替代監(jiān)測(cè)miRNA種類(lèi)的前體miRNA與成熟miRNA的比例或者與之一起，用于監(jiān)測(cè)目的。在此，所述第一比例是已知隨細(xì)胞狀態(tài)變化而改變的前體形式與成熟形式的miRNA種類(lèi)的比例，所述第二比值是已知不隨細(xì)胞狀態(tài)變化而改變的前體形式與成熟形式的miRNA種類(lèi)的比例。前體miRNA與成熟miRNA的比例譜還可以建立包含多個(gè)選擇的miRNA種類(lèi)的多個(gè)前體miRNA與成熟miRNA的比例的譜來(lái)替代確定單個(gè)miRNA種類(lèi)的前體與成熟miRNA的比或者與其結(jié)合使用，所述譜中每個(gè)比例均指示細(xì)胞狀態(tài)。可以監(jiān)測(cè)這類(lèi)譜的變化，作為ー種監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的手段。所述譜可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方式建立，例如通過(guò)雜交于包含多個(gè)探針的陣列，所述探針能夠結(jié)合并區(qū)分前體和成熟形式的多個(gè)所選擇的miRNA種類(lèi)。其他用途本發(fā)明人描述了ー種檢測(cè)細(xì)胞狀態(tài)變化的方法。所述方法包括檢測(cè)所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)的變化，其中這類(lèi)變化指示細(xì)胞狀態(tài)變化。本發(fā)明人描述了ー種確定細(xì)胞處于具體狀態(tài)的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)與已知處于該具體狀態(tài)的細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA的比例(或包含這類(lèi)比例的譜)進(jìn)行比較。本發(fā)明人描述了ー種監(jiān)測(cè)生物體狀態(tài)的方法。所述方法包括從該生物體獲得樣品或獲得該生物體的樣品，建立所述樣品中miRNA種類(lèi)的前體mi-RNA與成熟mi-RNA的比例，從如此獲得的前體miRNA與成熟miRNA的比例建立所述生物體的狀態(tài)。本發(fā)明人描述了ー種檢測(cè)生物體狀態(tài)的方法。所述方法包括從該生物體獲得樣品或獲得該生物體的樣品，建立所述樣品中miRNA種類(lèi)的前體mi-RNA與成熟mi-RNA的比例，并將如此獲得的前體miRNA與成熟miRNA的比例與已知患病生物體的或來(lái)自患病生物體的樣品的前體miRNA與成熟miRNA的比例進(jìn)行比較。本發(fā)明人描述了ー種治療或預(yù)防生物體疾病的方法。所述方法包括如上文所述檢測(cè)生物體的疾病,并將該疾病的治療給予所述生物體。實(shí)施例實(shí)施例I至15描述了間充質(zhì)干細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化。實(shí)施例16至25描述了前/成熟miRNA的比例用作標(biāo)記物來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的用途。實(shí)施例I.材料和方法_huES9.ElMSC的致癌轉(zhuǎn)化將以前描述的來(lái)源自人ESC的huES9.ElMSC在第21代或pl6以攜帶c-myc基因或GFP基因的慢病毒感染，以生成兩種類(lèi)型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別是cmyc-MSC和GFP-MSC。使用引物PTDmyc(5'GAATTCGAATGCCCCTCAACGTTAGC3')和PTDmyca(5'CTCGAGCGCACAAGAGTTCCGTAGC3')從pMXs-hc_MYC[32]擴(kuò)增c-myccDNA。將所擴(kuò)增的片段插入pDrive載體并測(cè)序。將c_myc片段消化并作為Xhol(filled)/EcoRl片段克隆至具有匹配末端的Smal/EcoRl消化的pLVX-puro載體中(Clontech,www.clontech.com)。慢病毒顆粒依照制造商的方案使用Lenti-XHTPackagingSystemCClontech,www.clontech.com)產(chǎn)生。病韋效價(jià)使用Lenti-XqRT-PCR滴定試劑盒(Clontech,www.clontech.com)確定。將在第21代感染的HuES9.ElhESC-MSC[24]以每IOcm皿IO6細(xì)胞鋪板，并在存在4yg/ml聚凝胺的情況下以M0I=5的病毒感染過(guò)夜。第二天，將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在感染后48小時(shí)通過(guò)將培養(yǎng)基替換為包含嘌呤霉素(2iig/ml)的培養(yǎng)基開(kāi)始選擇。在選擇3天后，將細(xì)胞按照來(lái)源自人ESC的huES9.ElMSC進(jìn)行擴(kuò)增并將這些細(xì)胞合并以生成El-myc21.I系。對(duì)于在第16代被感染的HuES9.ElhESC-MSC[24]，將細(xì)胞鋪板于6孔板的3個(gè)孔中。如上述對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行病毒感染和隨后的藥物選擇。通過(guò)有限稀釋得到來(lái)自所述三個(gè)獨(dú)立感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的每ー個(gè)的克隆系。當(dāng)所克隆的細(xì)胞擴(kuò)增至IO7個(gè)細(xì)胞(或匯合15cm培養(yǎng)皿)，將所述細(xì)胞命名為pi。生成3個(gè)克隆系，分別命名為El-myc16.I、El-myc16.2和El-myc16.3系。c_myc或GFP轉(zhuǎn)基因的整合是通過(guò)使用分別對(duì)c_myc的外顯子2和外顯子3特異性的引物擴(kuò)增基因組DNA進(jìn)行確認(rèn)5'-GCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACC'-3'和5'-ACATTCTCCTCGGTGTCCGAGG-3'，使用如下的PCR條件I個(gè)循環(huán)94，2分鐘；32個(gè)循環(huán)94°C，15秒；60°C，30秒，72°C，90秒；以及I個(gè)循環(huán)72°C，5分鐘。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠上分離。myc-MSC向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的分化是分別依照制造商說(shuō)明書(shū)使用脂肪發(fā)生、軟骨形成和骨形成hMSCDifferentiationBulletKits,respectively(Lonza,ffalkersville,MD)進(jìn)行。由G帶顯帶進(jìn)行的核型分析由CytogeneticsLaboratory,KKH進(jìn)行。實(shí)施例2.材料和方法-端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性使用改良的WegeH.etal[33]描述的方法，通過(guò)SYBRLreen實(shí)時(shí)定量端粒擴(kuò)增方案測(cè)定測(cè)量相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。簡(jiǎn)而言之，收&。n萬(wàn)細(xì)胞并使用市售的哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取試劑盒(CatK269-500_l,BioVision,www.biovision,com)制備細(xì)胞裂解物。用于PCR擴(kuò)增的試劑的組合物為Iyg的蛋白細(xì)胞裂解物、IOiil的2XSYBRGreenSuperMix(Cat170-8880,BioRad,Singapore),含0.Iyg的TS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGACTT-3')、0.Iyg的ACX引物(5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3')和IOmMEGTA,總體積25yl。首先將所述反應(yīng)物在25°C下孵育20分鐘，以使所述細(xì)胞裂解物中的端粒末端轉(zhuǎn)移酶延長(zhǎng)TS引物，然后在95°C下孵育2分鐘以失活端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性并變性所述引物。通過(guò)40個(gè)循環(huán)的95°C，30秒；60°C，90秒的PCR擴(kuò)增所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物。使用IUg蛋白細(xì)胞裂解物的閾值循環(huán)數(shù)(或Ct值)，相對(duì)于HEK293細(xì)胞評(píng)估所述相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。實(shí)施例3.材料和方法-細(xì)胞周期速率為了評(píng)估細(xì)胞周期速率，將2XIO7個(gè)細(xì)胞以2ml的IOiiMCFDA(MolecularProbe,Eugene,Or)的PBS溶液在37°C下預(yù)標(biāo)記15分鐘，孵育24小時(shí)，然后以每孔5XIO4個(gè)細(xì)胞重新鋪板于涂敷有明膠的6孔板中。在0、24、48和72小時(shí),將細(xì)胞從兩個(gè)平行孔中收獲，在2%低聚甲醒中固定，并在FACSplus(BectonDickinson;SanJose,CA)上進(jìn)行分祈。假定細(xì)胞熒光每次減半代表一次細(xì)胞分裂，每24小時(shí)計(jì)算細(xì)胞周期數(shù)目。因此，每24小時(shí)的細(xì)胞周期數(shù)目(n)計(jì)算為n=lg(F-Fn)/lg2，其中F是初始平均細(xì)胞熒光，F(xiàn)n是24小時(shí)后的平均細(xì)胞熒光。然后，將細(xì)胞周期數(shù)目相對(duì)于時(shí)間作圖，以推導(dǎo)每個(gè)細(xì)胞周期的平均時(shí)間。實(shí)施例4.材料和方法-表面抗原分析Hus9El和ElmycMSC上細(xì)胞表面抗原的表達(dá)是使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。對(duì)所述細(xì)胞以胰蛋白酶處理5分鐘，離心，再懸浮于培養(yǎng)基中，并在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中于細(xì)菌培養(yǎng)皿中孵育I小吋。然后，將所述細(xì)胞收集、離心、在2%FBS中洗滌。然后，將2.5XIO5個(gè)細(xì)胞在冰上與如下每ー種綴合的單克隆抗體孵育60分鐘CD29-PE、CD44-FITC、CD49a-PE、CD49e-PE、CD105-FITC、CD166-PE、CD73-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、HLADR-PE和MHCl-PE(PharMingen,SanDiego，CA)。在孵育后，將細(xì)胞洗滌并再懸浮于2%FBS中。通過(guò)將類(lèi)似的細(xì)胞等分試樣與同種型匹配的小鼠單克隆抗體(PharMingen,SanDiego,CA)孵育來(lái)確定非特異性熒光。通過(guò)使用CELLQuest軟件在BDFACSCaliburFlowCytometer(BDBio-sciences,SanJose,CA)裝置上收集20，000個(gè)事件來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例5.材料和方法-通過(guò)qRT-PCR分析RNA使用qRT-PCR確定細(xì)胞的相對(duì)myc轉(zhuǎn)錄物水平。使用High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKit(ABI1USA)將來(lái)自GFP-MSC(pl7)和Elmyc-MSC(p24，p27，p29)的20ngRNA轉(zhuǎn)換成cDNA。然后在St印OnePlusReal-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBi-osystems,www.appliedbiosystems,com.Sg)上以對(duì)myc或肌動(dòng)蛋白特異性的引物組通過(guò)以下方式擴(kuò)增所述cDNA1個(gè)循環(huán)94，10分鐘；40個(gè)循環(huán)94°C，15秒；600C,60秒；以及I個(gè)循環(huán)95°C，15秒，60°C60秒，95°C，15秒。myc特異性引物組是5'-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3'和5'-AGAAGGGTGTGACCGCAACGTAG3'。實(shí)施例6.材料和方法-Illumina基因芯片分析從myc-MSC的不同傳代制備總RNA,在技術(shù)上重復(fù)三次。使用Illumin^HTotalPrepRNAAmplificationKit,從p4、p7和p8的El_mycl6·3細(xì)胞制備RNA,從P15和P16的親本HuES9_EIMSC制備RNA。使用IlluminaRNAAmplificationKit(Ambion,Inc.,Austin,TX)依照制造商的說(shuō)明書(shū)將500ngRNA轉(zhuǎn)換成生物素化的cRNA。依照所述IlluminaBeadStation500x手冊(cè)，將750ng的生物素化的cRNA雜交于SentrixHumanRef-8ExpressionBeadChipVersion3(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)并進(jìn)行洗滌和掃描。使用GenespringGX10分析數(shù)據(jù)。通過(guò)移位至第75百分位數(shù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化，并將所述歸一化的數(shù)據(jù)基線(xiàn)轉(zhuǎn)化至所有樣品的中位數(shù)。實(shí)施例7.材料和方法-蛋白質(zhì)印跡雜交將蛋白在4-12%SDS_丙烯酰胺凝膠上分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉，以抗人CD9、ACTIN的一抗(CruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USA)和MYC(Abeam,Cambridge,MA)孵育。然后，將所述印跡以辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG的抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)孵育，隨后以HRP增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物(ThermoFisherScientificInc,Waltham,MA)孵育,然后暴露于X射線(xiàn)膠片。實(shí)施例8.材料和方法-HPLC純化微粒所述裝置設(shè)置由以下設(shè)備組成由來(lái)自ShimadzuCorporation(Kyoto,Japan)的ClassVP軟件操作的帶有二元泵、自動(dòng)注入器、恒溫柱箱和UV可見(jiàn)檢測(cè)器的液相色譜系統(tǒng)。所使用的色譜柱是來(lái)自TosohCorporation(Tokyo,Japan)的TSKGuard柱SWXL,6x40mm和TSK凝膠G4000SWXL,7.8x300mm。如下檢測(cè)器在所述UV可見(jiàn)檢測(cè)器后串聯(lián)連接Dawn8(光散射)，Optilab(折射率)和QELS(動(dòng)態(tài)光散射)。最后三個(gè)檢測(cè)器來(lái)自WyattTechnologyCorporation(California,USA),并通過(guò)ASTRA軟件進(jìn)行操作。所述樣品的組分通過(guò)尺寸排阻進(jìn)行分離，即大分子將先于較小分子洗脫。所使用的洗脫緩沖液是含150mM的NaCl、pH7.2的20mM磷酸緩沖液。將該緩沖液過(guò)濾通過(guò)0.Iμm的孔徑并除氣15分鐘,然后使用。將所述色譜系統(tǒng)以0.5ml/min的流速平衡,直至Dawn8中的信號(hào)穩(wěn)定在大約0.3個(gè)檢測(cè)器電壓?jiǎn)挝?。將所述UV可見(jiàn)檢測(cè)器設(shè)定在220nm,將所述柱箱平衡至25°C。洗脫模式是等度的，運(yùn)行時(shí)間是40分鐘。所注入的樣品體積是50至100μI。流體力學(xué)半徑Rh是通過(guò)QELS和DawnS檢測(cè)器進(jìn)行計(jì)算。將在峰值下的最高讀數(shù)速率(Hz)作為Rh。將在220nm下出現(xiàn)的分離組分的峰收集，作為進(jìn)一步表征研究的級(jí)分。實(shí)施例9.材料和方法-測(cè)試分泌物的心臟保護(hù)如以前所述[34]，通過(guò)在化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的MSC三天，制備分泌物。簡(jiǎn)而言之，首先將P12的細(xì)胞在如上述的包含血清的培養(yǎng)基中擴(kuò)大。在pl5，將80%匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物以PBS洗滌三次，然后在如下的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜由無(wú)酌■磺酞的DMEM(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)組成并補(bǔ)加膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和含硒蛋白(ITS)(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)、5ng/mlFGF2(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)、5ng/mlPDGFAB(Peprotech,RockyHill，NJ)、谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素和β-巰基乙醇。然后，將所述細(xì)胞培養(yǎng)物以PBS洗滌，更換新鮮的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，繼續(xù)3天，以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。將該CM收集，通過(guò)在500xg下離心澄清。通過(guò)使用IOOkDa的膜截留分子量正切流動(dòng)過(guò)濾系統(tǒng)(Satorius,Goettingen,Germany)將所述澄清的CM的體積減小到50分之一將它濃縮50倍。使用IOOkDa的膜截留分子量可使MW小于IOOkDa的分子通過(guò)所述過(guò)濾器，導(dǎo)致小于IOOkDa的分子優(yōu)先喪失。然后，通過(guò)過(guò)濾通過(guò)220nm過(guò)濾器將所述濃縮的CM滅菌。在小鼠的缺血和再灌注損傷模型中測(cè)試所述CM。通過(guò)30分鐘的左冠狀動(dòng)脈(LCA)閉塞和隨后再灌注誘導(dǎo)MI。在再灌注前5分鐘，對(duì)小鼠靜脈輸注從myc-MSC條件培養(yǎng)基純化的O.3μg外核體蛋白的200μI鹽水溶液。對(duì)對(duì)照動(dòng)物輸注200μI鹽水。在再灌注24小時(shí)后，使用以前描述的伊凡斯藍(lán)染料注射和TTC染色[27]評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)面積(AAR)的百分?jǐn)?shù)作為梗塞面積(IS)。實(shí)施例10.材料和方法-統(tǒng)計(jì)分析將雙尾ANOVA和事后Dunnett用于檢驗(yàn)組之間梗塞面積的差異。每一陣列組的相關(guān)系數(shù)使用皮爾森相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。實(shí)施例11.結(jié)果-轉(zhuǎn)化huES9.ElMSC培養(yǎng)物將第21代的HuES9.ElMSC以含GFP或含myc的慢病毒感染。將所述感染的培養(yǎng)物在嘌呤霉素選擇下放置三天。將存活細(xì)胞合并。基因組DNA的PCR擴(kuò)增證明，myc轉(zhuǎn)基因成功地整合在基因組中(圖1A)。與被合并形成El-myc21.I系的myc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同，GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞向老化發(fā)展，增殖速度減小并獲得非常平的、寬大的形態(tài)(圖1B)，不能繁殖超過(guò)p26。GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(GFP-MSC)相比，myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)c-myc轉(zhuǎn)錄物水平增加至100倍(圖1C)，并表達(dá)更高的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(圖1D)。為了生成獨(dú)立的克隆系，將pl6的三個(gè)HuES9.ElMSC培養(yǎng)物單獨(dú)感染并置于嘌呤霉素藥物選擇下。將存活的細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)有限稀釋克隆以生成3個(gè)譜系，分別是El-myc16.UEl-myc16.2和El_myc16.3譜系。將所述譜系通過(guò)G帶顯帶確定核型。所有三個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似于El-myc21.I系的細(xì)胞形態(tài)。僅El-myc16.3系具有46XX的親本核型——在20/20分裂中期中[24]在pll和ql3之間有染色體9的臂間倒位，因此被用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)中(圖1E)。與它們的親本細(xì)胞不同，myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖更快速，有13小時(shí)的群體倍增時(shí)間，與之相對(duì)的未轉(zhuǎn)化MSC的群體倍增時(shí)間為19小時(shí)。通過(guò)使用以前所述的CFDA細(xì)胞標(biāo)記[35]，平均細(xì)胞周期時(shí)間從19小時(shí)減少到11小時(shí)(圖1F)。所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有效繞過(guò)衰老并繼續(xù)保持它們的增殖速率至少再20個(gè)傳代。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞形狀更小且更圓，具有突起的細(xì)胞核。這些細(xì)胞還失去接觸抑制，導(dǎo)致形成細(xì)胞簇(圖1C)。與增殖的增加相一致，所述細(xì)胞與GFP轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比具有更高水平的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(圖IE)。實(shí)施例12.結(jié)果-評(píng)估m(xù)yc-MSC依照確定人MSC的ISCT最低標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估m(xù)yc-MSC培養(yǎng)物[31]。如先前觀察到的結(jié)果(圖1C)，所述培養(yǎng)物不附著于塑料培養(yǎng)皿以及它們的未轉(zhuǎn)化MSC，特別是在匯合時(shí)，這時(shí)所述細(xì)胞開(kāi)始形成簇，而不是以單層附著于所述塑料皿。myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的表面抗原譜與它們的親本細(xì)胞十分相似，不同之處是它們陰性表達(dá)MHCI。所述細(xì)胞是CD29+、CD44+、CD49a+、CD49e+、CD73+CD105+、CD166+、MHCI'HLA-DR'CD34-和CD45-(圖2)。接著檢查多克隆El-myc21.I和單克隆El-myc16.3細(xì)胞系的體外分化潛力(圖3)。兩個(gè)細(xì)胞系都容易地分化成了軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞(圖3A、圖3B)，但未分化成脂肪細(xì)胞。在MSC中誘導(dǎo)脂肪發(fā)生需要4個(gè)循環(huán)的6天治療方案，由3天暴露于誘導(dǎo)培養(yǎng)基和3天暴露于保持培養(yǎng)基組成。本發(fā)明人觀察到，暴露于誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)了myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡，但不誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)化的親本細(xì)胞死亡(圖3C)。這些結(jié)果表明，myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能發(fā)生成脂分化?？傊?，這些結(jié)果證明，與其中myc轉(zhuǎn)化被觀察到不改變MSC的功能特征的在先報(bào)道不同[29]，本發(fā)明人在本文中觀察到c-myc轉(zhuǎn)化影響MSC的一種明確的性質(zhì)，即進(jìn)行脂肪發(fā)生的潛力。實(shí)施例13.結(jié)果-基因表達(dá)譜通過(guò)微陣列雜交對(duì)myc-轉(zhuǎn)化的MSC和其親本MSC進(jìn)行基因組范圍的基因表達(dá)作譜，以評(píng)估所述細(xì)胞類(lèi)型之間的親緣關(guān)系。通過(guò)使用來(lái)自p4、p7和p8的El-myc16.3MSC以及pl5和pl6的親本HuES9_EIMSC的RNA,在SentrixHumanRef-8ExpressionBead-Chipversion3(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)上重復(fù)兩次進(jìn)行微陣列雜交。不同傳代的El-myc16.3MSC之間或不同傳代的親本HuES9_ElMSC之間的基因表達(dá)譜高度相似，相關(guān)值大于O.98。El-mycl6.IMSC和親本HuES9_ElMSC之間的相關(guān)系數(shù)r2也相對(duì)較高，為O.92(圖4A)。在El-myc16.IMSC中總共161基因上調(diào)至少2倍，226基因下調(diào)至少2倍，表明myc轉(zhuǎn)化后基因表達(dá)有變化。將這些差異表達(dá)的基因通過(guò)PANTHER(ProteinANalysisTHroughEvolu-tionaryRelationships)[36，37]進(jìn)行功能聚類(lèi),其中將在每個(gè)基因集合中對(duì)每個(gè)生物過(guò)程觀察的基因頻率與參考頻率相比較，所述參考頻率在該情形下是NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中該生物過(guò)程的基因頻率。對(duì)于161個(gè)上調(diào)基因有11個(gè)過(guò)表達(dá)的生物過(guò)程，即代謝過(guò)程；核堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝過(guò)程；初級(jí)代謝過(guò)程；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)；硫代謝過(guò)程；細(xì)胞器組織；線(xiàn)粒體組織；過(guò)氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)；細(xì)胞氨基酸和衍生物代謝過(guò)程；多聚磷酸鹽分解代謝過(guò)程；以及蛋白質(zhì)代謝過(guò)程。有4個(gè)低表達(dá)過(guò)程囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吐作用、細(xì)胞表面受體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫系統(tǒng)進(jìn)程(圖4B)。在226個(gè)下調(diào)的基因中，有37個(gè)過(guò)表達(dá)生物過(guò)程和I個(gè)低表達(dá)生物過(guò)程(圖4C)。對(duì)于上調(diào)基因，所述相關(guān)過(guò)表達(dá)過(guò)程中的許多對(duì)于增加用于細(xì)胞分裂的細(xì)胞體積或合成代謝活性通常是重要的，并且與觀察到的細(xì)胞增殖活性增加是一致的。低表達(dá)過(guò)程，即囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吞作用，表明外核體產(chǎn)生可能不受影響。對(duì)于下調(diào)的基因，所述37個(gè)過(guò)表達(dá)的過(guò)程可能大致地分類(lèi)成與粘著、分化、通信、免疫應(yīng)答、細(xì)胞死亡和代謝的過(guò)程。這些過(guò)程還與本發(fā)明人對(duì)myc轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的一些觀察結(jié)果一致，即對(duì)塑料的粘著降低、脂肪發(fā)生能力喪失和MHCI表達(dá)喪失。實(shí)施例14.結(jié)果-分泌物的心臟保護(hù)活性myc-轉(zhuǎn)化的MSC中的脂肪發(fā)生能力喪失表明，來(lái)源自ESC的MSC的其他方面特征(例如產(chǎn)生治療性外核體)也可以受到轉(zhuǎn)化的損害。本發(fā)明人以前已證明，由來(lái)源自ESC的MSC分泌的外核體在小鼠的心肌缺血和再灌注損傷模型中是保護(hù)性的[27]。為了測(cè)試該方面是否受到損害，將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲條件培養(yǎng)基(CM)，并如以前所述[34，38]純化外核體。雖然在所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中c-myc轉(zhuǎn)錄物和蛋白水平增加，但是在所述CM和純化的外核體中未檢測(cè)到c-myc蛋白(圖5A)。所述CM的HPLC蛋白質(zhì)譜類(lèi)似于來(lái)自未轉(zhuǎn)化的MSC的CM[38](圖5B)，最快洗脫級(jí)分具有約12分鐘的保留時(shí)間。對(duì)該峰的動(dòng)態(tài)光散射分析顯示存在流體力學(xué)半徑區(qū)間為50-65nm的顆粒。在常規(guī)運(yùn)行中，本發(fā)明人常規(guī)地純化了約I.5mg的外核體/升條件培養(yǎng)基。將來(lái)自El-myc21.I或El-mycl6.3的HPLC純化的外核體分別以每只小鼠O.3或O.4μg的劑量給予小鼠的心肌缺血-再灌注損傷模型(圖5C)。風(fēng)險(xiǎn)面積(AAR)-El-myc21.I外核體、El-myc16.3外核體或鹽水處理的對(duì)照組中左心室(LV)面積的百分?jǐn)?shù)一是類(lèi)似的，分別為39.1±3.4%、41.7±4.7%和40.8±11.8%。以Eliyc21.I外核體或Eliyc16.3外核體處理的小鼠中的相對(duì)梗塞面積(IS/AAR)分別是23.4±8.2%和22.6±4.5%，它們的相對(duì)梗塞面積顯著低于鹽水處理小鼠中38.5±5.6%的相對(duì)梗塞面積(分別p〈0.001和p〈0.002)。實(shí)施例15.討論該報(bào)道描述了由過(guò)表達(dá)的c-myc基因轉(zhuǎn)化來(lái)源自人ESC的MSC。該轉(zhuǎn)化使得所述細(xì)胞能夠繞過(guò)衰老，增加端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性并增強(qiáng)增殖。通常，所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與它們的親本細(xì)胞之間的基因組范圍的基因表達(dá)是保守的，有O.92的相關(guān)系數(shù)。所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還具有特征的表面抗原譜CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、CD166+、MHCΓ、HLA-DR'0034_和0045_。雖然所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞滿(mǎn)足了對(duì)人MSC的定義的ISCT最低標(biāo)準(zhǔn)[31]中的大部分基本要求，然而它們具有改變的MSC表型。它們表現(xiàn)出對(duì)塑料粘著降低和不能發(fā)生脂肪發(fā)生，作為強(qiáng)烈對(duì)比脂肪發(fā)生被報(bào)道是來(lái)源自人ESC的MSC的三種基本MSC分化潛能中最強(qiáng)的[24]。因此，與觀察到myc轉(zhuǎn)化后MSC性質(zhì)基本無(wú)變化的以前的報(bào)道不同[29]，本發(fā)明人觀察到了myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的一些基本變化，使得所述細(xì)胞不再滿(mǎn)足對(duì)人MSC的定義的ISCT最低標(biāo)準(zhǔn)[31]，并且在技術(shù)上不是MSC。雖然失去一種明確的MSC性質(zhì)，但所述myc-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在小鼠缺血/再灌注損傷模型中繼續(xù)分泌能夠減少梗塞面積的外核體。然而，本發(fā)明人注意到，在轉(zhuǎn)化后每個(gè)細(xì)胞分泌的外核體的量減少，但這一點(diǎn)可以通過(guò)較高增殖速度或通過(guò)以更高細(xì)胞密度鋪板細(xì)胞用于收獲外核體而充分補(bǔ)償。因此，c-myc轉(zhuǎn)化代表了可實(shí)施的策略，確保無(wú)限提供用于產(chǎn)生作為治療劑或遞送載體的外核體的細(xì)胞。另外，增殖速度增加可減少細(xì)胞生產(chǎn)的時(shí)間，從而降低生產(chǎn)成本。實(shí)施例16.材料和方法構(gòu)建和產(chǎn)生c-mcyc和GFP慢病毒載體使用包含XhoI或EcoRI限制位點(diǎn)的引物從pMXs_hc_MYC擴(kuò)增c_myccDNA序列(15A)。然后，將所擴(kuò)增的片段以XhoI或EcoRI切割，并克隆至XhoI-EcoRI限制性的慢病毒載體-pLVX-puro(Clontech,www.clontech.com)。然后,對(duì)所述重組載體測(cè)序以確認(rèn)重組的myc序列。使用Lenti-XHTPackagingSystem(Clontech,www.clontech.com)依照制造商的方案產(chǎn)生慢病毒顆粒。病毒效價(jià)使用Lenti-XqRT-PCR滴定試劑盒(Clontech,www.clontech.com)測(cè)定。實(shí)施例17.材料和方法轉(zhuǎn)化MSC將第22次傳代的HuES9.ElhESC-MSC(14A)以包含c_myc或GFP轉(zhuǎn)基因的慢病毒感染。將所述細(xì)胞以每IOcm皿IO6個(gè)細(xì)胞鋪板。第二天，將所述細(xì)胞在存在4μg/ml聚凝胺的情況下以M0I=5的病毒感染過(guò)夜。第二天，替換培養(yǎng)基，在感染后48小時(shí)開(kāi)始以嘌呤霉素(2μg/ml)選擇。c-myc或GFP轉(zhuǎn)基因的插入是通過(guò)使用分別對(duì)外顯子2和3特異性的引物擴(kuò)增基因組DNA進(jìn)行確認(rèn)5'-GCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACC-3'和5'-ACATTCTCCTCGGTGTCCGAGG-3'，使用如下的PCR條件I個(gè)循環(huán)94，2分鐘；32個(gè)循環(huán)940C，15秒；60°C，30秒，72°C，90秒；以及I個(gè)循環(huán)72°C，5分鐘。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠上分離。實(shí)施例18.材料和方法端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性使用改良的WegeH.etal描述的方法，通過(guò)SYBRGreen實(shí)時(shí)定量端粒擴(kuò)增方案測(cè)量相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(16A)。簡(jiǎn)而言之，收獲3百萬(wàn)細(xì)胞病并使用市售的哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取試劑盒(CatK269-500-1,BioVision,www.biovision,com)制備細(xì)胞裂解物。用于PCR擴(kuò)增的試劑的組合物為Iμg的蛋白細(xì)胞裂解物、10μI的2ΧSYBRGreenSuperMix(Cat170-8880,BioRad,Singapore),含0·Iμg的TS引物(5'-AATCCGTCGAGCAGACTT-3')、O.Iμg的ACX引物(5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3')和IOmMEGTA,總體積25μI。首先將所述反應(yīng)物在25°C下孵育20分鐘，以使所述細(xì)胞裂解物中的端粒末端轉(zhuǎn)移酶延長(zhǎng)TS引物，然后在95°C下孵育2分鐘以失活端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性并變性所述引物。通過(guò)40個(gè)循環(huán)的95°C，30秒；60°C，90秒的PCR擴(kuò)增所述端粒末端轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物。使用Iμg蛋白細(xì)胞裂解物的閾值循環(huán)數(shù)(或Ct值)，相對(duì)于HEK細(xì)胞評(píng)估所述相對(duì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。實(shí)施例19.材料和方法制備包含外核體的條件培養(yǎng)基如以前所述從HuES9.E1MSC、(c-myc)MSC和(GFP)MSC制備條件培養(yǎng)基(CM)(17A)。簡(jiǎn)而言之，將80%匯合的HuES9.El培養(yǎng)物以PBS洗滌，轉(zhuǎn)移至化學(xué)成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行孵育過(guò)夜，以PBS洗滌并在新鮮配制的化學(xué)成分確定無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天。將包含MSC分泌物的所述CM收集，通過(guò)離心澄清，使用100-kDaMW截留的超濾膜(Sartorius,www.sartorius.com)濃縮50倍并通過(guò)過(guò)濾通過(guò)0.2μm濾器滅菌。實(shí)施例20.材料和方法分離RNA通過(guò)將三倍體積的TrizolLS(Invitrogen,www.invitrogen.com)加入至一倍體積的CM并依照制造商的方案完成提取，從CM分離RNA。來(lái)自MSC的總RNA和小RNA分別使用Trizol(Invitrogen,www.invitrogen.com)和mirVanamiRNAIsolationKit(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)純化。RNA使用Quant-iTTMRiboGreenRNAAssayKit(Invitrogen,www.invitrogen.com)純化并使用在含8%乙二醒或15%NovexTris-borate_EDTA(TBE)-脲凝膠(Invitrogen,www.invitrbgen.com)的I.5%瓊脂糖凝膠分離。在所述凝膠中的分離RNA通過(guò)溴化乙啶(EB)染色顯示。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，將CM以等體積的PBS>細(xì)胞裂解緩沖液(Biovision,www.biovision.com)、40mM環(huán)糊精(Sigma-Aldrich)或4000U/ml憐酸酯酶A2(Sigma-Aldrich,www.sigmaaldrich.com)在37°C下預(yù)孵育30分鐘，然后加入十分之一體積的lmg/mlRNaseA(RocheAppliedScience,www.roche-applied-science.com)。然后，將這些混合物在37°C下再孵育5分鐘。以TrizolLS提取RNA，并在TBE-脲凝膠上分離，然后進(jìn)行EB染色實(shí)施例21.材料和方法通過(guò)qRT-PCR分析RNA使用qRT-PCR確定細(xì)胞的相對(duì)myc轉(zhuǎn)錄物水平。使用High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKit(ABI,USA)將來(lái)自GFP_MSC(pl7)和Elmyc_MSC(p24，p27,p29)的20ηgRNA轉(zhuǎn)換成cDNA。然后在StepOnePlusReal-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)上以對(duì)myc或肌動(dòng)蛋白特異性的引物組通過(guò)I個(gè)循環(huán)94,10分鐘；40個(gè)循環(huán)94°C，15秒；60°C，60秒；以及I個(gè)循環(huán)95°C，15秒，60°C60秒，95°C，15秒擴(kuò)增所述cDNA。myc特異性引物組是5'-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3'和5'-AGAAGGGTGTGACCGCAACGTAG3'。為了檢測(cè)MSC或CM中的成熟miRNA,使用TaqManmicroRNAReverseTranscriptionKit(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)依照制造商的方案將IOng小RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，再懸浮成15μI。對(duì)每個(gè)RNA樣品的PCR反應(yīng)均在StepOnePlusRealtimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)中重復(fù)進(jìn)行三次，在20-μI反應(yīng)體積中含IμIcDNA和10μITaqMan2ΧUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)。熱循環(huán)參數(shù)是I個(gè)循環(huán)的95°C，10分鐘；接著40個(gè)循環(huán)的95°C，15秒；然后I個(gè)循環(huán)的60°C，60秒。所使用的引物是TaqMan引物hsa_let_7b(CatABAssayID000378,AppliedBiosystems)和hsa_let_7g(AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com.Sg)。為了對(duì)前體miRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，如前述使用PrimerExpress⑧SoftwareVersion3.O(AppliedBiosystems)設(shè)計(jì)所述引物(18A)。為了轉(zhuǎn)換成cDNA，在12μI反應(yīng)體積中將IOng的RNA樣品與IOpmol的下游引物在80°C下變性5分鐘。然后將所述RNA和下游引物在60°C下退火5分鐘，然后冷卻至室溫。如制造商所推薦加入5X反應(yīng)緩沖液、dNTP、DTT、RNA酶抑制劑和Thermoscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,www.invitrogen.com)。將所述反應(yīng)混合物在60°C下孵育45分鐘,然后在85°C下孵育5分鐘。然后，在20μI反應(yīng)體積中，使用十分之一的含cDNA的反應(yīng)混合物和SYBRgreenPCRMaster.Mix(AppliedBiosystems)進(jìn)行PCR。PCR參數(shù)是I個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒和40個(gè)循環(huán)的在60°C下I分鐘。PCR反應(yīng)重復(fù)三次。hsa_let_7b前體miRNA(登記號(hào)MI0000063,http://microrna.sanger.ac.uk)的引物序列是5'TGAGGTAG-TAGGTTGTGTGGT3'和5'GGAAGGCAGTAGGTTGTATAG3'對(duì)于hsa_let_7g前體miRNA(登記號(hào)MI0000137,http://microrna.sanger.ac.uk)，引物序列是5'GTAGTAGTTT-GTACAGTTTGAGGGT3'和5'GGCAGTGGCCTGTACAGT3'。實(shí)施例22.材料和方法統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)顯著性使用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行分析。實(shí)施例23.結(jié)果通過(guò)c-myc轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化MSChESC-MSC能夠以1:4平分比在培養(yǎng)物中廣泛繁殖最多至25世代，然后開(kāi)始發(fā)生衰老。將p22的HuES9.ElhESC-MSC以慢病毒載體轉(zhuǎn)染c_myc基因或GFP基因(圖6)。如預(yù)計(jì)的，c-myc轉(zhuǎn)染的MSC(myc-MSC)表達(dá)比GFP轉(zhuǎn)染的MSC(GFP-MSC)更高水平的c_mycmRNA(圖7)。在P23或轉(zhuǎn)染后的一代，GFP-MSC培養(yǎng)物呈現(xiàn)衰老特征更大的和更扁平的細(xì)胞，同時(shí)繁殖或分裂細(xì)胞很少。相反，myc-MSC培養(yǎng)物呈現(xiàn)致癌特征失去接觸抑制和存在大量較小的繁殖細(xì)胞。不是作為粘著單層生長(zhǎng)，myc-MSC形成具有多層細(xì)胞的聚集物(圖8)。與GFP-MSC或親本MSC不同，myc-MSC的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性顯著更高(圖9)。實(shí)施例24.結(jié)果前體microRNA與成熟microRNA的比例被轉(zhuǎn)化改變本發(fā)明人以前報(bào)道了，相對(duì)于細(xì)胞miRNA群,對(duì)于至少兩種miRNA-hsa_let_7b和hsa_let_7gmiRNA來(lái)說(shuō),分泌的miRNA群具有較高的前體microRNA與成熟microRNA的比例。為了確定轉(zhuǎn)化是否影響hsa_let_7b和hsa_let_7gmiRNA的該比例，分別從myc-MSC和myc-MSC條件化的培養(yǎng)基制備分泌的RNA。進(jìn)行定量RT-PCR。C-myc轉(zhuǎn)化增加了hsa_let_7bmiRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例，但未增加hsa_let_7gmiRNA的(圖10)。hsa-let-7b的前體miRNA與成熟miRNA的比例從2.5增加至7.I，表明增加至2.8倍。為了確定該比例變化是否是由于分泌物或細(xì)胞中前體miRNA和/或成熟miRNA的水平的變化，通過(guò)qRT-PCR確定這些水平。實(shí)施例25.討論本發(fā)明人以前證明，hESC-MSC可分泌含RNA的外核體(Chenetal.，印刷中)。通過(guò)使用這些細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基，本發(fā)明人觀察到了，該CM包含包裹在富含膽固醇的磷脂囊泡中的RNA，并且主要包含小RNA，不存在大于500nt的可檢測(cè)RNA。所述外核體的小RNA包括miRNA，一些核糖體的RNA降解中間產(chǎn)物和最可能的其他小非編碼RNA，但不包括細(xì)胞中存在的更大量的完整mRNA或核糖體RNA。MSC外核體miRNA主要是前體而不是成熟形式，使得一些外核體RNA(例如hsa_let_7b和hsa_let_7gmiRNA)的前體miRNA與成熟miRNA的比例顯著超過(guò)細(xì)胞RNA。在本文中，本發(fā)明人提出，前體miRNA與成熟miRNA的比例很可能受細(xì)胞的生理或病理狀態(tài)調(diào)節(jié)。在本文中，本發(fā)明人證明了，分泌的hsa-let-7bmiRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例在以c-myc癌基因轉(zhuǎn)化時(shí)升高，但分泌的hsa-let-7gmiRNA的未升高。分泌miRNA的前體miRNA與成熟miRNA的比例的該選擇性變化可以被改編，以擴(kuò)展鑒定作為癌癥預(yù)測(cè)性和預(yù)后性標(biāo)記物的獨(dú)特循環(huán)系統(tǒng)microRNA(miRNA)譜的現(xiàn)行做法(13A)(6A)0使用前體miRNA與成熟miRNA的比例來(lái)評(píng)估分泌的miRNA或循環(huán)系統(tǒng)miRNA將向現(xiàn)行循環(huán)系統(tǒng)miRNA的定性作譜引入定量成分，并使生物樣品和樣品制備的固有變異最小化，并通常將增加基于前體miRNA與成熟miRNA的比例的生物標(biāo)記物的穩(wěn)健性。參考文獻(xiàn)I.LeBlancK，PittengerM(2005)Mesenchymalstemcells!progresstowardpromise.Cytotherapy7:36-45.2.MinguellJJ，EricesA(2006)Mesenchymalstemcellsandthetreatmentofcardiacdisease.ExpBiolMed(Maywood)231:39-49.3.SchuleriKHiBoyleAJiHareJM(2007)Mesenchymalstemcellsforcardiacregenerativetherapy.HandbExpPharmacol:195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熟miRNA之間比例(或包含這類(lèi)比例的譜)的變化，其中這類(lèi)變化指示所述細(xì)胞狀態(tài)的變化；(b)用于確定細(xì)胞在具體狀態(tài)，所述方法包括比較所述細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA之間比例(或包含這類(lèi)比例的譜)與已知處于該具體狀態(tài)的細(xì)胞的前體miRNA與成熟miRNA之間比例(或包含這類(lèi)比例的譜)；(c)監(jiān)測(cè)生物體的狀態(tài)，所述方法包括從該生物體獲得樣品或者獲得該生物體的樣品，對(duì)所述樣品實(shí)施前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，并且由籍此獲得的所述前體miRNA與成熟miRNA之間比例確定所述生物體的狀態(tài)；Cd)檢測(cè)生物體的疾病，所述方法包括從該生物體獲得樣品或者獲得該生物體的樣品，對(duì)所述樣品實(shí)施前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，并且比較籍此獲得的所述前體miRNA與成熟miRNA之間比例與已知患病生物體的或來(lái)自患病生物體的樣品中前體miRNA與成熟miRNA之間比例；或Ce)治療或預(yù)防生物體中的疾病，所述方法包括根據(jù)(d)檢測(cè)生物體的疾病，并對(duì)所述生物體給予該疾病的治療物。7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中(a)所述細(xì)胞包含間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC);(b)所述細(xì)胞的狀態(tài)包括未轉(zhuǎn)化的狀態(tài)和轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，例如c-myc轉(zhuǎn)化的狀態(tài)；(c)所述microRNA包括hsa_let_7bmicroRNA(miRBase登錄號(hào)MI0000063);或((1)轉(zhuǎn)化狀態(tài)中的所述比例是正常狀態(tài)的2.8倍；或者上述的任意組合。8.一種包含多個(gè)核酸序列的陣列，所述核酸序列能夠結(jié)合并區(qū)分多個(gè)miRNA種類(lèi)的前體和成熟形式。9.一種包括如下步驟的方法(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC);和(b)將癌基因引入所述間充質(zhì)干細(xì)胞從而轉(zhuǎn)化它，其中所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞不將所述癌基因的基因產(chǎn)物分泌至其在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。10.權(quán)利要求9的方法，其中(a)所述癌基因包括c-myc;(b)所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)包括已建立的細(xì)胞系，例如huES9.El;或((3)所述間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來(lái)自于臍帶。11.權(quán)利要求9或10的方法，其中與尚未被轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞(a)能夠避開(kāi)老化；(b)具有增高的增殖速率；(c)具有降低的群體倍增時(shí)間，例如24小時(shí)；或((1)具有增加的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。12.—種提供條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括權(quán)利要求9、10或11中示出的步驟，然后在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞或其后代以條件化所述細(xì)胞培養(yǎng)基，并將所述條件化的培養(yǎng)基與所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞分離。13.一種提供外核體的方法，所述方法包括(a)通過(guò)權(quán)利要求12的方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)；(b)濃縮所述間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，例如通過(guò)在>1000kDa膜上超濾；(c)對(duì)所述濃縮的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行分子排阻色譜，例如使用TSKGuard柱SWXL，6x40mm或TSK凝膠G4000SWXL，7.8x300mm柱；并且(d)選擇呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)光散射的UV吸收級(jí)分，例如在220nm下，所述動(dòng)態(tài)光散射是例如通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射(QELS)檢測(cè)，其中步驟(d)例如包括收集以11-13分鐘例如12分鐘的保留時(shí)間洗脫的級(jí)分。14.一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括通過(guò)權(quán)利要求12的方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)或通過(guò)權(quán)利要求13的方法獲得外核體，并根據(jù)情況不同將所述MSC-CM或外核體與可藥用載體或稀釋劑混合。15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞、所述條件培養(yǎng)基、夕卜核體或藥物組合物包括間充質(zhì)干細(xì)胞的至少一種生物學(xué)性質(zhì)，例如心臟保護(hù)作用；或者其中所述條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物可以能夠減少梗塞面積，例如在心肌缺血和再灌注損傷的小鼠或豬模型中測(cè)定的，或者其能夠減少氧化應(yīng)激，例如在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的體外測(cè)定中測(cè)定的。16.通過(guò)權(quán)利要求9、10或11的方法獲得的永生化間充質(zhì)干細(xì)胞、通過(guò)權(quán)利要求12的方法獲得的條件培養(yǎng)基、通過(guò)權(quán)利要求13的方法獲得的外核體或者通過(guò)權(quán)利要求14的方法獲得的藥物組合物。17.參考附圖1-13并如附圖1-13所示的基本如上文所述的方法、陣列、永生化間充質(zhì)干細(xì)胞、條件培養(yǎng)基、外核體或藥物組合物。全文摘要本發(fā)明人描述了一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)的方法，所述方法包括，針對(duì)所選擇的由所述細(xì)胞分泌的microRNA(miRNA)種類(lèi)，確定(a)所述miRNA種類(lèi)的前體形式(前體miRNA)與(b)所述miRNA種類(lèi)的成熟形式(成熟miRNA)之間的比例，其中如此確定的所述前體miRNA與成熟miRNA之間的比例指示所述細(xì)胞的狀態(tài)。本發(fā)明人還描述了一種包括如下步驟的方法(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)；和(b)將癌基因引入所述間充質(zhì)干細(xì)胞從而轉(zhuǎn)化它，其中所述轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)干細(xì)胞不將所述癌基因的基因產(chǎn)物分泌至其在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。文檔編號(hào)C12Q1/68GK102858997SQ201080060346公開(kāi)日2013年1月2日申請(qǐng)日期2010年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者林賽娟申請(qǐng)人:新加坡科技研究局