專利名稱：用于評(píng)估肝病變的方法
用于評(píng)估肝病變的方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2009年9月11日提交的美國(guó)專利第61/241，709號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用整體并入。
背景技術(shù)：
許多潛在威脅生命的肝疾病影響大部分人群。一個(gè)這樣的實(shí)例是乙型肝炎一由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝傳染病。由于乙型肝炎可能引起慢性肝疾病，最終可導(dǎo)致肝硬化和肝癌，因此其是主要的全球性健康問題和最嚴(yán)重的病毒性肝炎類型。世界范圍內(nèi)估計(jì)有20億人感染了 HBV，并且多于3. 5億人患有慢性肝傳染病，盡管許多是無癥狀的。乙型 肝炎在中國(guó)和亞洲其他地區(qū)是地方流行病。那些地區(qū)的大部分人在童年時(shí)期已感染了 HBV，并且8%至10%的成年人口是慢性感染的。由HBV引起的肝癌處于男性中癌癥三大致死原因的首位，也是女性中癌癥的主要原因。已開發(fā)且在臨床中常規(guī)使用了許多肝功能檢測(cè)。例如，為了評(píng)估肝功能的目的，可檢測(cè)患者血樣的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素或Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)水平。然而，由于肝疾病的流行性和早期檢測(cè)和治療的至關(guān)重要性，尤其是鑒于大部分肝疾病最初僅表現(xiàn)出輕度癥狀的事實(shí)，存在對(duì)可允許早期診斷肝疾病的新的且更靈敏方法的需要。本發(fā)明滿足了這種或其他相關(guān)需要。發(fā)明簡(jiǎn)述—方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)沒有肝疾病指征的個(gè)體中肝疾病的方法，所述個(gè)體例如從來沒有異常的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)結(jié)果的人。所述方法包括以下步驟(a)測(cè)定取自所述個(gè)體的無細(xì)胞血樣中白蛋白mRNA的量或濃度；以及(b)將步驟(a)的白蛋白mRNA的量或濃度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相比時(shí)，步驟(a)得到的蛋白mRNA的量或濃度增加表示個(gè)體中存在肝疾病。反之，步驟(a)得到的蛋白mRNA的量或濃度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照基本相同，認(rèn)為所述個(gè)體沒有肝疾病。在一些實(shí)施方案中，受檢測(cè)的個(gè)體是沒有肝疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的人。待檢測(cè)的肝疾病的一些實(shí)例包括脂肪肝疾病如非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝纖維化或肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)。其他實(shí)例包括威爾森氏癥、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏癥或糖原貯積病。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明方法檢測(cè)的肝疾病名單中不包括肝細(xì)胞癌，特別是肝移植患者中出現(xiàn)的肝細(xì)胞癌。在一些實(shí)施方案中，無細(xì)胞血樣是血漿。在其他實(shí)施方案中，無細(xì)胞血樣是血清。在所要求保護(hù)方法的一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括擴(kuò)增白蛋白mRNA序列，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，包括反轉(zhuǎn)錄酶(RT) -PCR、數(shù)字PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR。在其他實(shí)施方案中，步驟(a)包括質(zhì)譜分析或與微陣列、熒光探針或分子信標(biāo)雜交。在一些情況下，所要求保護(hù)的方法還可以包括在稍后時(shí)間利用來自所述個(gè)體的同一類型的無細(xì)胞血樣重復(fù)步驟(a)(例如步驟(a)使用血清樣品時(shí)，重復(fù)步驟使用另一血清樣品)。當(dāng)原步驟(a)得到的量或濃度已表明存在肝疾病時(shí)，與原步驟(a)相比，在稍后時(shí)間(即從重復(fù)的步驟(a)得到的)白蛋白mRNA的量或濃度增加表示肝疾病的惡化，而降低則表示肝疾病的改善。同樣，所要求保護(hù)的方法還可以包括，當(dāng)原步驟(a)得到的白蛋白mRNA的量或濃度表示沒有肝疾病時(shí)，在稍后時(shí)間利用來自所述個(gè)體的同一類型的無細(xì)胞血樣重復(fù)步驟(a)。與原步驟(a)相比，在稍后時(shí)間(即重復(fù)的步驟(a))的白蛋白mRNA的量或濃度增加，表示出現(xiàn)肝疾病，而基本上沒有差異則表示沒有肝疾病的生理狀況。所要求保護(hù)的方法常常以至少I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差從標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照增加或降低。在其他情況下，從標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照這樣的增加或降低可以為至少2、甚至3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。另一方面，本發(fā)明提供了用于診斷沒有肝疾病指征的個(gè)體或沒有肝疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的人中肝疾病的試劑盒。所述試劑盒包含這些成分(I)提供健康個(gè)體血樣中白蛋白mRNA 平均量或濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；以及(2)用于特異性擴(kuò)增至少一部分白蛋白mRNA的兩種寡核苷酸引物。一般而言，試劑盒還包含輔助使用者實(shí)施本發(fā)明方法的說明手冊(cè)。試劑盒還可以包含與白蛋白編碼序列特異性雜交的多核苷酸探針。在又一方面，本發(fā)明還可以體現(xiàn)于包括裝置或包括一個(gè)或多個(gè)這樣的設(shè)備的系統(tǒng)，所述裝置能夠?qū)嵤┍疚乃龅娜炕虿糠址椒ú襟E。例如，在一些情況下，裝置或系統(tǒng)在接收取自受檢測(cè)個(gè)體的無細(xì)胞血樣以檢測(cè)可能存在的肝疾病或監(jiān)測(cè)肝狀況變化時(shí)，進(jìn)行以下步驟(a)測(cè)定樣品中白蛋白mRNA的量或濃度；(b)將所述量或濃度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照值進(jìn)行比較；以及(c)提供表示所述個(gè)體中是否存在肝疾病變，或者所述個(gè)體的肝狀況是否有變化(即惡化或改善)的輸出結(jié)果。在其他情況下，已進(jìn)行步驟(a)且已將步驟(a)的量或濃度輸入設(shè)備之后，本發(fā)明的裝置或系統(tǒng)執(zhí)行步驟(b)和(c)的任務(wù)。優(yōu)選地，裝置或系統(tǒng)是部分或完全自動(dòng)化的。在實(shí)施本發(fā)明以上提及的任何方面時(shí)，接受利用本發(fā)明的方法或試劑盒或裝置或系統(tǒng)進(jìn)行的檢測(cè)的人，可以是沒有肝疾病指征的人，或是無已知肝疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的人，或是已接受肝移植且通過常規(guī)檢測(cè)未顯示肝異常癥狀的人。在一些情況下，本發(fā)明實(shí)施中不包括肝移植后的患者，所述患者以前患有肝細(xì)胞癌且肝移植之后肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)。附圖簡(jiǎn)要說明圖I.是血漿ALB mRNA濃度的箱形圖。箱形的上下限和穿過箱形的線分別指示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)及中位數(shù)。晶須帽(whisker cap)表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。虛線表示通過ROC分析產(chǎn)生的檢測(cè)肝病變的截止值(835拷貝/mL)。HCC :肝細(xì)胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。圖2.是用于通過血漿ALB mRNA定量檢測(cè)肝病變的接收者工作特征曲線。圖3.是血漿ALB mRNA和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度之間的相關(guān)性。HCC :肝細(xì)胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。圖4.是肝細(xì)胞癌患者的血漿ALB mRNA和血清甲胎蛋白之間的相關(guān)性。插圖圈出那些具有甲胎蛋白(AFP) < 20u g/L但血漿ALB mRNA濃度> 835拷貝/mL的患者。圖5.是對(duì)ALB SNP、rs962004進(jìn)行基因分型獲得的質(zhì)譜圖。SNP等位基因通過延伸產(chǎn)物分子質(zhì)量的差異來分辨。分別代表未延伸的引物、延伸的A和G等位基因的峰值位置如標(biāo)記所示。X-軸表示了以道爾頓測(cè)量的質(zhì)量，而y-軸表示以任意單位測(cè)量的離子電流強(qiáng)度。hME分析可以應(yīng)用于DNA和RNA產(chǎn)物的基因分型。對(duì)于A-等位基因是純合的且對(duì)于G-等位基因是雜合的和純合的樣品，分別顯示在上圖、中圖和下圖。圖6.是血漿ALT未升高的參與者的血漿ALB mRNA濃度的箱形圖。箱形上下限和穿過箱形的線分別指示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)和中位數(shù)。晶須帽表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。虛線表示通過ROC分析所產(chǎn)生的的檢測(cè)肝病變的截止值(835拷貝/mL)。HCC :肝細(xì)胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。圖7.是用于血漿ALT未升高的個(gè)體中通過血漿ALB mRNA頂兒檢測(cè)肝病變的接收者工作特征曲線。圖8.是健康對(duì)照和血漿ALT未升高的肝移植后受體的血漿ALB mRNA濃度的箱形圖。箱形的上下限和穿過箱形的線分別表示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)和中位數(shù)。晶須帽表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。虛線表示如圖I和圖6所用的用于檢測(cè)肝病變的截止值(835拷貝/mL)。
圖9.是顯示登記時(shí)穩(wěn)定組和不穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA濃度的箱形圖。箱形的上下限和穿過箱形的線分別表示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)和中位數(shù)。晶須帽表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。835拷貝/mL的血漿ALB mRNA截止值以點(diǎn)線表示。

圖10.是在整個(gè)研究期間對(duì)(A)穩(wěn)定組和(B)不穩(wěn)定組中的受體采集的血樣的血漿ALB mRNA濃度。穩(wěn)定和不穩(wěn)定受體的血漿ALB mRNA水平分別以具有虛線的空心符號(hào)和具有實(shí)線的實(shí)心符號(hào)表示。835拷貝/mL的血漿ALB mRNA截止值水平以點(diǎn)線表示。圖11.是患有急性肝并發(fā)癥的受體的血漿ALB mRNA和ALT的連續(xù)測(cè)量。圖A-F是對(duì)不同患者進(jìn)行的連續(xù)測(cè)量數(shù)據(jù)，每一數(shù)據(jù)代表一名患者。血漿ALB mRNA濃度以具有實(shí)線的實(shí)圈顯示，而ALT活性水平以具有虛線的空圈顯示。835拷貝/mL的血漿ALB mRNA截止值水平以點(diǎn)線表示。圖12.是患有慢性肝并發(fā)癥的受體中血漿ALB mRNA和ALT的連續(xù)測(cè)量。圖A-D是對(duì)不同患者進(jìn)行的連續(xù)測(cè)量數(shù)據(jù)，每一數(shù)據(jù)代表一名患者。血漿ALB mRNA濃度以具有實(shí)線的實(shí)圈顯示，而ALT活性水平以具有虛線的空圈顯示。835拷貝/mL的血漿ALB mRNA截止值水平以點(diǎn)線表示。圖13.是患有脂肪肝疾病的病例和健康對(duì)照的血漿ALB mRNA濃度。箱形的上下限和穿過箱形的線分別表示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)和中位數(shù)。晶須帽表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。圖14.是通過肝活檢(Bx)診斷為患有脂肪肝疾病的病例，或通過磁共振波譜成像(MRI)診斷為患有脂肪肝疾病的病例和健康對(duì)照的血漿ALB mRNA濃度。箱形的上下限和穿過箱形的線分別表示第75個(gè)和第25個(gè)百分點(diǎn)和中位數(shù)。晶須帽表示第90個(gè)和第10個(gè)百分點(diǎn)。異常值顯示為空圈。NAFLD :非酒精性脂肪肝病。圖15.是圖14所示個(gè)體的血楽;ALT活性-濃度。虛線表示參考截止值。Bxjg檢；MRI :磁共振波譜成像；NAFLD :非酒精性脂肪肝病。定義本申請(qǐng)中所用的術(shù)語“肝疾病”是指改變患者的正常肝功能的任何事件或狀況，其在患者一生中任意時(shí)間長(zhǎng)度出現(xiàn)癥狀。肝疾病的一些實(shí)例包括肝癌、肝硬化、肝纖維化、月旨肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝中毒或機(jī)械損傷、病毒或細(xì)菌傳染病例如各種類型的肝炎(例如甲型、乙型或丙型肝炎)、威爾森氏(Wilson)癥、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏癥或糖原貯積病。在一些情況下，為了本申請(qǐng)的目的，肝細(xì)胞癌可從待診斷的肝疾病中排除。肝疾病通常根據(jù)發(fā)病持續(xù)時(shí)間再分為急性或慢性。一般而言，持續(xù)超過三個(gè)月的病癥被認(rèn)為是慢性肝疾病，而那些持續(xù)少于三個(gè)月的病癥被認(rèn)為是急性肝疾病。急性肝疾病，如由肝病毒或缺血損傷引起的急性肝炎，通常突然出現(xiàn)但常常與正常肝功能完全恢復(fù)相關(guān)。另一方面，慢性肝疾病通常不知不覺地出現(xiàn)且進(jìn)程緩慢，但是很少恢復(fù)到完全正常的肝功能。由于肝疾病具有不同的潛在原因和臨床癥狀，有許多不同的方法用于診斷這些肝疾病。常規(guī)方法通常包括常規(guī)分析血清生化標(biāo)志物以評(píng)估丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素或Y _谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)水平。可選擇地，使用通過超聲、CT掃描或MRI的肝膽系統(tǒng)成像來檢測(cè)肝結(jié)構(gòu)上的異常。當(dāng)前不知道患者任何那些異常的人，或在過去的任何時(shí)間中從未被診斷患有慢性肝疾 病的人，或已知已從以前的急性肝疾病中恢復(fù)的人，是“沒有肝疾病指征的個(gè)體”。這樣的人的一個(gè)實(shí)例是，當(dāng)前預(yù)期沒有異常丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)結(jié)果的人，因?yàn)樵谶^去這個(gè)人從未有異常ALT檢測(cè)結(jié)果，或最近的急性肝損傷之后ALT恢復(fù)到正常水平。由于某些肝炎病毒如HBV的攜帶者可能是無癥狀的，并且明顯的肝細(xì)胞損傷沒有達(dá)到通過常規(guī)肝功能檢測(cè)引起任何可檢測(cè)的異常的程度，已知是任何一種這樣的病毒的攜帶者但從未有異常肝功能檢測(cè)結(jié)果的人，也被認(rèn)為是“沒有肝疾病指征的個(gè)體”。不僅沒有肝疾病指征，而且沒有直系親屬(父母或兄弟姐妹)具有肝疾病指征的人被認(rèn)為是沒有肝疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的人。內(nèi)科專業(yè)人員常規(guī)采用ALT檢測(cè)。如果一個(gè)人發(fā)現(xiàn)肝疾病癥狀，包括黃疸(淡黃色的皮膚或眼睛)、小便黃赤、反胃、嘔吐或腹痛，通常被要求進(jìn)行ALT檢測(cè)。為輔助診斷肝傳染病如病毒性肝炎或監(jiān)測(cè)服用引起肝相關(guān)副作用的藥物的患者，也被要求進(jìn)行ALT測(cè)試。血液中ALT水平的正常范圍是5IU/L至60IU/L(國(guó)際單位/升)。AST水平的正常范圍是5IU/L 至 43IU/L。本文所使用的術(shù)語“血液”是指用于檢測(cè)可能的肝疾病或用于評(píng)估個(gè)體的肝生理狀況的來自個(gè)體的血樣或制劑。“無細(xì)胞血樣”是指全血中存在的全部細(xì)胞至少95%被去除的血液的任何部分，并且包含常規(guī)定義的諸如血清和血漿的部分。獲自不同的個(gè)體或在不同的時(shí)間點(diǎn)按照相同的處理步驟獲自同一個(gè)體的血樣，被稱為“同一類型的血樣”。術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特別限定，該術(shù)語包含含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸相似的結(jié)合特性，并且以與天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另外指明，特定的核酸序列還暗含其保守的修飾變體(例如簡(jiǎn)并密碼子置換)、等位基因、直系同源物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和互補(bǔ)的序列，以及明確指明的序列。具體而言，簡(jiǎn)并密碼子置換可通過產(chǎn)生這樣的序列來實(shí)現(xiàn)在所述序列中，用混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基置換其中一個(gè)或多個(gè)所選擇的(或全部)密碼子的第三位(Batzeret al. ,NucleicAcid Res. 19 :5081(1991) ；0htsuka et al.，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；以及Rossolini et al. , Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語核酸可與基因、cDNA 和由基因編碼的mRNA交換使用。術(shù)語“基因”意指與產(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA區(qū)段；其包括與基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄/翻譯和轉(zhuǎn)錄/翻譯的調(diào)控相關(guān)的編碼區(qū)的前后區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和尾區(qū))，以及單獨(dú)的編碼區(qū)段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
在本申請(qǐng)中，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交換使用，指氨基酸殘基的聚合物。將該術(shù)語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所使用，該術(shù)語包含任意長(zhǎng)度的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白(即抗原)，其中的氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵相連接。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及隨后得到修飾的那些氨基酸，如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸在本文中還可通過常用的三字母符號(hào)或通過由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸可以通過它們的常用單字母代碼表示。 本申請(qǐng)中所使用的“增加”或“降低”是指與已確定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照有數(shù)量上可檢出的正或負(fù)差異。增加是正差異優(yōu)選是對(duì)照值的至少2-倍，更優(yōu)選至少5-倍，以及最優(yōu)選至少10-倍。同樣，減少是負(fù)差異，優(yōu)選是對(duì)照值的至少50 %，更優(yōu)選至少80 %，以及最優(yōu)選至少90%。表示與比較基準(zhǔn)有差異或不同的其他術(shù)語，如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”在本申請(qǐng)中與以與上文所述相同的方式使用。相反地，術(shù)語“基本相同”或“基本沒有差異”表示與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照值在數(shù)量上很少至沒有差異，一般在標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的±10%之內(nèi)，或±5%、±2%、甚至與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照有更小的變化。本文所使用的“多核苷酸雜交方法”是指基于在適當(dāng)?shù)碾s交條件下多核苷酸與已知序列的多核苷酸探針形成Watson-Crick堿基配對(duì)的能力來檢測(cè)所述多核苷酸的存在和/或數(shù)量的方法。這樣的雜交方法實(shí)例包括Southern印記和Northern印記。本文所使用的“引物”是指可用來諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增方法中，基于對(duì)應(yīng)于目的基因如白蛋白編碼序列的多核苷酸序列擴(kuò)增核苷酸序列的寡核苷酸。至少一種用于多核苷酸序列擴(kuò)增的PCR引物對(duì)于該序列來說是序列特異性的。本文所使用的術(shù)語“數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是指常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法的精確形式，其可用于直接定量并克隆擴(kuò)增包括DNA、cDNA或RNA在內(nèi)的核酸，使得靶核酸的量可以被直接定量測(cè)量。數(shù)字PCR通過在許多獨(dú)立的能夠定位和擴(kuò)增產(chǎn)物并將其濃縮至可檢出水平的反應(yīng)室中捕獲或分離樣品中存在的每一單獨(dú)的核酸分子來實(shí)現(xiàn)這種直接定量測(cè)量。PCR擴(kuò)增之后，計(jì)數(shù)含有PCR終端產(chǎn)物的小室是直接測(cè)量絕對(duì)核酸量。捕獲或分離單獨(dú)的核酸分子，一般通過稀釋的方式，可在毛細(xì)管、微乳液、小型化室的陣列中或在核酸結(jié)合表面來實(shí)現(xiàn)。數(shù)字PCR的基本方法描述于例如Sykes et al. ,Biotechniques 13(3)444-449,1992)中。在本文中使用的術(shù)語“分子計(jì)數(shù)”是指允許定量測(cè)量分子或分子復(fù)合物的數(shù)量，在上下文中通常是不同特征的其他共存分子或復(fù)合物的相對(duì)數(shù)量的任何方法。分子計(jì)數(shù)的各種方法描述于，例如 Leaner et al. Analytical Chemistry 69:2115-2121,1997;Hiranoand Fukami, Nucleic Acids Symposium Series No. 44 :157-158,2000 ;Chiu etal. , Trends in Genetics 25 :324-331, 2009 ;以及美國(guó)專利號(hào) 7，537，897 中。本文所使用的“標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照”是指存在于已確定的樣品如無細(xì)胞血樣中的預(yù)先定量的多核苷酸序列如白蛋白mRNA。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照值適合用于本發(fā)明的方法中，以用作比較檢測(cè)樣品中存在的白蛋白mRNA的量的基礎(chǔ)。用作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的已確立的樣品提供對(duì)于沒有如常規(guī)定義的任何肝疾病的普通健康人的特定血樣(特別是無細(xì)胞血樣，如血清或血漿)來說典型的白蛋白mRNA的平均量。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照值可以隨樣品性質(zhì)以及其他因素如個(gè)體(這種對(duì)照值是基于該個(gè)體而確立的)的性別、年齡、種族而變化。上下文中所使用的描述健康、沒有如常規(guī)定義的任何肝疾病的人的術(shù)語“平均值”是指某些特征，尤其是人血液或血液的任何非細(xì)胞部分如血清或血漿中存在的白蛋白mRNA的量，其代表沒有任何肝病變的隨機(jī)選擇的一組健康人群。所選擇的組應(yīng)當(dāng)包括足夠數(shù)量的人，使得這些個(gè)體的血液或血液部分中的白蛋白mRNA的平均量以合理的精確性反映出總的健康人群中相應(yīng)的白蛋白mRNA含量。此外，所選擇的一組人的年齡通常與其血樣受檢測(cè)潛在的肝病癥指征的個(gè)體年齡相似。實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選年齡可以因篩選的肝疾病/失調(diào)而變化。此外，同樣要考慮其他因素，如性別、種族，還考慮病史，且病史優(yōu)選在檢測(cè)個(gè)體的特征與所選擇確立“平均值”的個(gè)體組之間緊密匹配。本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“量”是指樣品中存在的目的多核苷酸序列如白蛋白mRNA的量。這樣的量可以表示為絕對(duì)數(shù)，即樣品中多核苷酸序列的總量，或相對(duì)數(shù)，即樣品中多 核苷酸序列的濃度。發(fā)明詳述I 引言分析血漿中的循環(huán)核酸，為各種生理和病理癥狀的非侵入性監(jiān)測(cè)提供了方法(Loet al. ,Ann N Y Acad Sci 2004 ；1022 :135-139 ;Chan等，Ann Clin Biochem 2003 ；40 122-30)。已報(bào)道了許多基于檢測(cè)人血漿循環(huán)中的無細(xì)胞核酸的申請(qǐng)，應(yīng)用的范圍是用于管理惡性腫瘤(Anker et al. , Int J Cancer 2003 ；103 :149-52)、妊娠相關(guān)病癥(Lo et al.，Nat Rev Genet 2007 ；8 :71_7)、器官移植(Lo et al. ,Lancet 1998 ；351 :1329-30)及外傷(Lo et al. ,Clin Chem 2000 ；46 :319-23 ；Chiu et al. ,Acta Neurochir Suppl 2005 ；95 471-4)。支持這些申請(qǐng)的基本原理涉及源自患病器官的細(xì)胞外核酸分子的血漿檢測(cè)。通過循環(huán)DNA分析可開發(fā)疾病特異性遺傳標(biāo)記，其包括檢測(cè)疾病相關(guān)病原體(Chan et al. ,ClinChem 2005 ；51 :2192-5)、疾病特異性突變、胎兒與其母親之間或者移植供體與受體之間的性別和多態(tài)性差異。除了循環(huán)DNA，無細(xì)胞血漿RNA分析為開發(fā)病理學(xué)相關(guān)標(biāo)志物提供了另一種機(jī)會(huì)(Lo et al. ,Ann N Y Acad Sci 2004 ；1022 135-139 ；Anker et al. ,Clin Chem 2002 ；48 1210-1)?？梢园卸ㄆ鞴倩蚣膊√赜械谋磉_(dá)譜，作為用于血漿檢測(cè)的特異性核酸標(biāo)記。已從具有用于疾病評(píng)估潛力的血衆(zhòng)中成功檢測(cè)了源自腫瘤(Chen et al. , Clin Cancer Res
2000；6 :3823-6)和源自胎盤(Ng et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003 ；100 :4748-53)的RNA種類(Ng等，Clin Chem 2003 ；49 :727-31)。本發(fā)明人探討了檢測(cè)源自肝的循環(huán)mRNA用于評(píng)估肝病變的可能性。有許多證據(jù)表明，細(xì)胞死亡時(shí)釋放循環(huán)DNA和RNA(Jahr et al. , Cancer Res
2001；61 :1659-65)。由于白蛋白是人體最豐富的蛋白且通過肝合成，本發(fā)明人推測(cè)人血漿的ALB mRNA是可檢測(cè)的并且可能是肝病變的靈敏標(biāo)志物。實(shí)際上，以前研究報(bào)道了檢測(cè)人類個(gè)體的外周全血和外周單核細(xì)胞部分的ALB mRNA(Hillaire et al. ,Gastroenterology
1994；106 :239-42 ；Kar et al. ,Hepatology 1995 ；21 :403-7 ；Muller et al. ,Hepatology1997；25 :896-9 ；Barbu et al.，Hepatology 1997 ；26 :1171-5 ；Gion et al.，Hepatology
1998；28 :1663-8 ；Peck-Radosavljevic et al. , Liver Transplant Oncology Group. JHepatol 1998 ；28 :497-503 ；Wong et al.，Br J Cancer 1997 ；76 :628-33 ；Wong et al.，Cancer Lett 2000 ；156 :141-9 ；Basti das-Ramirez et al.，Hepatol Res 2002 ；24 265.11)。然而，這些研究報(bào)道了具有來自患有肝細(xì)胞癌(HCC)、肝硬化、肝炎的患者與健康對(duì)照的血液ALB mRNA的檢測(cè)率低于100%的成功混合水平。最近Yet，Kudo et al.，(J VetMed Sci 2008;70:993-5)報(bào)道了血漿ALB mRNA濃度的存在及其與大鼠肝損傷的相關(guān)性。血細(xì)胞能夠“不正常地”轉(zhuǎn)錄已知主要由其他細(xì)胞類型表達(dá)的基因(Lambrechtset al. ,Ann Oncol 1998 ;9 :1269-76)，而且本發(fā)明人以前已證實(shí)血細(xì)胞是血漿核酸的主要貢獻(xiàn)者(Lui et al. ,Clin Chem 2002 ;48 :421-7)。因而發(fā)明人的首要目的是確定血漿或全血ALB mRNA是否源自肝，其次，在證實(shí)血漿ALB mRNA的肝來源之后，確定是否可以檢測(cè)各 種肝病變的定量畸變。為了實(shí)現(xiàn)第一個(gè)目的，使用以前描述的RNA-單核苷酸多態(tài)性(SNP)策略(Lo et al.，Nat Med 2007 ；13 :218-23 ；Chan et al.，Clin Chem 2007 ；53 :1874-6)來對(duì)從供體移植肝或骨髓的受體循環(huán)系統(tǒng)中存在的ALB mRNA分子進(jìn)行基因分型，所述供體對(duì)于所靶定的編碼SNP的ALB在基因型上不同。II. 一般方法利用分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來實(shí)施本發(fā)明。公開了本發(fā)明中使用的一般方法的基礎(chǔ)教科書包括Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，(2rd ed. 2001 (第 3 版，2001)) ； (Kriegler, Gene, Transfer andExpression A Laboratory Manual (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)指南)(1990);以及 CurrentProtocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，(Ausubel et al. , eds.,1994)。對(duì)于核酸，其大小以千堿基(kb)或堿基對(duì)(bp)給出。這些通過瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、已測(cè)序核酸或已公開DNA序列來估計(jì)。對(duì)于蛋白，其大小以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)量給出。通過凝膠電泳、已測(cè)序蛋白、衍生的氨基酸序列或已公開蛋白序列來估計(jì)蛋白大小。不能商購獲得的寡核苷酸可以根據(jù)例如Beaucageand Caruthers, TetrahedronLett. 22 :1859-1862(1981))首次描述的固相亞磷酰胺三酯法，使用Van Devanter et al.，Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168 (1984)所述的自動(dòng)合成儀化學(xué)合成。寡核苷酸的純化使用任何領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)可的方法如Pearson and Reanier, J. Chrom. 255 137-149 (1983)所述的非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換高效液相色譜法(HPLC)。 本發(fā)明中使用的遺傳標(biāo)志物序列或基因組序列，例如白蛋白基因的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸(如引物)，可以使用例如Wallace et al.，Gene 16 :21-26(1981))的雙鏈模板測(cè)序的鏈終止法來驗(yàn)證。III.血樣的獲得和mRNA的提取本發(fā)明涉及分析存在于人血液中，尤其是非細(xì)胞血樣中的白蛋白mRNA的量，作為檢測(cè)肝疾病或失調(diào)的存在和/或監(jiān)測(cè)肝疾病或病癥進(jìn)程的非侵入性手段。因而，實(shí)施本發(fā)明的第一步是從受測(cè)試的個(gè)體獲得血樣，并從所述樣品提取mRNA。A.血樣的獲得
血樣獲自待利用本發(fā)明的方法檢測(cè)或監(jiān)測(cè)肝病癥或并病癥的人。根據(jù)醫(yī)院或門診通常遵循的標(biāo)準(zhǔn)方案從個(gè)體采集血液。采集適當(dāng)量的外周血，例如一般為5-50ml，在進(jìn)一步制備之前可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序保存。B.血樣的制各根據(jù)本發(fā)明分析患者的血樣中存在的白蛋白mRNA可以利用例如全血或更經(jīng)常是非細(xì)胞樣品如血清或血漿進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備來自母系血液的血清或血漿的方法。例如，可將個(gè)體的血液放在含有EDTA的管或?qū)I(yè)商品如Vacutainer SST(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)中以防止血液凝結(jié),并且接著通過離心可從全血中獲得血漿。另一方面，離心后或未離心(血液凝結(jié)之后)可獲得血清。如果接著使用離心，盡管并非專用，一般在適當(dāng)速度，如1，500-3，000 X g下進(jìn)行。在被轉(zhuǎn)移到新的管子用于RNA提取之前，血漿或血清可以進(jìn)行額外的離心步驟。從全血中產(chǎn)生非細(xì)胞樣品的任何其他方法同 樣適用本發(fā)明的目的，只要所述方法產(chǎn)生基本上不含細(xì)胞的無細(xì)胞血樣，例如已去除全血樣品中原始存在的全部細(xì)胞的至少90%、95%、98%或99%或更多。C. RNA的提取和定量有許多從生物樣品中提取mRNA的方法?？梢圆捎弥苽鋗RNA的一般方法(例如Sambrookand Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)3d ed. ,2001);還可以使用各種商購試劑或試劑盒來從來自女性檢測(cè)個(gè)體的生物樣品中獲得mRNA,所述商購試劑或試劑盒如Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)、01igotexDirect mRNA 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)、RNeasy 微型試劑盒(Qiagen, Hilden,Germany)以及 PolyATtract Series 9600 (Promega, Madison, WI) 還可以使用這些方法中的一種以上的組合。重要的是應(yīng)當(dāng)從RNA制備物中除去全部污染DNA。因而，必需小心處理樣品，用DNase完全處理，以及在擴(kuò)增和定量步驟中使用合適的陰性對(duì)照。I.基于PCR定量測(cè)定mRNA水平一旦從樣品中提取了 mRNA，可以定量白蛋白mRNA的量。用于測(cè)定mRNA水平的優(yōu)選方法是基于擴(kuò)增的方法，如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在擴(kuò)增步驟之前，必須合成白蛋白mRNA的DNA拷貝(cDNA)。這通過反轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)，其可以作為單獨(dú)的步驟進(jìn)行，或者以同源反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)行，所述RT-PCR是一種改進(jìn)的擴(kuò)增RNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。適合于核糖核酸的PCR擴(kuò)增的方法描述于 Romeroand Rotbart, Diagnostic Molecular Biology !Principles andApplications (診斷分子生物學(xué)原理和應(yīng)用)，pp. 401-406 ；Persing et al.，eds.，MayoFoundation, Rochester, MN, 1993 ；Egge et al.，J. Clin. Microbiol. 33 1442-1447,1995 ；以及美國(guó)專利號(hào)5，075，212中。PCR的一般方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，因而在此不詳述。對(duì)于PCR方法、方案及引物設(shè)計(jì)原理的綜述，參見例如 Innis et al.，PCR Protocols A Guide to Methods andApplications (PCR 手冊(cè)方法和應(yīng)用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.，1990)。PCR 試劑和方案還可獲自商業(yè)供應(yīng)商，如Roche Molecular Systems。PCR最常作為自動(dòng)化過程與熱穩(wěn)定酶一起進(jìn)行。在該過程中，反應(yīng)混合物的溫度通過變性區(qū)、引物退火區(qū)和延長(zhǎng)反應(yīng)區(qū)自動(dòng)循環(huán)。為此而具體采用的裝置可商購獲得。
雖然靶mRNA的PCR擴(kuò)增一般用于實(shí)施本發(fā)明，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，擴(kuò)增母系血樣中的這些mRNA種類可以通過任何已知的方法來完成，所述方法如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增以及自主序列復(fù)制或依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，它們各自提供充分?jǐn)U增。最近開發(fā)的分支DNA技術(shù)也可以用于定量測(cè)定母系血液中mRNA標(biāo)志物的量。對(duì)于用于臨床樣品的核酸序列的直接定量的分支DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)的綜述參見Nolte，Adv.Clin. Chem. 33 :201-235,1998。2.其他定量方法白蛋白mRNA還可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來檢測(cè)。雖然檢測(cè)步驟之前一般是擴(kuò)增步驟，但是在本發(fā)明的方法并不需要擴(kuò)增的。例如，無論之前是否有擴(kuò)增步驟，mRNA可以通過大小分級(jí)(例如凝膠電泳)來鑒定。根據(jù)已知技術(shù)，在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中跑樣品并用溴化乙錠標(biāo)記(參見例如Sambrook and Russell,同上)之后，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照大小相同的條帶的出現(xiàn)表示存在靶mRNA，其量可基于條帶的密度與對(duì)照進(jìn)行比較。可選擇地，可使用對(duì)白蛋白mRNA具有特異性的寡核苷酸探針來檢測(cè)這樣的mRNA種類的存在，并且基于由探針賦予的信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較來表示mRNA的量。 序列特異的探針雜交是檢測(cè)包含其他核酸種類的特定核酸的一種已知方法。在足夠嚴(yán)格的雜交條件下，探針僅與基本上互補(bǔ)的序列特異地雜交。雜交條件嚴(yán)格的性可放寬到容許不同量的序列錯(cuò)配。本領(lǐng)域內(nèi)熟知許多雜交形式，包括但不僅限于液相、固相或混合相雜交檢測(cè)。以下文獻(xiàn)提供了各種雜交檢測(cè)形式的綜述Singer et al. , Biotechniques 4:230,1986;Haase et al. , Methods in Virology, 189-226 頁，1984 ;In situ Hybridization(原位雜交)，Wilkinsoned., IRL Press, Oxford University Press, Oxford ;以及 Hames andHigginseds. , Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach (核酸雜交應(yīng)用方法)，IRL Press，1987。根據(jù)熟知技術(shù)檢測(cè)雜交復(fù)合物。能夠與靶核酸即mRNA或所擴(kuò)增的DNA特異性雜交的核酸探針可通過幾種常用來檢測(cè)所雜交核酸的存在的方法中的任何一種來標(biāo)記。一種常用的檢測(cè)方法是使用利用3H、125I、35S、14C或32P等標(biāo)記的探針的放射自顯影法。放射性同位素的選擇取決于所選擇同位素的易于合成、穩(wěn)定性及半衰期所致的研究偏好。其他標(biāo)志物包括化合物(例如生物素和地高辛)，其與用熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶標(biāo)記的抗配體(antiligand)或抗體結(jié)合。可選擇地,探針可直接與諸如突光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑或酶的標(biāo)志物軛合。標(biāo)志物的選擇取決于所要求的靈敏度、易于與探針軛合、穩(wěn)定性要求以及可利用的儀器。用于實(shí)施本發(fā)明必需的探針和引物可利用熟知的技術(shù)合成和標(biāo)記。用作探針和引物的寡核苷酸可以根據(jù) Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. , 22 :1859-1862，1981首次描述的固相亞憐酸胺三酯法，利用Needham-VanDevanter et al.，NucleicAcids Res. 12 :6159-6168,1984所述的自動(dòng)合成儀化學(xué)合成。寡核昔酸通過Pearson andRegnier, J. Chrom. , 255 :137-149,1983所述的非變性丙烯酰胺凝膠電泳或通過離子交換HPLC純化。IV.確定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為了確定用于實(shí)施本發(fā)明方法的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，首先選擇一組沒有如常規(guī)定義的任何肝疾病的健康人。為了利用本發(fā)明的方法篩選和/或監(jiān)測(cè)諸如肝硬化、肝纖維化、肝炎等肝病癥或肝疾病的目的，若適用的話，這些個(gè)體在適當(dāng)?shù)膮?shù)范圍內(nèi)。任選地，這些個(gè)體性別的相同、年齡相似或種族背景相似。所選擇個(gè)體的健康狀況通過已確定的常規(guī)使用的方法來證實(shí)，所述常規(guī)使用的方法包括但不限于個(gè)體的常規(guī)體檢及其病史的總體評(píng)價(jià)。此外，所選擇的一組健康個(gè)體必需有適當(dāng)?shù)捏w重，使得獲自該組的血液中的白蛋白mRNA平均量/濃度可合理地被認(rèn)為代表一般的健康人群的正?；蚱骄?。優(yōu)選地，所選擇群體包括至少10名人類個(gè)體。一旦基于所選擇健康對(duì)照組中每一名個(gè)體中存在的個(gè)體值確定了白蛋白mRNA的平均值，則該平均值或中位數(shù)或代表值或分布就被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在同一過程中還測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一些情況下，對(duì)具有諸如年齡、性別或種族背景的不同特征而分開限定的組可以確定單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。V.試劑盒本發(fā)明提供了用于實(shí)施本文所述方法以評(píng)估個(gè)體的肝生理或病理狀況的組合物和試劑盒，其可以用于各種目的，如檢測(cè)或診斷患者的肝疾病的存在和監(jiān)測(cè)患者的肝疾病進(jìn)程，所述患者尤其是沒有任何肝損傷、病癥或疾病指征的人。用于實(shí)施測(cè)定白蛋白mRNA水平的檢測(cè)的試劑盒一般包括用于與白蛋白編碼序列或互補(bǔ)序列特異性雜交的至少一種寡核苷酸。任選地，該寡核苷酸用可檢測(cè)部分標(biāo)記。在一些情況下，試劑盒可包括在通過PCR、特別是RT-PCR擴(kuò)增白蛋白mRNA中使用的至少兩種寡核苷酸引物。通常，試劑盒還提供說明手冊(cè)，以指導(dǎo)使用者分析檢測(cè)樣品和評(píng)估檢測(cè)個(gè)體的肝生理或病理狀況。
實(shí)施例以下實(shí)施例僅以闡述而非限定的方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于認(rèn)識(shí)到可以改變或修正各種非關(guān)鍵的參數(shù)而產(chǎn)生基本上相同或相似的結(jié)果。實(shí)施例II.材料與方法參與者2006年6月至2008年4月期間，從香港威爾斯親王醫(yī)院(the Prince of WalesHospital)招募參與者，包括(i)在內(nèi)科及藥物治療和臨床腫瘤學(xué)部就診的患有一系列肝并發(fā)癥的患者；(ii)之前在外科部接受過肝移植(LT)的患者，以及配對(duì)的肝供體；(iii)在兒科部接受過骨髓移植(BMT)的患者；以及(iv)健康個(gè)體。獲得機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的倫理批準(zhǔn)，并且獲得全部參與者或責(zé)任監(jiān)護(hù)人的知情同意。將IOmL外周血采集到EDTA-管中。還從BMT患者采集口腔頰粘膜細(xì)胞或毛囊細(xì)胞。對(duì)于接受過尸體LT的參與者,提取已死亡供體的存檔肝活檢組織標(biāo)本。樣品采集和處理采集血液之后立刻將樣品保存于4°C并在4小時(shí)之內(nèi)處理。輕輕地混合血樣之后，將 0. 3mL 全血與 0. 9mL TRIzol LS 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)相混合。通過二次離、心方案(Chiu et al.，Clin Chem 2001 ；47 :1607-13)獲得血漿。第一次離心步驟之后分離血沉棕黃層(buffy coat)，然后于4°C下，230g再次離心5分鐘以去除任何殘留的血漿。在如本發(fā)明本部分所述提取核酸之前，保存全部樣品。ALB基因分型靶定ALB編碼區(qū)之內(nèi)的SNP即rs962004。通過對(duì)10名無關(guān)個(gè)體的DNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)SNP具有0. 37的小等位基因頻率。利用同源MassEXTEND (hME) (Sequenom, San Diego,CA)檢測(cè)，通過引物延伸反應(yīng)進(jìn)行基因分型。每一 SNP等位基因的延伸產(chǎn)物顯示不同的質(zhì)量，這可通過基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析來分辨(參見圖5)。SNP分析的詳情可以在表3中找到。利用血沉棕黃層DNA測(cè)定LT受體和肝供體的基因型。對(duì)于尸體LT病例，由存檔的肝活檢組織DNA測(cè)定已死亡供體的ALB基因型。對(duì)于BMT受體，由口腔頰粘膜細(xì)胞或毛囊細(xì)胞的DNA檢測(cè)他們的原始ALB基因型。利用BMT之后受體的血沉棕黃層DNA來評(píng)估骨髓供體的ALB基因型。移植受體的血漿或全血ALB mRNA的基因型利用對(duì)反轉(zhuǎn)錄ALB mRNA 的同一基因分型檢測(cè)來測(cè)定。血漿ALB mRNA轉(zhuǎn)錄本的定量使用一步反轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)PCR(RT-qPCR)來測(cè)量血漿ALB mRNA濃度。設(shè)計(jì)用于ALB mRNA定量的跨內(nèi)含子(intron-spanning)檢測(cè)來擴(kuò)增跨5’區(qū)的外顯子I和外顯子2的78-bp ALB擴(kuò)增子(GenBank登錄號(hào)NM_000477. 3)且將序列總結(jié)于表4中。通過對(duì)指定 革巴向ALB擴(kuò)增子的HPLC-純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo, Singapore)進(jìn)行連續(xù)稀釋來制作用于絕對(duì)ALB mRNA定量的校正曲線(Wong et al.，Clin Chem 2005 ；51 1786-95)，濃度范圍為每個(gè)反應(yīng)孔3個(gè)拷貝至3xl06個(gè)拷貝。通過ABI Prism 7900序列檢測(cè)儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)和序列檢測(cè)軟件2. 2版(Applied Biosystems)監(jiān)測(cè)ALB mRNA的擴(kuò)增。由校正曲線計(jì)算的PCR效率中位數(shù)為88. 3 % (SD:6%，范圍81. 1% -98. 8 % )，所述校正曲線具有中位數(shù)斜率為-3. 64 (SD :0. 18，范圍3. 35-3. 88)，y-截距為 40. 8 (SD :1. 86，范圍:38. 1-43. 5)，以及相關(guān)系數(shù)為 0. 9958 (SD :0. 0026，范圍0. 9905-0. 9986)。血漿ALB mRNA的絕對(duì)濃度表示為拷貝/mL。評(píng)估肝功能由香港威爾斯親王醫(yī)院的化學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用DPE Modular分析系統(tǒng)(RocheDiagnostics)進(jìn)行血漿分析白蛋白、總膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和甲胎球蛋白。如之前所述(Chan 等 J Med Virol 2002 ；68 182-7 ；Loeb et al. , Hepatology2000 ；32 :626-629)，定量患有慢性乙型肝炎(CHB)傳染病的患者血清中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA0濃度> 10，000拷貝/mL被認(rèn)為是活性病毒復(fù)制的證據(jù)(Chan et al.，B. J ClinMicrobiol 2003 ；41 :4693-5)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS軟件15. 0版(SPSS Inc.，Chicago, IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過適當(dāng)?shù)目?瓦二氏(Kruskal-Wallis)H檢驗(yàn)和鄧肯(Dunn' s)檢驗(yàn)對(duì)患者與對(duì)照組之間的血衆(zhòng)ALB mRNA濃度進(jìn)行比較。通過斯皮爾曼(Spearman' s)等級(jí)相關(guān)法來確定血衆(zhòng)ALB mRNA濃度與其他參數(shù)之間的相關(guān)性。P值小于0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，并且全部概率都是雙尾。當(dāng)樣品的血漿ALB mRNA濃度大于相應(yīng)組平均值的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)，鑒定為異常值。構(gòu)建ROC曲線以確定曲線下面積(AUC)。計(jì)算最佳血漿ALB mRNA濃度截止點(diǎn)處的靈敏度和特異性，用于區(qū)別患有肝并發(fā)癥的患者和健康個(gè)體。樣品采集和制備為獲得血漿，首先將每一份血樣在4°C下于1600g離心10分鐘(離心機(jī)5810R，Eppendorf, German)。將上清液小心地轉(zhuǎn)移到普通聚丙烯管中，并在4°C下于16000g再次離心 10 分鐘(離心機(jī) 5417R, Eppendorf) (Chiu et al.，Clin Chem 2001 ；47 :1607-13)。接著將血漿轉(zhuǎn)移到新的聚丙烯管中且避免攪動(dòng)到下面的沉淀。然后將每I. 6mL血漿與4. SmLTRIzol LS試劑(Invitrogen)混合并在提取前于-80°C保存(Heung et al. , Prenat Diagn2009 ；29 277-9)。RNA 提取將每一份血漿-TRIzol LS混合物解凍并與I. 28mL氯仿混合。通過在4°C下于 12000g離心15分鐘，將RNA裂解物分離到不同的相中。然后將含水層小心地轉(zhuǎn)移到新的聚丙烯管中。對(duì)于RNA沉淀，將700mL/L的一體積乙醇添加到一體積含水層中。將混合物應(yīng)用于RNeasy微型試劑盒的純化柱上(Qiagen, Valencia, CA),并按廠商手冊(cè)進(jìn)行處理。用50 u L不含RNase的水洗脫總RNA。根據(jù)廠商說明,用擴(kuò)增級(jí)脫氧核糖核酸酶I (Invitrogen)預(yù)先處理全部RNA樣品，然后于_80°C保存，直到使用。DNA 提取用合適的QIAamp血液微型試劑盒(Qiagen)或QIAamp DNA微型試劑盒(Qiagen)并按廠商建議提取血沉棕黃層、口腔頰粘膜細(xì)胞、毛囊細(xì)胞和石蠟保存的肝活檢組織的DNA。用50 ii L雙蒸水洗脫DNA樣品，并于_20°C保存，直到使用。通過MassARRAY 同源MassEXTEND (hME)分析進(jìn)行RNA-SNP分析，之后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄一將RNA樣品通過耐熱禽類反轉(zhuǎn)錄酶(ThermoScript 反轉(zhuǎn)錄酶，Invitrogen)和基因特異性引物(Integrated DNA Technologies ;參見表 3)在 0. 5 U M 的終濃度中于55°C下反轉(zhuǎn)錄I小時(shí)。PCR擴(kuò)增一對(duì)于反轉(zhuǎn)錄cDNA的擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)含有0. 6x HotStar Taq PCR緩沖液，所述緩沖液具有 0. 9mM MgCl2 (Qiagen)，dATP、dGTP 和 dCTP # 25 u M, 50 u MdUTP (Applied Biosystems)。對(duì)于 DNA 的擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)含有 Ix HotStar Taq PCR 緩沖液，所述緩沖液具有 I. 5mM MgCl2 (Qiagen)，額外的 ImM MgCl2 (Qiagen), dATP、dGTP 和dCTP 各 50 ii M，100 ii M dUTP (Applied Biosystems)。對(duì)于全部 PCR，正向引物和反向引物(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA ;參見表 4)為 200nM,以及 HotStar Taq聚合酶的終濃度為0. 5U(Qiagen)。PCR于95°C下開始15分鐘；之后45個(gè)循環(huán)于95°C下變性20秒，于56°C下退火30秒，于72°C下延伸I分鐘；最后于72°C下孵育3分鐘。喊基延伸一用0. 6U蟲下喊性憐酸酶(Sequenom) >0. 34MassARRAY 同源MassEXTEND (hME)緩沖液(Sequenom)和3. 06 y L水對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行蝦堿性磷酸酶(SAP)處理。將混合物于37°C下孵育40分鐘，之后于85°C下孵育5分鐘以去除多余的dNTP。用hME分析(Sequenom)進(jìn)行基因分型。對(duì)于RNA SNP基因分型，將9 ii L含有I. 2 ii M延伸引物(Integrated DNA Technologies ;參見表3)的堿基延伸反應(yīng)混合物、I. 15UThermosequenase (Sequenom)及 ddATP、ddCTP 和 dGTP (Sequenom)各 64 U M添力卩到 5 U L SAP處理的PCR產(chǎn)物中。對(duì)于DNA SNP基因分型，將4 ii L含有0.771 ii M延伸引物(IntegratedDNA Technologies ;參見表 I)的喊基延伸反應(yīng)混合物、I. 15U Thermosequenase (Sequenom)及ddATP、ddCTP和dGTP (Sequenom)各64 y M添加到10 y L SAP處理的PCR產(chǎn)物中。反應(yīng)條件如下對(duì)于RNA-SNP基因分型，94°C下2分鐘；之后85個(gè)循環(huán)94°C，5秒，52°C，5秒，72°C，5秒。對(duì)于DNA-SNP基因分型，引物延伸反應(yīng)使用相同溫度描述進(jìn)行75個(gè)循環(huán)。液體分配和MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)分析一通過添加12mg純化樹脂(Sequenom)和24iiL水來純化最終的堿基延伸產(chǎn)物。將混合物于旋轉(zhuǎn)器中混合20分鐘。于361g下離心5分鐘之后，將IOnL反應(yīng)溶液通過MassARRAY納米分配器S (Sequenom)分配到SpectroCHIP(Sequenom)中。使用MassARRAY Analyzer Compact質(zhì)譜儀(Bruker,Madison,WI)從SpectroCHIP獲取數(shù)據(jù)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)被自動(dòng)輸入到MassARRAY Typer(Sequenom)數(shù)據(jù)庫用于分析。 通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血漿ALB mRNA轉(zhuǎn)錄本使用Primer Express 2. 0 版(Applied Biosystems)設(shè)計(jì) ALB mRNA定量分析。正向引物和反向引物分別位于外顯子I和外顯子2中，并由Integrated DNA Technologies合成。突光探針(Applied Biosystems, Foster City, CA)跨越外顯子I和2之間的連接，以防止污染性基因組DNA的擴(kuò)增(參見表4)。進(jìn)行電腦模擬特異性篩選和序列比對(duì)，以確保擴(kuò)增子對(duì)所靶定ALB位點(diǎn)是特異性的且沒有剪接變體。反轉(zhuǎn)錄一根據(jù)廠商說明(TaqManEZ RT-PCR核心試劑；Cat. No. N8080236 ；AppliedBiosystems)，在25 y L反應(yīng)體積中手動(dòng)設(shè)置定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。各反應(yīng)每一成分的終濃度如下1 X EZ緩沖液，乙酸錳溶液3mM, dNTPs 300 u M，AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶0. 25單位，正向引物400 ii M，反向引物400 ii M，探針200 u M，rTth DNA聚合酶2. 5單位，并且沒有使用添加劑。對(duì)于擴(kuò)增，將3 ii L提取的血漿RNA添加到96-孔反應(yīng)板的各個(gè)孔內(nèi)(MicroAmp光學(xué)96-孔反應(yīng)板；目錄號(hào)N8010560 ；Applied Biosystems)。對(duì)于ALB mRNA分析使用的溫度分布如下反應(yīng)于50°C下開始2分鐘，用于所包括的尿嘧啶-N-糖基化酶活化；之后于60°C下反轉(zhuǎn)錄30分鐘。于95°C下變性5分鐘之后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的PCR :于94°C下變性20秒，并于58°C下變性/延伸I分鐘。每一樣品分析兩份，并且與各分析平行進(jìn)行相應(yīng)的校正曲線。每次分析中包括多個(gè)水空白和肝組織RNA分別作為陰性和陽性對(duì)照。通過用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems)取代rTth聚合酶,還進(jìn)行樣品檢測(cè)以確保它們對(duì)于DNA是陰性的。在全部陰性水空白和“無-RT”對(duì)照分析中未觀察到擴(kuò)增，表明對(duì)于mRNA分析是特異性的。PCR產(chǎn)物的特異性還通過凝膠電泳分析來驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)對(duì)于ALB分析的檢測(cè)限度是每個(gè)反應(yīng)孔3拷貝，因?yàn)?8%的40個(gè)一式兩份的孔[=總共80個(gè)孔，每個(gè)反應(yīng)孔含有3拷貝]被成功檢測(cè)，循環(huán)閾值中位數(shù)(范圍)為38. 6(37. 8-44. 3)。通過測(cè)量具有ALB mRNA濃度調(diào)整到835拷貝/mL的樣品來評(píng)估ALB mRNA分析的分析內(nèi)CV，其定義為在同一反應(yīng)板上的20個(gè)一式兩份的孔中，通過ROC分析，由健康對(duì)照鑒定患有肝疾病患者的血漿ALB mRNA濃度的截止值。從重復(fù)中檢測(cè)到平均ALB mRNA濃度為855拷貝/mL，SD為85 拷貝 /mL, CV 為 9. 97%。II.結(jié)果循環(huán)系統(tǒng)中ALB mRNA的來源
為確定血漿和全血中的ALB mRNA是否是肝來源的，開發(fā)RNA-SNP分析以對(duì)LT和BMT受體的循環(huán)系統(tǒng)中存在的ALB mRNA分子進(jìn)行基因分型。將分析集中于有信息的供體-受體對(duì)，其中供體被定義為相比他們相應(yīng)的受體對(duì)于查詢的ALB SNP攜帶不同的基因型。肝移植之后，如果ALB mRNA真的是肝來源的，則對(duì)于在受體的循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的ALBmRNA分子，應(yīng)當(dāng)觀測(cè)到對(duì)應(yīng)于供體基因型的基因型?？蛇x擇地，如果其他組織來源對(duì)循環(huán)ALB mRNA庫有貢獻(xiàn)，則受體的ALB基因型應(yīng)當(dāng)是可檢測(cè)的。為表明造血細(xì)胞可能是循環(huán)ALBmRNA的污染源，對(duì)BMT受體進(jìn)行相似的RNA-SNP分析。同樣，如果造血細(xì)胞對(duì)循環(huán)系統(tǒng)貢獻(xiàn)ALB mRNA，則循環(huán)ALB mRNA分子將顯現(xiàn)骨髓供體的基因型。研究了二十九(29)例LT病例，其中九(9)名受體從他們活著的親屬獲得肝，其余受體從尸體獲得肝。通過顯示供體和受體之間不同的ALB基因型，這些供體-受體對(duì)中的15對(duì)(15)被認(rèn)為是有信息的。表I總結(jié)了有信息的供體和受體的基因分型數(shù)據(jù)。在有信息的病例中，移植后受體血漿中所檢測(cè)的ALB mRNA基因型與他們的原始基因型不同，并與肝供體基因型一致。所招募的20例BMT病例中的5例是有信息的，并且表I總結(jié)了基因分型數(shù)據(jù)。受 體血漿ALB mRNA基因型在BMT之前和之后沒有變化。因此，供體的骨髓并不是受體血漿ALB mRNA的主要貢獻(xiàn)者。除血漿外，還對(duì)采自移植后有信息的LT和BMT受體的全血ALB mRNA進(jìn)行RNA-SNP分析。十二(12)例有信息的LT病例和四(4)例有信息的BMT病例同意該分析，并且基因型數(shù)據(jù)在表I中給出。與血漿數(shù)據(jù)不同，在全血ALB mRNA中觀測(cè)到來自骨髓供體(病例B8和B 10)和LT受體(病例L8、LI 8、L23、L24和L25)的貢獻(xiàn)?？傊獫{ALB mRNA是肝來源的，而全血ALB mRNA不是肝特異的。血漿ALB mRNA的定量分析證實(shí)血漿ALB mRNA是肝特異的之后，發(fā)明人評(píng)估其在獲自患有肝并發(fā)癥譜系的107名患者和207名健康個(gè)體的血漿中的濃度。在患者中，已證實(shí)35名患有HCC，25名患有肝組織活檢檢驗(yàn)的肝硬化，24名患有CHB。其具有血清HBV DNA濃度> 10，000拷貝/mL，即活性病毒復(fù)制，以及23名患有CHB，其血清HBV DNA濃度< 10，000拷貝/mL，即非活性病毒復(fù)制。全部健康個(gè)體經(jīng)檢測(cè)為HBsAg陰性，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血漿生化檢測(cè)具有在參考區(qū)間之內(nèi)的肝功能檢測(cè)參數(shù)。表2總結(jié)了關(guān)于參與者的人口統(tǒng)計(jì)資料、生化檢測(cè)、病毒學(xué)調(diào)研和血漿ALB mRNA濃度中位數(shù)的信息。除I名患者和5名對(duì)照具有陰性讀數(shù)，314名參與者中的308名檢測(cè)到血漿ALB mRNA (98. 1% ) 圖I中給出全部組的血漿ALB mRNA濃度。參與者組之間的血漿ALB mRNA濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P < 0. 0001，克-瓦二氏檢驗(yàn))。與對(duì)照相比時(shí)，亞組分析顯示患有HCC (P < 0. 0001)、肝硬化(P = 0. 0068)和活動(dòng)性CHB (P < 0. 0001)的患者的血漿ALB mRNA濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的升高。對(duì)照與患有非活動(dòng)性CHB的患者之間的血漿mRNA濃度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異$ = 0.4239，鄧肯檢驗(yàn))。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持患有非活動(dòng)性CHB的人通常具有與健康對(duì)照相似的肝狀況。進(jìn)行ROC曲線分析以評(píng)估血漿ALB mRNA濃度是否是肝病變的有效指示物(圖2)。AUC表明，利用血漿ALB mRNA作為肝病變指示物的診斷效率為92. 9%。通過利用835拷貝/mL的血漿ALB mRNA作為截止值，檢測(cè)任何一種所評(píng)估肝病變的靈敏度和特異性分別為85. 5%和 92. 8%。血漿ALB mRNA濃度與常規(guī)肝功能檢測(cè)參數(shù)之間的關(guān)系考慮到來自全部研究參與者(患者和對(duì)照)的數(shù)據(jù)，血漿ALB mRNA濃度與血漿總膽紅素(r = 0. 133，P = O. 018，斯皮爾曼相關(guān)法)、堿性磷酸酶(r = 0. 126，P = O. 0255)和 ALT(r = 0. 207，P = 0. 0002 ;圖 3)相關(guān)性較弱。在107名患者中，僅23名患者(21.5%)具有升高的ALT水平(> 58IU/L)，而62名患者(73.8% )的血漿ALB mRNA濃度> 835拷貝/mL。對(duì)于通過肝活檢確認(rèn)的患有HCC的35名患者中，僅17名患者(49% )具有升高的甲胎蛋白水平(> 20ii g/L) (Sherman etal.，Hepatology 1995 ；22 :432-8)。然而，這些患者中的32名(91. 4% )具有升高的血漿ALB mRNA濃度，如圖4所示。具有正常肝功能的個(gè)體的血漿ALB mRNA分析
明顯注意到的是，患有肝疾病的患者的血漿ALB mRNA升高，而不是正常的血漿ALT或AFP水平。ALT是指示肝細(xì)胞損傷的常用生化標(biāo)志物。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于肝疾病檢測(cè)，ALB mRNA比血漿ALT更靈敏。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，再次分析數(shù)據(jù)從而僅包括具有正常血漿ALT的個(gè)體。由參與本研究檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所提供的正常血漿ALT的參考范圍是< 58U/L。總共291名研究參與者具有正常的血漿ALT。這代表全部參與者的93%。表5總結(jié)了關(guān)于該亞組參與者的人口統(tǒng)計(jì)資料、生化檢測(cè)、病毒學(xué)調(diào)研和血漿ALB mRNA濃度中位數(shù)的信息。圖6中給出具有正常血漿ALT的全部組的血漿ALB mRNA濃度。血漿ALB mRNA濃度在亞組之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同(P < 0.0001，克-瓦二氏檢驗(yàn))。進(jìn)一步分析顯示，與對(duì)照相比時(shí)，患有HCC的患者(P < 0. 0001)，患有肝硬化的患者(P = 0. 0094)，以及患有活動(dòng)性CHB (P < 0.0001)的患者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高的血漿ALB mRNA濃度。對(duì)照與患有非活動(dòng)性CHB的患者之間的血漿mRNA濃度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P = 0. 2723，Dunn檢驗(yàn))。對(duì)該亞組進(jìn)行ROC曲線分析(圖7)。AUC表明，利用血漿ALB mRNA作為肝病變的指示物的診斷效率為87%。通過利用835個(gè)拷貝/mL的血漿ALB mRNA作為截止值，檢測(cè)任何一種所評(píng)估的肝病變的靈敏度和特異性分別是74%和93%。該亞組分析進(jìn)一步證實(shí)，血漿ALB mRNA分析是用于檢測(cè)肝病變，甚至是在具有正常的肝功能檢測(cè)(如正常血漿ALT水平)的個(gè)體中檢測(cè)肝病變的靈敏的標(biāo)志物。升高的血漿ALB mRNA作為將來不良后果的預(yù)示物進(jìn)一步研究參與以上所述基因分型研究的29名LT受體。除了基因分型，還通過如以上所述實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量血漿ALB mRNA濃度。同時(shí)還評(píng)估了血漿ALT水平。與Cheunget al. , Transplantation 2008 ；85 :81_7)所述的個(gè)體不同，在研究招募時(shí)并不知道所有患者已發(fā)生肝移植后(post-LT) HCC。監(jiān)測(cè)需要就醫(yī)或住院長(zhǎng)達(dá)125周的參與者的任何不良后果。5名參與者未返回香港威爾斯親王醫(yī)院接受后續(xù)治療，因此將他們從該研究的這一部分中排除的。在剩余的24名參與者中，9名在隨后的日子中出現(xiàn)除HCC外的不良后果，如表6所示。這9名個(gè)體中的7名在發(fā)生內(nèi)科并發(fā)癥之前顯示升高的血漿ALB mRNA( > 835拷貝/mL)濃度。這些個(gè)體中僅3名在采血時(shí)血漿ALT水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，升高的血漿ALB mRNA濃度是肝LT后受體的肝相關(guān)并發(fā)癥的早期預(yù)示物，其比血漿ALT具有更好的性能。這些數(shù)據(jù)表明，還可以通過升高的ALB mRNA水平預(yù)測(cè)除HCC外的肝相關(guān)并發(fā)癥。在15名未發(fā)生肝相關(guān)并發(fā)癥的參與者中，僅有I人(表6中的病例14)的血漿ALB mRNA水平> 835個(gè)拷貝/mL。在發(fā)生或未發(fā)生肝相關(guān)并發(fā)癥的那些參與者中，具有升高的血漿ALBmRNA的個(gè)體比例是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的(P < 0. OOLFisher精確檢驗(yàn))。這些數(shù)據(jù)表明升高的ALB mRNA水平是肝疾病相對(duì)特異的早期跡象和預(yù)示物。血漿ALB mRNA的范圍可以表示肝并發(fā)癥嚴(yán)重性，例如具有預(yù)后價(jià)值。從以前肝疾病中完全恢復(fù)的個(gè)體的血漿ALB mRNA濃度肝并發(fā)癥之后ALB mRNA恢復(fù)到正常水平表示恢復(fù)了正常肝功能。由于導(dǎo)致嚴(yán)重危害他們肝功能的病癥，全部LT受體需要LT。因而，他們通過LT治療，其中原始患病的肝由健康肝替代。對(duì)于肝LT后期間并未接著發(fā)生任何肝相關(guān)并發(fā)癥的那些人(表6)，令人感興趣的是注意到血漿ALB mRNA濃度與健康對(duì)照相當(dāng)，如圖I和圖6所示，且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P = 0.686，曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗(yàn))(圖8)。這些數(shù)據(jù)表明，盡管以前存在肝損傷，但在接受具有正常肝功能的肝之后，血漿ALB mRNA濃度恢復(fù)到正常水平，所述正常肝功能通過標(biāo)準(zhǔn)血漿ALT和沒有相關(guān)跡象和癥狀來表明。同樣，期望的是對(duì)于從肝損傷恢復(fù)但未接受LT作為治療的個(gè)體，血漿ALB mRNA濃度應(yīng)當(dāng)正常，所述從肝損傷恢復(fù)通過標(biāo)準(zhǔn)肝功能檢測(cè)和沒有相關(guān)跡象和癥狀來表明。因而，如果血漿ALB mRNA濃度在恢復(fù)后的 稍后階段增加，則其表示復(fù)發(fā)或其他肝疾病發(fā)生。III.討論通過分析循環(huán)核酸開發(fā)用于疾病診斷和管理的基于血液的工具的可能性，令人非常興奮(Chan et al. , Ann Clin Biochem 2003 ；40 :122-30 ；Anker et al. , Int J Cancer2003 ； 103 149-52 ；Lo et al. , Nat Rev Genet 2007 ；8 :71-7 ；Lo et al. , Lancet 1998 ；351 :1329-30 ；Lo et al. ,Clin Chem 2000 ；46 :319-23)。檢測(cè)循環(huán) RNA提供優(yōu)于 DNA 的某些優(yōu)勢(shì)(Lambrechts et al.，Ann Oncol 1998 ；9 :1269-76)。由于細(xì)胞類型與疾病之間的表達(dá)譜不同，可以使用組織或疾病特異的轉(zhuǎn)錄本作為疾病評(píng)估的標(biāo)志物。如果選擇了具體器官特有的RNA轉(zhuǎn)錄本，則RNA途徑可能更普遍適用于該器官的疾病，并且不限于容納特異DNA標(biāo)簽的部分情況。此外，如果血漿RNA和DNA都源自同一細(xì)胞群，則所釋放的RNA在數(shù)量上可能比DNA更多。這是因?yàn)镽NA轉(zhuǎn)錄本的多拷貝可依賴于其表達(dá)水平而存在于各細(xì)胞中，而各細(xì)胞僅含有相當(dāng)于一個(gè)二倍體基因組的DNA。實(shí)際上，一些癌癥研究人員報(bào)道，相比DNA標(biāo)志物，更大比例的癌癥病例對(duì)于所研究的血漿RNA是陽性的(Anker et al.，IntJ Cancer 2003 ；103 :149-52)。越來越多的證據(jù)表明，從器官或腔室將無細(xì)胞核酸釋放到血漿中可能是由于細(xì)胞死亡所致(Jahr et al. , Cancer Res 2001 ；61 1659-65 ；Fournie et al. , Cancer Lett
1995；91 :221-7 ；Fournie 等，Gerontology 1993 ；39 :215-21)。肝為人體最大的器官之一，我們猜測(cè)，由于與正常細(xì)胞更新和/或病理損傷相關(guān)的細(xì)胞死亡，肝表達(dá)的RNA如ALB在外周循環(huán)系統(tǒng)中應(yīng)當(dāng)是可檢測(cè)的。實(shí)際上，已有研究報(bào)道存在循環(huán)ALB mRNA，但是成功的程度不同(Cheung et al. , Transplantation 2008;85:81-7)。一些研究人員認(rèn)為血液ALB mRNA來源于已進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)的惡性或非惡性肝細(xì)胞(Hillaire et al.,Gastroenterology 1994 ； 106 :239-42 ；Kar et al. , Hepatology 1995 ；21 :403_7)。然而，Muller et al. Hepatology 1997 ;25 :896-9 報(bào)道,可誘導(dǎo)外周單核細(xì)胞表達(dá) ALB mRNA。實(shí)際上，先前的報(bào)道表明，由于不正常的基因轉(zhuǎn)錄(Lambrechts et al. , Ann Oncol 1998 ；9 1269-76 ；Chelly et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1989 ;86 :2617-21)，某些推測(cè)在循環(huán)系統(tǒng)中可檢測(cè)的器官特異性轉(zhuǎn)錄本實(shí)際上可能源自其他細(xì)胞群，如造血細(xì)胞(Chan etal. , Clin Chem 2007；53 :1874-6 ；Heung et al. , PLoS One 2009 ；4 e5858)。因而，在本研究中，發(fā)明人的首要目的是，證實(shí)人血漿和全血中可檢測(cè)的ALB mRNA是否源自于肝且對(duì)肝是特異性的。研究對(duì)于編碼SNP的ALB基因分型不同的LT或BMT的供體和受體，并確定血漿和全血的RNA-SNP基因型。所述數(shù)據(jù)證實(shí)，在血漿而非全血中檢測(cè)到的ALB mRNA是肝特異性的。所述數(shù)據(jù)還表明，由造血細(xì)胞表達(dá)的ALB mRNA可對(duì)全血中所檢測(cè)的ALB mRNA庫有貢獻(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)呼吁注意先前關(guān)于全血ALB mRNA檢測(cè)報(bào)道數(shù)據(jù)的解釋。血漿優(yōu)于全血優(yōu)選用于在未來研究作為肝疾病標(biāo)志物的ALB mRNA。為使殘留血細(xì)胞污染血漿中ALB mRNA分子的機(jī)會(huì)最小，應(yīng)當(dāng)通過先前所報(bào)道的二次離心步驟制備血漿。發(fā)明人接著開發(fā)了用于定量血漿ALB mRNA的一步RT-qPCR檢測(cè)。在我們的研究中血漿ALB mRNA的檢測(cè)率為98. I %。使用兩步RT-qPCR，調(diào)查血漿ALB mRNA檢測(cè)在預(yù)測(cè)肝移植受體中HCC復(fù)發(fā)中的作用的最新研究報(bào)道了 82%的檢出率(Cheung et al.， Transplantation 2008 ；85 :81-7)。在他們報(bào)道的討論部分,Cheung等聲稱,他們認(rèn)為血衆(zhòng)ALB mRNA的陽性檢測(cè)表明存在循環(huán)HCC細(xì)胞，而中血漿ALB mRNA陰性的LT受體則表明循環(huán)系統(tǒng)中沒有HCC細(xì)胞。然而，本研究的數(shù)據(jù)表明，在幾乎所有個(gè)體的血漿中可檢測(cè)出血漿ALB mRNA,所述個(gè)體包括健康對(duì)照。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)HCC細(xì)胞根本不是血漿ALB mRNA的唯一來源。因而，由于任何肝細(xì)胞死亡，血漿ALB mRNA更有可能被釋放到血漿中，并且對(duì)于檢測(cè)不限于LT后HCC的一系列肝疾病是有用的。相信本發(fā)明人對(duì)血漿ALB mRNA檢測(cè)率的提高可能與一步RT-qPCR方案的分析靈敏度和它們靶定ALB基因的更靠5’端相關(guān)。發(fā)明人先前報(bào)道血漿中的循環(huán)mRNA可能不是完整的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本且顯示5’優(yōu)勢(shì)(Wong et al.，Clin Chem 2005 ；51 :1786-95)。已發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照，血漿ALB mRNA濃度在患有HCC、肝硬化和活動(dòng)性CHB而不是患有非活動(dòng)性CHB的患者中顯著更高。這些數(shù)據(jù)表明，由于細(xì)胞死亡，ALB mRNA被釋放到血漿中，并且可能與細(xì)胞死亡程度相關(guān)。通過ROC曲線分析，已發(fā)現(xiàn)，血漿ALB mRNA測(cè)量對(duì)于檢測(cè)肝病變的存在是引人注目的手段(92.9% )。特別是，對(duì)于HCC組，在48.6%的病例中，僅甲胎蛋白升高，而大多數(shù)(91. 4% )病理顯示ALB mRNA濃度升高。雖然其診斷靈敏，血漿ALB mRNA并非對(duì)任何特定病因的肝病變都是特異性的。然而，血漿ALB mRNA濃度與血清ALT活性-濃度有一些相關(guān)性。還發(fā)現(xiàn)血漿ALB mRNA在患有肝疾病但有正常ALT水平的患者中升高(圖3)。這些觀測(cè)結(jié)果表明，血漿ALB mRNA是檢測(cè)早期慢性肝疾病的靈敏標(biāo)志物，所述肝疾病中ALT活性-濃度通常在參考限度內(nèi)。總之，本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示血漿而非全血的ALB mRNA源自肝且對(duì)肝是特異性的。觀察到一系列肝病變的血漿ALB mRNA濃度升高，且需要進(jìn)一步研究來調(diào)查其在評(píng)估或管理這類疾病中的臨床效用。實(shí)施例2 :通過血漿白蛋白mRNA監(jiān)測(cè)肝移植后并發(fā)癥的靈敏度檢測(cè)在本研究中，本發(fā)明人證明，血漿ALB mRNA濃度的顯著升高與慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)相關(guān)。我們的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于檢測(cè)肝病變，血漿ALB mRNA比血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性更靈敏。長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)肝功能和早期檢測(cè)肝損傷是持續(xù)護(hù)理包括肝移植后受體在內(nèi)的患有各種肝病變的患者的重要方面。因此，本研究的目的是利用肝移植受體為例，研究血漿ALB mRNA測(cè)量是否為已知以前患有肝病變的患者的護(hù)理提供任何價(jià)值。I.材料和方法參與者2006年6月至2009年7月期間，招募了先前在香港威爾斯親王醫(yī)院外科部經(jīng)過肝移植的24名患者。肝移植后受體通常每隔三至六個(gè)月，或者若臨床有指征則更頻繁地到肝移植門診部就診。每次就診時(shí)，進(jìn)行體格、生化和血清學(xué)檢查。本研究中血漿ALB mRNA的連續(xù)分析涉及3年期間由前臂靜脈最多7次采集的6mL外周血。獲得機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的倫理批準(zhǔn)，并且得到各受體的知情同意。樣品采集和處理樣品采集和處理的方法如Chan et al. ,Clin. Chem. 2010 ；56 :82_9所述。簡(jiǎn)而言之，將血液樣品采集到含EDTA的管中，立即于4°C保存且在4小時(shí)內(nèi)處理。通過二次離心方案獲得血漿(Chiu et al.，Clin. Chem. 2001 ；47 =1607-13)。通過包括使用 RNeasy 微型試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)和 TRIzol LS 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA) (Heung etal.，Prenat. Diagn. 2009 ；29 :277-9)的方案提取血漿 RNA?？?RNA 在不含 RNase 的 50 y L水中洗脫并根據(jù)廠商說明用擴(kuò)增級(jí)脫氧核糖核酸酶I (Invitoogen)處理，然后于_80°C保 存，直到使用。血漿中ALB mRNA轉(zhuǎn)錄本的定量使用一步反轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)來測(cè)量血漿ALB mRNA濃度。簡(jiǎn)而言之，設(shè)計(jì)用于定量ALB mRNA的跨越內(nèi)含子的檢測(cè)，來擴(kuò)增跨越5’區(qū)的外顯子I和外顯子的 278-bp ALB 擴(kuò)增子。使用 EZ rTth RNA PCR 試劑盒(Applied Biosystems,FosterCity, CA)以25 ii L的反應(yīng)體積設(shè)置反應(yīng)。用于絕對(duì)ALB mRNA定量的校正曲線通過對(duì)指定靶向ALB擴(kuò)增子的高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo, Singapore)進(jìn)行連續(xù)稀釋來制備。本檢測(cè)所檢測(cè)的下限是每個(gè)反應(yīng)I個(gè)拷貝，且線性范圍高達(dá)每個(gè)反應(yīng)IO6個(gè)拷貝。各樣品一式兩份進(jìn)行分析，并且與各分析平行進(jìn)行相應(yīng)的校正曲線。通過ABI Prism 7900序列檢測(cè)儀(Applied Biosystems)和序列檢測(cè)軟件2. 2版(AppliedBiosystems)來監(jiān)測(cè)ALB mRNA的擴(kuò)增。將血漿ALB mRNA的絕對(duì)濃度表示為拷貝/mL。評(píng)估肝功能由PWH的化學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用DPE Modular分析系統(tǒng)(Roche診斷，Basel,Switzerland)進(jìn)行血漿白蛋白、總膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和甲胎蛋白分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SigmaStat 軟件(Windows 3. 5 版,Systat Software Inc. , Chicago, IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將連續(xù)變量表示為中位數(shù)和范圍。如果合適，通過克-瓦二氏H檢驗(yàn)和曼-惠特尼U檢驗(yàn)比較組間的血楽；ALB mRNA濃度和其他參數(shù)。通過斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)法來確定血漿ALB mRNA濃度和其他參數(shù)之間的相關(guān)性。P值小于0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，并且全部概率都是雙尾。II.結(jié)果對(duì)在研究期間總共具有至少3次采血用于血漿ALB mRNA測(cè)量的24名肝受體(20名男性和4名女性)進(jìn)行了研究。肝移植于1991至2004年期間在PWH進(jìn)行。9名是活供體肝移植，15名是死亡供肝移植。用于肝移植的指征包括HCC(12個(gè)病例)、肝硬化(7個(gè)病例)、肝衰竭(3個(gè)病例)、重型乙型肝炎(I個(gè)病例)和酒精性肝硬化(I個(gè)病例)。在本研究中，將24名受體根據(jù)他們?cè)谘芯科陂g是否發(fā)生肝相關(guān)臨床后遺癥而分成兩組。將14名受體(12名男性和2名女性)歸為“穩(wěn)定”組，他們具有通過他們的穩(wěn)定臨床癥狀和生化肝功能檢測(cè)特征反映的不顯著進(jìn)程。另一方面，將10名受體(8名男性和2名女性)歸為“ 不穩(wěn)定”組，他們?cè)谘芯科陂g具有需要住院或手術(shù)管理的單一或多種肝相關(guān)并發(fā)癥發(fā)作的跡象。在研究期間，24名受體都沒有HCC復(fù)發(fā)。研究登記時(shí)的初步分析登記時(shí)，24名受體的年齡中位數(shù)是56. 2歲(范圍17_69)，并且在穩(wěn)定組和不穩(wěn)定組之間的年齡中位數(shù)中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(曼-惠特尼U檢驗(yàn)，P = O. 254)?；诟闻K學(xué)家的評(píng)估和令人滿意的生化肝功能檢測(cè)特征，穩(wěn)定組的全部14名受體在登記時(shí)被認(rèn)為是臨床穩(wěn)定的。對(duì)于穩(wěn)定組，血漿白蛋白、膽紅素、ALP和ALT水平中位數(shù)分別為 44g/L (40-49)、15 u mol/L(7_38)、82U/L (59-290)和 32U/L (10-69)。不穩(wěn)定組的10名受體中的9名在研究登記時(shí)是臨床穩(wěn)定的。一個(gè)例外是編號(hào)U07的受體，其在登記時(shí)被診斷為酒精性肝硬化復(fù)發(fā)和輕度慢性排斥。不穩(wěn)定組的血漿白蛋白、膽紅素、ALP 和 ALT 濃度中位數(shù)分另為 44g/L (38-45)、19 u moI/L (10-31)、169U/L (73-379)和53U/L(24-155)。兩組之間的血漿白蛋白(P = 0. 341)和膽紅素(P = 0. 538)濃度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。然而，不穩(wěn)定組的血漿ALP(P = 0. 015)和ALT(P = 0. 035)濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于穩(wěn)定組。圖9給出登記時(shí)兩組的血漿ALB mRNA濃度。穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA濃度中位數(shù)為533個(gè)拷貝/mL (69-2，399)，而不穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA濃度中位數(shù)為1，540個(gè)拷貝/mL (203-37，524) (P = 0. 021，曼-惠特尼U檢驗(yàn))。在他們先前的研究中(Chan et al.，Clin. Chem. 2010 ；56 :82_9)，利用接收者工作特征曲線分析，本發(fā)明人鑒定了 835拷貝個(gè)/mL作為用于區(qū)別健康對(duì)照和患有肝病變的患者的靈敏且特異性的截止值。采用相同的截止值用于本研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定組和不穩(wěn)定組中分別有21% (3/14)和70% (7/10)具有升高的血漿ALB mRNA濃度。兩組中具有升高的血漿ALB mRNA濃度的病例比例是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的(X 2檢驗(yàn)，P < 0. 0001)。發(fā)明人進(jìn)一步研究了 24名受體的血漿ALB mRNA濃度與生化肝功能檢測(cè)參數(shù)之間的關(guān)系。血漿ALB mRNA濃度與血漿ALP (斯皮爾曼相關(guān)法，r2 = 0. 71, P < 0.0351)和 ALT(r2 = 0. 45, P = 0. 03)濃度顯著相關(guān)，但是與白蛋白(r2=-0. 16, P = O. 46)或膽紅素 Cr2 = 0. 15, P = 0. 5)不相關(guān)。連續(xù)監(jiān)測(cè)血漿ALB mRNA追蹤24名受體臨床進(jìn)程的持續(xù)時(shí)間中位數(shù)為110周。穩(wěn)定組的總研究時(shí)間112周(87-160)與不穩(wěn)定組的總研究時(shí)間107周(69-159)相當(dāng)，沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P= 0.412)。研究期間，采集105份血液標(biāo)本(56份來自穩(wěn)定組和49份來自不穩(wěn)定組)用于血漿ALB mRNA分析，并且全部都有可檢測(cè)的血漿ALB mRNA。具有穩(wěn)定臨床進(jìn)程的肝移植后受體在穩(wěn)定組的14名受體中，有12名受體(86%)在整個(gè)研究期間具有不顯著的臨床進(jìn)程。對(duì)于研究期間進(jìn)行的全部測(cè)量而言，穩(wěn)定組的血漿白蛋白、膽紅素、ALP和ALT濃度中位數(shù)分別為 44g/L (35-49)、15 u mol/L(5_38)、85U/L (59-290)和 28U/L (10-158)。與登記時(shí)首次采集的血樣一致，穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA濃度中位數(shù)為418個(gè)拷貝/mL (52-15，320)。圖IOA是從穩(wěn)定組得到的全部血漿ALB mRNA的測(cè)量值圖。僅25% (14/56)的血漿ALB mRNA測(cè)量值高于835個(gè)拷貝/mL。當(dāng)將來自穩(wěn)定組的全部血漿ALB mRNA測(cè)量值分組時(shí)，第5個(gè)百分點(diǎn)和第95個(gè)百分點(diǎn)的值分別為90個(gè)拷貝/mL和2，400個(gè)拷貝/mL。在所有情況下，這12名受體的生化肝功能檢測(cè)特征保持不顯著。在14名穩(wěn)定受體中，2名受體(14% )的生化肝功能檢測(cè)參數(shù)具有迅速恢復(fù)到正常范圍內(nèi)而沒有影響的偶發(fā)性上升。那些情況下測(cè)量的來自2名受體的血漿ALB mRNA濃度為15，320和2，399個(gè)拷貝/mL。然而，隨后檢查時(shí)水平分別恢復(fù)到497和1，044個(gè)拷貝/mL。相關(guān)性分析表明，研究期間所測(cè)量的14名穩(wěn)定受體的血漿ALB mRNA濃度與血漿ALP濃度并不顯著相關(guān)(r2 = 0.41，P = 0.002)，但是與白蛋白(r2 = -0.06，P = 0.68)、膽紅素(r2 = -0. 19，P = O. 16)、ALT(r2 = 0. 19，P = O. 16)不相關(guān)。具有不穩(wěn)定臨床進(jìn)程的肝移植后受體
在研究期間，不穩(wěn)定組的10名受體具有至少一種肝相關(guān)并發(fā)癥發(fā)作。表7列出不 穩(wěn)定組受體在研究期間出現(xiàn)的肝相關(guān)并發(fā)癥。將整個(gè)研究期間得到的測(cè)量值分組，不穩(wěn)定組的血漿白蛋白、膽紅素、ALP和ALT濃度中位數(shù)分別為40g/L(16-46) ,23 u moI/L(5-250)、150U/L(46-601)和50U/L(20-413)。不穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA水平中位數(shù)為2，721個(gè)拷貝/mL(203-61，694)，其比穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA水平中位數(shù)(418個(gè)拷貝/mL)高6. 5倍。與穩(wěn)定受體中所觀測(cè)到的血漿ALB mRNA持續(xù)低濃度相反，在不穩(wěn)定受體中可觀測(cè)到高度波動(dòng)甚至是持續(xù)升高的血漿ALB mRNA濃度，如圖IOB所示。78% (38/49)的不穩(wěn)定組的血漿ALB mRNA測(cè)量值高于835個(gè)拷貝/mL。穩(wěn)定組和不穩(wěn)定組中具有升高的血漿ALB mRNA濃度的測(cè)量值比例是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的(X 2檢驗(yàn)，P < 0. 0001)。對(duì)于不穩(wěn)定組的10名受體，6名發(fā)生急性肝并發(fā)癥(病例UOl至U06)，4名患有慢性肝并發(fā)癥(病例U07至U10)。急性和慢性組的血漿ALB mRNA濃度和ALT活性-濃度的連續(xù)測(cè)量值分別在圖11和圖12中示出?；加屑毙愿蜗嚓P(guān)并發(fā)癥的不穩(wěn)定受體圖11和圖12的圖中標(biāo)記了每次肝相關(guān)并發(fā)癥發(fā)作的診斷時(shí)間。在患有記錄的急性肝相關(guān)并發(fā)癥的6名受體中，4個(gè)病例在診斷并發(fā)癥的時(shí)間之前血漿ALB mRNA濃度升高(超過835個(gè)拷貝/mL的截止值)(圖11)。病例UOl至U06總共記錄9次并發(fā)癥發(fā)作。在進(jìn)行診斷時(shí)，全部并發(fā)癥發(fā)作中血漿ALB mRNA濃度升高。相反，在9次發(fā)作中，僅4次發(fā)作的血漿ALT活性升高(> 58U/L)?；加新愿蜗嚓P(guān)并發(fā)癥的不穩(wěn)定受體不穩(wěn)定組的4名受體具有總共5次本質(zhì)上是慢性的肝相關(guān)并發(fā)癥發(fā)作。除了發(fā)現(xiàn)病例UlO患有肝膿腫時(shí)外，診斷時(shí)血漿ALB mRNA濃度升高(圖12)。血漿ALT活性在診斷3次發(fā)作時(shí)升高。III.討論在本研究中，本發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)他們之前的數(shù)據(jù)，即血漿ALB mRNA是肝病變的靈敏標(biāo)志物。在本研究中，以肝移植后受體為例。24名招募的受體中，23名是臨床穩(wěn)定的，在登記時(shí)具有正常的生化肝功能檢測(cè)特征，并且經(jīng)臨床鑒定沒有內(nèi)科和外科并發(fā)癥。在連續(xù)監(jiān)測(cè)期間，在進(jìn)行各種并發(fā)癥的臨床診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)血漿ALB mRNA濃度升高。在不穩(wěn)定組中，記錄的14次并發(fā)癥發(fā)作中有13次與ALB mRNA濃度升高相關(guān)。實(shí)際上，在大多數(shù)發(fā)作中，血漿ALB mRNA濃度在進(jìn)行診斷的時(shí)間之前升高。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)，血漿ALB mRNA是在早期診斷肝病變中有用的靈敏標(biāo)志物。對(duì)于大多并發(fā)癥的急性發(fā)作，血漿ALT活性-濃度并未升高。該觀測(cè)結(jié)果表明，對(duì)于肝病變，血漿ALB mRNA是比ALT更靈敏的標(biāo)志物。另一方面，血漿ALB mRNA濃度升高對(duì)肝病變出現(xiàn)是特異性的。從穩(wěn)定組得到的大多測(cè)量值低于以前確定的用于肝疾病檢測(cè)的截止值。穩(wěn)定組的2名受體具有短暫升高的血漿ALB mRNA濃度。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與臨床上未鑒定的短暫性肝相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)。
總之，血漿ALB mRNA濃度升高允許靈敏和特異地檢測(cè)肝病變，甚至是在受體沒有癥狀、血漿ALT活性-濃度正常及臨床未懷疑有并發(fā)癥時(shí)的階段。因而，測(cè)量血漿ALB mRNA濃度用作篩選肝病變和常規(guī)檢查可能發(fā)生肝相關(guān)并發(fā)癥的人的有用方法。由于本項(xiàng)目研究的大多數(shù)肝移植受體已從他們?cè)鹊母渭膊『鸵浦仓型耆謴?fù)，發(fā)明人在本研究中所做的觀測(cè)結(jié)果可以應(yīng)用于以前沒有肝疾病史或已從以前的肝疾病發(fā)作中恢復(fù)的任何人。實(shí)施例3 :升高的血漿白蛋白mRNA濃度用于檢測(cè)脂肪肝病脂肪肝病，包括非酒精性脂肪肝病，是富裕國(guó)家中最常見的慢性肝疾病(Farrellet al. , J Gastroenterol Hepatol 2007;22:775-7)。其可發(fā)展成肝硬化和肝癌。非酒精性脂肪肝病與代謝綜合征和中心性肥胖密切相關(guān)(Wong et al. , Clin GastroenterolHepatol 2006;4:1154-61)。超聲掃描可以用于診斷脂肪肝。然而，超聲掃描依賴于操作者，并且對(duì)脂肪肝診斷具有有限的靈敏度和特異性。肝活檢和組織學(xué)檢查提供脂肪肝及任何相關(guān)的肝炎癥或纖維化的權(quán)威性證據(jù)，但是活檢是侵入性操作，且可導(dǎo)致急性并發(fā)癥如出血。隨著技術(shù)的改進(jìn)，現(xiàn)在可能使用質(zhì)子磁共振波譜(MRS)作為測(cè)量肝甘油三酯(IHTG)即脂肪肝的指示物含量的靈敏和非侵入性的技術(shù)(Szczepaniak et al. ,Am J Physiol Endocrinol Metab 2005 ；288:E462-8)。然而，MRS成像耗費(fèi)時(shí)間，需要專業(yè)成像設(shè)備和受培訓(xùn)的專業(yè)操作人員。在本研究中，發(fā)明人檢查了與健康對(duì)照相比時(shí)，患有脂肪肝的患者的血漿ALB mRNA是否升高。I.材料與方法對(duì)明顯健康的志愿者進(jìn)行MRS。測(cè)量IHTG含量。具有IHTG含量< 5%的個(gè)體被認(rèn)為具有健康肝，而具有IHTG含量> 5%的個(gè)體被診斷為患有脂肪肝病。此外，本研究還包括通過肝活檢的組織學(xué)檢查被診斷為患有脂肪肝病的個(gè)體。將全部招募的個(gè)體的外周血采集到EDTA血液管。通過如前面實(shí)施例所述的二次離心方案處理血樣，以獲得血漿。使用如前面實(shí)施例所述的RT-qPCR檢測(cè)測(cè)量血漿ALB mRNA濃度。II.結(jié)果通過MRS發(fā)現(xiàn)136名志愿者的IHTG含量<5%，因而將其招募為正常對(duì)照。通過MRS發(fā)現(xiàn)47名個(gè)體的IHTG含量> 5%，由此診斷為患有脂肪肝病。通過肝活檢組織學(xué)檢查將35名個(gè)體診斷為患有脂肪肝病。與對(duì)照相比時(shí)，患有脂肪肝病的病例的血漿ALB mRNA濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高(曼-惠特尼P < 0. 001)(圖13)。如果將脂肪肝病病例再分成通過MRS診斷或肝活檢診斷，比較同樣是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(克-瓦二氏檢驗(yàn)，之后是成對(duì)比較，三組之間的全部成對(duì)比較P < 0. 0001)(圖14)。測(cè)量這些患者的血漿ALT，其在大多病例中并未升高(圖15)。即使是通過肝活檢診斷為患有脂肪肝病的組，46% (16/35)的ALT活性-濃度位于參考截止值之內(nèi)。III.討論脂肪肝病被認(rèn)為是可發(fā)展成肝纖維化、肝硬化、甚至是HCC早期肝病變。與對(duì)照相比時(shí)，脂肪肝病患者的血漿ALB mRNA升高，表明血漿ALB mRNA的確是其靈敏度足以檢測(cè)諸如脂肪肝病的早期肝病變的標(biāo)志物。通過肝活檢診斷患有脂肪肝病的組，通常比那些通過MRS診斷的組患有更高級(jí)階段的脂肪肝病。這是因?yàn)楦位顧z組的個(gè)體具有癥狀或異常生化肝功能檢測(cè)參數(shù)來保證被推薦用于肝活檢，而MRS組包含無癥狀的志愿者。數(shù)據(jù)顯示通過肝活檢診斷的組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于通過MRS診斷的脂肪肝病病例的血漿ALB mRNA濃度。該觀測(cè)結(jié)果表明，血漿ALB mRNA濃度與肝病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，因而是可用于評(píng)估疾病階段、用于預(yù)后和用于治療監(jiān)測(cè)的工具。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，對(duì)于檢測(cè)脂肪肝病和其他早期肝病變，ALT是不如血漿ALB mRNA靈敏的標(biāo)志物。 基于所呈現(xiàn)的實(shí)例獲得的數(shù)據(jù)，始終表明，血漿ALB mRNA是包括肝細(xì)胞損傷、死亡或凋亡的肝病變的靈敏標(biāo)志物。與健康對(duì)照相比時(shí)，肝病變個(gè)體的血漿ALB mRNA的濃度變得升高，所述肝病變包括肝細(xì)胞損傷、死亡或凋亡。這種肝或肝膽病變包括急性疾病狀況，例如急性肝炎，包括那些由于中毒或病毒原因所致急性肝炎，缺氧性損傷，膽管炎和急性膽道梗阻。這種肝或肝膽病變還包括慢性疾病狀況，例如慢性肝炎，包括由于乙型肝炎或丙型肝炎病毒所致的慢性肝炎，脂肪肝病，肝纖維化，肝硬化，肝細(xì)胞癌，但不包括肝移植后復(fù)發(fā)的那些慢性病癥。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，與健康對(duì)照相比，血漿ALB mRNA升高的幅度與肝病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，因?yàn)槠淇赡芊从吵龈渭?xì)胞損傷、死亡或凋亡的程度。因而，可以將血漿ALBmRNA濃度用于預(yù)后和監(jiān)測(cè)以上所列的所有肝病變的治療有效性。同樣，已顯示血漿ALB mRNA升高的靈敏度足以檢測(cè)早期肝疾病，如脂肪肝病。全部肝病變包括肝細(xì)胞損傷、死亡或凋亡。因而，升高的血漿ALB mRNA作為用于肝病變?cè)缙跈z測(cè)的靈敏標(biāo)志物同樣是有用的，所述肝病變例如乙型肝炎病毒攜帶者發(fā)展成活動(dòng)性肝炎、肝硬化代償失調(diào)或進(jìn)程、早期肝細(xì)胞癌，但是不包括肝移植后復(fù)發(fā)的那些肝病變。為了所有目的,本申請(qǐng)中引用的全部專利、專利申請(qǐng)和其他出版物,包括GenBank登錄號(hào)通過引用整體并入。表I有信息的移植受體和供體的ALB基因型
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)肝疾病的方法，所述方法包括以下步驟 (a)測(cè)定取自沒有肝疾病指征的個(gè)體的無細(xì)胞血樣中白蛋白mRNA的濃度；以及 (b)將步驟(a)的所述白蛋白mRNA的濃度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較，其中所述步驟(a)的濃度與所述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相比增加表示所述個(gè)體中存在肝疾病。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述個(gè)體具有正常的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)結(jié)果。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述肝疾病是脂肪肝病、肝硬化、肝纖維化或肝炎。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述肝炎是乙型肝炎。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述肝疾病是威爾森氏癥、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏癥或糖原貯積病。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)的白蛋白mRNA的濃度與所述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照基本上相同，從而表示所述個(gè)體沒有肝疾病。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述血樣是血漿。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述血樣是血清。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)包括擴(kuò)增白蛋白mRNA序列。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述擴(kuò)增是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述PCR是反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述PCR是數(shù)字PCR。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述PCR是實(shí)時(shí)定量PCR。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)包括質(zhì)譜分析或與微陣列、熒光探針或分子信標(biāo)雜交。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其還包括在稍后時(shí)間利用來自所述個(gè)體的同一類型的無細(xì)胞血樣重復(fù)步驟(a)，其中與原步驟(a)相比在稍后時(shí)間所述白蛋白mRNA的濃度增加，表示所述肝疾病的惡化，而降低表示所述肝疾病的改善。
16.如權(quán)利要求6所述的方法，其還包括在稍后時(shí)間利用來自所個(gè)體的同一類型的無細(xì)胞血樣重復(fù)步驟(a)，其中與原步驟(a)相比，在稍后時(shí)間所述白蛋白mRNA的濃度增加表示肝出現(xiàn)疾病，而基本沒有差異則表示沒有肝疾病的生理狀況。
17.如權(quán)利要求I或15所述的方法，其中以至少I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差從標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照增加或降低。
18.如權(quán)利要求I或15所述的方法，其中以至少2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差從標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照增加或降低。
19.如權(quán)利要求I或15所述的方法，其中以至少3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差從標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照增加或降低。
20.用于診斷沒有肝疾病指征的個(gè)體中肝疾病的試劑盒，其包含(I)提供健康個(gè)體血樣中白蛋白mRNA平均量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；以及(2)用于特異性擴(kuò)增至少部分白蛋白mRNA的兩種寡核苷酸引物。
21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其還包含說明手冊(cè)。
22.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其還包括用于與白蛋白編碼序列特異性雜交的多核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)沒有任何肝病變指征的中肝疾病的新方法，所述方法通過測(cè)定來自所述個(gè)體的無細(xì)胞血樣中白蛋白mRNA濃度的量，然后將白蛋白mRNA的量或濃度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照進(jìn)行比較。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102741426SQ201080049558
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者盧煜明, 趙慧君, 陳穎欣 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)