專利名稱：提高翻譯效率的dna片段和包含該dna片段的重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于提高翻譯效率的DNA片段和一種包含該DNA片段的重組載體，從而使得能從植物批量生產(chǎn)異源蛋白。
背景技術(shù)：
一般而言，植物具有用于生產(chǎn)生物藥物蛋白和肽的高潛能，因為它們易于轉(zhuǎn)化且作為蛋白原材料使用是經(jīng)濟的。迄今為止，大多數(shù)生物藥物是通過轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞、細菌和真菌來生產(chǎn)(Ganz PR等，1996 ；Ma JK等，1999 ；Pen J，1996)。使用植物代替哺乳動物細胞、細菌或真菌生產(chǎn)治療蛋白在經(jīng)濟和質(zhì)量方面有幾個優(yōu)勢其減小通過致病菌污染的風險、增加產(chǎn)率、能在種子或其它貯藏器官中生產(chǎn)。另外，植物具有用于商業(yè)生物藥物生產(chǎn)的巨大潛能，因為植物是用于生產(chǎn)重組產(chǎn)物的經(jīng)濟來源，轉(zhuǎn)基因作物的栽培、收獲、貯藏和處理能利用目前的基礎(chǔ)設(shè)施，且在投入上需要相對低的成本。因此，通過轉(zhuǎn)化植物細胞以高效地生產(chǎn)有用的重組異源蛋白來開發(fā)植物表達系統(tǒng)是非常令人期待的。植物表達系統(tǒng)是吸引人的，因為能通過使用用于將宿主蛋白靶向到細胞器中的固有分選和靶向機制提高重組異源蛋白的表達水平，且植物表達系統(tǒng)也具有大規(guī)模生產(chǎn)植物來源的生物藥物的優(yōu)勢。當使用植物系統(tǒng)生產(chǎn)有用的重組異源蛋白時，物種、組織、表達和回收策略的選擇，及翻譯后加工是決定基于植物生產(chǎn)的可能性的重要因素。近年來，已有很多通過細胞核的轉(zhuǎn)化從植物生產(chǎn)有用蛋白的研究。然而，當大規(guī)模生產(chǎn)有用的蛋白時存在局限性，因為只有一種或少數(shù)基因轉(zhuǎn)入細胞核。另外，存在一些問題當轉(zhuǎn)基因插入異染色質(zhì)區(qū)域時，盡管轉(zhuǎn)入，但轉(zhuǎn)基因不表達，或轉(zhuǎn)導(dǎo)水平可根據(jù)插入位點變化。已進行不同的方法將基因轉(zhuǎn)入線粒體、葉綠體或色素細胞以誘導(dǎo)大規(guī)模表達。在真核生物中，蛋白表達主要是通過在信使RNA水平轉(zhuǎn)錄起始、從DNA到信使RNA轉(zhuǎn)錄的遺傳信息穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄加工和修飾調(diào)節(jié)，和次要通過在蛋白水平翻譯起始和蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)。研究者已關(guān)注通過轉(zhuǎn)化編碼異源蛋白的基因進入細胞后異源蛋白的表達調(diào)節(jié)來提高有用的異源蛋白的產(chǎn)量。已發(fā)展強啟動子以在早期加工中增加蛋白合成，尤其是在轉(zhuǎn)錄步驟期間。為了在轉(zhuǎn)基因植物中有效表達靶基因，必須考慮幾種因素，例如啟動子的選擇、和內(nèi)含子和密碼子使用。當基因轉(zhuǎn)錄物的量增加太多時對轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)可能是有害的。在能增加的轉(zhuǎn)錄量上存在局限性問題。而且，有報導(dǎo)指出大部分通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA不翻譯為蛋白。與轉(zhuǎn)錄步驟的調(diào)節(jié)相比，翻譯步驟的調(diào)節(jié)已知對從基因合成的蛋白的最終量有更多影響。為了大規(guī)模生產(chǎn)有用的異源蛋白，需要在翻譯步驟而非轉(zhuǎn)錄步驟調(diào)節(jié)蛋白表達，且需要新的蛋白表達調(diào)節(jié)技術(shù)將異源蛋白靶向特定細胞器。本發(fā)明人進行了廣泛的研究以開發(fā)通過在翻譯水平增加蛋白合成來從植物大規(guī)模生產(chǎn)有用的異源蛋白的方法。結(jié)果，從擬南芥基因組DNA中發(fā)現(xiàn)一種有高翻譯效率的DNA片段。當用包含該DNA片段的重組載體或用包含與該DNA片段有效連接的用于將多肽靶向ER或葉綠體的前導(dǎo)多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化植物時，增加異源蛋白的翻譯效率。而且，已證實通過使用重組載體分選和穩(wěn)定積累異源蛋白至ER或葉綠體來批量生產(chǎn)異源蛋白是可能的，從而本發(fā)明人完成本發(fā)明。發(fā)明公開內(nèi)容摶術(shù)問是頁因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于提高蛋白翻譯效率的DNA片段。 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種包含所述DNA片段的重組載體。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種用重組載體轉(zhuǎn)化的細胞或植物。本發(fā)明另一個目的在于提供一種用于從植物批量生產(chǎn)異源蛋白的方法，所述方法包括將重組載體引入植物的步驟。技術(shù)方案為達成上述目的，本發(fā)明提供一種用于提高位于下游的異源蛋白翻譯效率的DNA片段，所述 DNA 片段包含具有選自 SEQ ID NO: 1-6、SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和SEQ ID NO 16的任一種核苷酸序列的多核苷酸。并且，本發(fā)明提供包含所述DNA的重組載體，所述DNA包含具有選自SEQ ID NO 1-6、SEQ ID N0:8-10、SEQ ID NO :13和14的任一種核苷酸序列的多核苷酸。在本發(fā)明重組載體的一個方面，所述DNA片段可與啟動子和編碼異源蛋白的多核苷酸有效(operably)連接。在本發(fā)明重組載體的另一個方面，所述DNA片段可與另外的將異源蛋白靶向和保留于植物細胞ER的多核苷酸序列有效連接。在本發(fā)明重組載體的又一個方面，將異源蛋白靶向ER的多核苷酸序列可以是編碼BiP (伴侶分子結(jié)合蛋白)的多核苷酸。編碼BiP的多核苷酸可具有SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列，和用于將異源蛋白保留于ER的多核苷酸序列可以是編碼核苷酸序列肽HDEL (His-Asp-Glu-Leu)或 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)的多核苷酸。在本發(fā)明又一個方面，所述重組載體還可以有效方式包含編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的多核苷酸。編碼CBD的多核苷酸可具有SEQ ID NO 21所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種用重組載體轉(zhuǎn)化的細胞。本發(fā)明還提供一種用重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供一種批量生產(chǎn)異源蛋白的方法，該方法包括將重組載體引入植物的步驟。在本發(fā)明一個方面，將重組載體引入植物使用選自以下的任一種進行農(nóng)桿菌(Agrobacterium sp.)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子槍轟擊、碳化娃晶須、超聲處理、電穿孔和PEG(聚
乙二醇)沉淀。在本發(fā)明另一個方面，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物。在本發(fā)明又一個方面，所述雙子葉植物選自擬南芥、大豆、煙草、茄子、辣椒、土豆、番茄、中國白菜、蘿卜、甘藍、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜和芹菜。在本發(fā)明另一個方面，所述單子葉植物選自水稻、大麥、小麥、黑麥、玉米、甘蔗、燕麥和洋蔥。有利的效果如上所示，本發(fā)明的用于提高翻譯效率的DNA片段和包含該DNA片段的重組載體能提高轉(zhuǎn)基因植物中異源蛋白的翻譯效率。另外，如果將靶向植物的特定細胞器的前導(dǎo)多核苷酸以有效方式進一步加入重組載體，那么異源蛋白靶向該細胞器且能在其中穩(wěn)定積累，從而使能夠從植物批量生產(chǎn)異源蛋白。附圖
簡沭圖Ia是說明用于在擬南芥原生質(zhì)體中表達GFP融合蛋白的重組載體35Sp-UTR(篩選的 SEQ ID NO :1-50) : :GFP 的圖像。
圖Ib是熒光顯微鏡圖像，其顯示通過PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒35Sp_UTR(篩選的UTR NO :1-50) : :GFP引入擬南芥原生質(zhì)體后在擬南芥葉中GFP的表達。圖Ic是蛋白質(zhì)印跡圖像，其使用GFP抗體顯示來自用35Sp-UTR(SEQ ID NO:1-6) : :GFP轉(zhuǎn)化的擬南芥葉的GFP的表達。泳道如下泳道1，對照RbcUTR ;泳道2，5’_UTRNO I (SEQ ID NO: I);泳道3，5’ -UTR NO 2(SEQ ID NO 2);泳道4，5’ -UTR NO 6(SEQ IDNO 3) j}dt5，5’-UTR NO 7(SEQ ID NO :4) j}dt6，5’-UTR NO 24 (SEQ ID :5);和泳道 7，5’ -UTR NO 35(SEQ ID NO :6)。圖2a是蛋白質(zhì)印跡圖像，其使用GFP抗體顯示來自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:7-11) : :GFP轉(zhuǎn)化的擬南芥葉的GFP的表達。泳道如下泳道1，對照RbcUTR ;泳道2，SEQ IDNO 1 ;泳道 3，SEQ ID NO 7 ;泳道 4，SEQ ID NO 8 ;泳道 5，SEQ ID NO 9 ;泳道 6，SEQ ID 10 ;和泳道 7，SEQ ID NO :11。圖2b是蛋白質(zhì)印跡圖像，其使用GFP抗體顯示來自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:12-15) : :GFP轉(zhuǎn)化的擬南芥葉的GFP的表達。泳道如下泳道1，對照RbcUTR ;泳道2，SEQID NO 1 ;泳道 3，SEQ ID NO 12 ;泳道 4，SEQ ID NO 13 ;泳道 5，SEQ ID NO 14 ;和泳道 6，SEQ ID 15o圖2c是蛋白質(zhì)印跡圖像，其使用GFP抗體顯示來自用35Sp_UTR(SEQ ID NO:16) : :GFP轉(zhuǎn)化的擬南芥葉的GFP的表達。泳道如下泳道I表示對照RbcUTR和泳道2表示 UTR SEQ ID NO :16。圖3是一系列免疫印跡圖像，其使用GFP抗體分析在小麥胚芽提取物系統(tǒng)中GFP的表達，以研究用于提高翻譯效率的DNA片段是否具有在單子葉植物中增加蛋白質(zhì)翻譯的效果。圖4是一系列圖像，其說明包含本發(fā)明DNA片段和以有效方式連接的用于靶向ER的信號序列(Bip)或者Bip序列和HDEL序列的重組載體(35Sp_UTR35: :BiP:GFP:HA)和重組載體(35Sp-UTR35: :BiP:GFP:HA:HDEL)。 圖5是一系列熒光顯微鏡圖像，其顯示用重組載體35Sp-UTR35: : BiP: GFP: HA(上方圖板)和重組載體35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:HDEL(下方圖板)轉(zhuǎn)化擬南芥后在ER中GFP的表達。圖6是一系列圖像，其說明重組載體35Sp-UTR35: :BiP:GFP:HA:TEV:CBD和重組載體35Sp-UTR35: : BiP: GFP: HA: TEV: CBD: HDEL包含以有效方式連接的CBD和TEV位點，以在將異源蛋白靶向ER后從植物中合宜地分離異源蛋白。
圖7是免疫印跡圖像，其使用GPF抗體顯示用重組載體35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD 和 35Sp_UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD:HDEL 分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體后在每個時間點的GFP表達水平。圖8是來自用35Sp-UTR35::BiP:GFP:HA:TEV:CBD載體轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體并使用CBD和TEV蛋白酶處理分離 的純化GFP的免疫印跡圖像。圖9是一組用CBD分離和純化GFP蛋白后的考馬斯染色凝膠的圖像，CBD在用35SP-UTR35: : BiP: GFP: HA: TEV: CBD: HDEL載體轉(zhuǎn)化的擬南芥中表達。圖IOa顯示RT-PCR結(jié)果，其使用從轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體分離的RNA和GFP引物以研究本發(fā)明的用于提高翻譯效率的DNA片段是否能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達。圖IOb是免疫印跡圖像，其顯示來自轉(zhuǎn)基因擬南芥的原生質(zhì)體的GFP的表達水平以研究本發(fā)明的用于提高翻譯效率的DNA片段是否能在翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達。實施發(fā)明的最佳方式作為一種用于最大化生產(chǎn)異源蛋白的方法，本發(fā)明人使用5’-非翻譯區(qū)(5’_UTR)的核苷酸序列在翻譯水平控制蛋白表達。一般而言，已知mRNA的5’ -UTR在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、mRNA轉(zhuǎn)運穿過細胞核的調(diào)節(jié)以及蛋白翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中具有重要作用。5’ -UTR也被稱為前導(dǎo)序列，包含在細菌中稱為Shine-Dalgarno序列(AGGAGGU)的核糖體結(jié)合位點(RBS)。5’-UTR的長度為100或更多個核苷酸長度，而3’ -UTR長得多，其長度為數(shù)千堿基。在真核生物中，有報導(dǎo)稱核糖體結(jié)合序列是5’ -UTR的一部分。然而，它們不像Shine-DAlgarno序列具有固定位置，Shine-DAlgarno序列在原核細胞中被稱為5’ -UTR的核糖體結(jié)合位點(Kozak Μ, 1987,Hamilton 等，1987, Yamauchi 等，1991, Joshi 等，1997)。蛋白生產(chǎn)的量取決于mRNA的翻譯效率，因此在基因調(diào)節(jié)中是重要的。5’ -UTR的一般功能是使用起始密碼子的鄰近序列的環(huán)境控制mRNA翻譯。這是用于控制翻譯效率的5，-UTR 的一部分(Xiong W 等，2001 ；Rogozin IB 等，2001 ；Gallie DR 等，1989 ;Mignone F等，2002 ;Kawaguchi R等，2002，2005)。5’-UTR基因的實例是核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISC0)的小亞基(RbcS)。為了找到一種用于提高翻譯效率的方法以增加異源蛋白的生產(chǎn)，對擬南芥全基因組中編碼的5’-UTR序列檢索與核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISC0)小亞基(RbcS)的5’-UTR基因的序列同源性。篩選出具有最高序列相似性的50個序列。為檢測篩選序列的翻譯效率，構(gòu)建5’ -UTR: :GFP結(jié)構(gòu)。通過每個5’ -UTR測量GFP的翻譯效率。結(jié)果表明，篩選的50個序列中，6個5’ -UTR序列顯示出最高的翻譯效率。這些序列由SEQ ID NO 1-6表不。為了研究5’ -UTR核苷酸序列在蛋白翻譯效率中的重要作用，對SEQ ID N0:1的5’ -UTR進行堿基置換誘變。詳細地，SEQ ID NO 1的5’ -UTR的3’ -端的三個核苷酸被胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的連續(xù)堿基置換。另外，產(chǎn)生SEQ ID NOI的5’ -UTR的3’ -端的最后一個堿基被胸腺嘧啶置換的突變序列。而且，通過用兩個胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的連續(xù)序列置換從異源蛋白起始密碼子開始4位或5位的堿基(其也是SEQ ID NO 1的5’ -UTR的3’ -端區(qū))來產(chǎn)生突變序列。而且，通過用胸腺嘧啶置換從SEQ ID NO : I的5’ -UTR的3’ -端開始3位的堿基產(chǎn)生突變序列。對以上突變UTR序列測量翻譯效率。除以下突變序列外，全部蛋白顯示翻譯效率比Rbc的5’ -UTR的翻譯效率更高用連續(xù)的胸腺嘧啶(T)核苷酸置換SEQ ID NO :1的5’-UTR的3’-端的三個堿基的突變序列，3’ -端一個堿基被胸腺嘧啶置換的突變序列，從3’ -端開始3位的堿基被胸腺嘧啶置換的突變序列和從起始密碼子開始4位和5位的堿基被胸腺嘧啶置換的突變序列。此外，根據(jù)以上結(jié)果，研究具有高的蛋白翻譯效率的序列之間的同源性。結(jié)果，檢測到AAG或與AAG類似的序列有高的出現(xiàn)率。因此，本發(fā)明人產(chǎn)生了一種具有AAG重復(fù)的人工序列，其是在SEQ ID NO :1的5’ -UTR的3’ -端的3個核苷酸。蛋白翻譯效率比5’ -UTRRbc對照組高。因此，在篩選的50個5’-UTR序列中，上述顯示高翻譯效率的6個序列和具有高翻、譯效率的突變的5’ -UTR序列各由表4所示的下列SEQ ID NO表示。[表 4]
權(quán)利要求
1.一種用于提高位于下游的異源蛋白的翻譯效率的DNA片段，所述DNA片段包含選自SEQ ID NO :1-6, SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和 SEQ ID NO 16 的任一種核苷酸序列。
2.一種重組載體，其包含用于提高翻譯效率的DNA片段，所述DNA片段包含選自SEQ IDNO :1-6, SEQ ID NO :8_10、SEQ ID NO :13-14 和 SEQ ID NO 16 的任一種核苷酸序列。
3.權(quán)利要求2的重組載體，其中所述DNA片段與啟動子和編碼異源蛋白的多核苷酸有效連接。
4.權(quán)利要求3的重組載體，其中所述DNA片段與另外的用于將異源蛋白靶向或保留于植物細胞ER的多核苷酸有效連接。
5.權(quán)利要求4的重組載體，其中用于將異源蛋白靶向植物細胞ER的多核苷酸是SEQIDNO :18所示的編碼Bip (伴侶分子結(jié)合蛋白)的多核苷酸，和用于保留異源蛋白的多核苷酸是編碼妝 HDEL (His-Asp-Glu-Leu)或 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)的多核苷酸。
6.權(quán)利要求4的重組載體，其中所述DNA片段還以有效方式與SEQID NO 21所示的編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的多核苷酸連接。
7.一種用于從植物批量生產(chǎn)異源蛋白的方法，所述方法包括將權(quán)利要求2-6中任一項的重組載體引入植物的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中將重組載體引入植物使用選自以下的任一種進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子槍轟擊、碳化硅晶須、超聲處理、電穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述植物是雙子葉植物，選自擬南芥、大豆、煙草、茄子、辣椒、土豆、番茄、中國白菜、蘿卜、甘藍、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜和芹菜；或是單子葉植物，選自水稻、大麥、小麥、黑麥、玉米、甘鹿、燕麥和洋蔥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于提高翻譯效率的DNA片段和一種包含該DNA片段的重組載體，更具體地說，涉及一種包含選自序列號1-6、序列號8-10、序列號13-14和序列號16的任一種堿基序列并提高位于下游的靶蛋白的翻譯效率的DNA片段和一種包含該DNA片段的重組載體。本發(fā)明用于提高翻譯效率的DNA片段和包含該DNA片段的重組載體能提高轉(zhuǎn)基因植物中靶蛋白的翻譯。另外，如果還將誘導(dǎo)靶向植物的特定細胞器的標記基因以有效方式加入重組載體中，那么靶蛋白靶向特定細胞器且能穩(wěn)定積累，從而使能夠從植物批量生產(chǎn)靶蛋白。
文檔編號C12N15/11GK102762729SQ201080049654
公開日2012年10月31日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者全恩賢, 孫恩珠, 權(quán)恩惠, 羅允貞, 金容禹, 黃仁煥 申請人:螺線有限公司