專利名稱：凝血酶原復(fù)合體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備包含凝血因子II、VII、IX和X的凝血酶原復(fù)合體的組合物或濃縮物的方法。本發(fā)明還提供可通過此方法獲得的組合物。
背景技術(shù)：
制備依賴于維生素K的蛋白質(zhì)的濃縮物，更尤其是包含凝血因子II、VII、IX和X 的凝血酶原復(fù)合體(也稱為PPSB)的濃縮物是在患有一種或多種凝血因子缺乏和/或患有某些高分子量蛋白質(zhì)缺乏的血友病患者中預(yù)防或治療出血性事故的基礎(chǔ)。在出血期過程中，患者經(jīng)受PPSB治療，并因此接受大劑量的通常與PPSB共純化的血漿蛋白質(zhì)，其可以導(dǎo)致出現(xiàn)繼發(fā)效應(yīng)，如過敏性休克、炎癥型反應(yīng)和耐受問題。免疫球蛋白M和產(chǎn)生自因子C3、C4、C5的活化的因子C3a、Wa或C5a (也稱為過敏毒素)的情況尤其如此。因子C3a、Wa*C5a(尤其是C3a)參與變應(yīng)性炎癥。補(bǔ)體片段Cfe和C3a對肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的活化實(shí)際導(dǎo)致白三烯和組胺的釋放，這也是毛細(xì)血管通透性增加、 支氣管收縮增加和血管舒張?jiān)黾拥钠鹨?。為了避免在用于純化維生素K依賴性因子的方法過程中形成這些片段，因此優(yōu)選去除它們各自的前體，即補(bǔ)體系統(tǒng)的因子C3、C4或C5。除了組成PPSB的因子II、VII、IX和X外，至今市售的PPSB濃縮物，如Kaskadi 1 (Jfeg “Laboratoire Fran9ais du Fractionnement et des Biotechnologies") i者[^
含大比例(約80%)的污染蛋白質(zhì)。濃度最大的維生素K依賴性蛋白質(zhì)是凝血酶原或因子 II (就Kaskadil中約35_45Mg/mL的總蛋白質(zhì)濃度而言，其濃度在4. 5Mg/mL的等級(jí))。因此，存在對允許更高的PPSB純度，且能夠保留組成它的因子II、VII、IX和X的活性和各自比例的方法的明顯需要。JC # EP-A-0528701 ( "Association pour Γ essor de la transfusion sanguine")描述了用于制備預(yù)期用于治療用途的人凝血酶，且包括在DEAE-kphadex A50樹脂上純化血漿冷沉物上清液、再鈣化和病毒滅活包含PPSB的洗脫物的連續(xù)步驟的方法。文件US-P-4411794描述了用于純化凝血因子II、VII、IX和X的方法，其包括在存在鈣離子的情況下用羥基磷灰石型礦物支持物上的硫酸銨吸附血漿沉淀物上清液的步驟， 隨后是硅膠上的純化步驟和透析。但是，由此產(chǎn)生的PPSB濃縮物似乎包含許多污染蛋白質(zhì)，不具有所需要的純度來滿足關(guān)于血液衍生產(chǎn)品的健康安全性的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)。硫酸銨尤其不適合用于治療用途，且具有相對毒性。文件US-P-4272523描述了用于從血漿冷沉物上清液分級(jí)分離血漿的方法。此專利尤其描述了通過累加硅膠上的冷沉物上清液吸附步驟、透析/超濾、羥基磷灰石型磷酸三鈣上的吸附和DEAE-kphadex型陰離子交換樹脂上的吸附來制備PPSB濃縮物。但是，用來去除諸如纖維蛋白原的高分子量蛋白質(zhì)的硅膠上的純化步驟和磷酸三鈣上的純化步驟似乎以分批吸附(批次)的形式發(fā)生，該實(shí)施由于其低的可重復(fù)性及其自動(dòng)化的困難而證明難以應(yīng)用在工業(yè)規(guī)模上。事實(shí)上，磷酸三鈣難于控制，因?yàn)樗憩F(xiàn)為對濕度測量法敏感的粉末和包括可以取決于批次而變的內(nèi)在特征。因此，文件US-P-4272523的方法證明不適合用于大規(guī)模制備預(yù)期用于治療用途的PPSB濃縮物。文件EP-A-0832200描述了用于純化重組FXI的組合物的方法，其包括在陰離子交換樹脂上、在肝素樹脂上和然后在羥基磷灰石樹脂上的連續(xù)層析步驟。此文件未涉及凝血酶原復(fù)合體的因子，且起始產(chǎn)物是重組因子的組合物，且不是人來源的。文件W02006/075664描述了用于純化重組FVII的方法，其包括羥基磷灰石上的層析步驟，不預(yù)處理包含重組FVII的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
申請人:驚奇地發(fā)現(xiàn)，組合了用于制備血漿冷沉物上清液、陰離子交換樹脂上的層析和羥基磷灰石上的層析的步驟用于純化依賴于維生素K的蛋白質(zhì)，尤其是凝血酶原復(fù)合體的濃縮物的方法允許工業(yè)制備具有高純度的PPSB濃縮物。通過本發(fā)明制備的PPSB基本上無任何污染蛋白質(zhì)，且它所包含的因子II、VII、IX和X具有高比活性。本發(fā)明的方法最尤其是因所實(shí)施的純化步驟的減少的數(shù)目和可重復(fù)性，及因用羥基磷灰石層析包含諸如纖維蛋白原、纖連蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白質(zhì)的高分子量蛋白質(zhì)的洗脫物而區(qū)別于至今已知的純化方法。本發(fā)明的目的是用于制備凝血酶原復(fù)合體組合物的方法，其包括以下步驟a)提供血漿冷沉物的上清液；b)將該上清液應(yīng)用在陰離子交換樹脂上，并洗脫在包含該復(fù)合體和高分子量蛋白質(zhì)的洗脫物中；c)將產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物應(yīng)用在羥基磷灰石柱上；d)洗脫在包含該復(fù)合體的洗脫液中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括附加的預(yù)洗脫步驟Cl)，優(yōu)選用尤其是濃度為從0. 005至0. 05M、有利地從0. 01至0. 05M、有利地從0. 02至0. 05M和優(yōu)選為0. 03M的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液，在包含在6. 5和8. 5之間、優(yōu)選約為8的pH值下進(jìn)行該預(yù)洗脫，該緩沖液還包含0. 25M NaCl。更優(yōu)選地，用優(yōu)選0. 5M的磷酸鉀緩沖液、0. 075M NaCUpH 8進(jìn)行步驟d)的洗脫。有利地，本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物和/或產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物的病毒滅活的至少一個(gè)附加步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選在存在吐溫(聚山梨酸酯80)-TnBP混合物的情況下，優(yōu)選用(ν/ν)聚山梨酸酯80-0. 3% (v/v)TnBP混合物， 以溶劑-去垢劑處理的形式對產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物進(jìn)行該至少一個(gè)病毒滅活步驟。在具體實(shí)施方案中，以UV-C(紫外線C)處理、辛酸鹽離子處理和/或干熱處理進(jìn)行該至少一個(gè)病毒滅活步驟。有利地，通過以具有包含在例如15nm和IOOnm之間的孔隙度的一個(gè)或幾個(gè)濾器上、優(yōu)選具有例如15nm孔隙度的至少一個(gè)濾器上、尤其是來自Asahi的Planova 15N 濾器上的納米過濾，例如一次或幾次納米過濾，對產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物進(jìn)行的病毒去除步驟來完成該至少一個(gè)病毒滅活步驟，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在步驟b)之后和/或步驟d)之后包括至少一個(gè)附加的滲濾-超濾步驟。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法的步驟b)包括在兩種不同陰離子交換樹脂上實(shí)施的兩個(gè)亞步驟。在具體實(shí)施方案中，步驟b)的陰離子交換樹脂具有選自二乙氨基乙烷(DEAE)、 聚乙烯亞胺(PEI)和四級(jí)氨基乙烷(QAE)的帶正電荷的基團(tuán)，該陰離子交換樹脂優(yōu)選屬于 DEAE 型。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在步驟b)之后或步驟d)之后加入凝血酶抑制劑，優(yōu)選抗凝血酶III或抗凝血酶III和肝素的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法制備的組合物進(jìn)一步包含依賴于維生素K 的其他蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)C、S和Z。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括最終的附加配制步驟，優(yōu)選通過凍干和/ 或加入可藥用佐劑或載體。本發(fā)明還涉及凝血酶原復(fù)合體的組合物，其可通過本發(fā)明的方法獲得，且其免疫球蛋白濃度、優(yōu)選IgM濃度低于0. 1 %，和/或其纖維蛋白原濃度低于0. 1 %，和/或其纖連蛋白濃度低于0. 1%，和/或其補(bǔ)體因子濃度低于0. 1%。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血酶原復(fù)合體組合物中FIX的平均比活性為每毫克蛋白質(zhì)至少4IU。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血酶原復(fù)合體的組合物進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Z。在具體實(shí)施方案中，由本發(fā)明的凝血酶原復(fù)合體組合物的因子II(FII)、因子 VII (FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Z組成的依賴于維生素 K的蛋白質(zhì)占該組合物總蛋白質(zhì)的最大80%、優(yōu)選85%和更優(yōu)選90%。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的凝血酶原復(fù)合體組合物作為藥物、優(yōu)選作為用于治療和預(yù)防與依賴于維生素K的因子的缺乏或抗維生素K的超劑量相關(guān)的出血性事故的藥物、或作為用于治療和預(yù)防與因子II或因子X的組成性或獲得性缺乏相關(guān)的出血性事故的藥物的用途。


圖1 因子II、IX、VII和X的洗脫產(chǎn)率對沉積在羥基磷灰石柱上的蛋白質(zhì)負(fù)載。圖2 未保留在羥基磷灰石柱上的因子II、IX、VII和X的量對所引入的蛋白質(zhì)負(fù)載。圖3 未結(jié)合的FII和FIX的百分比變化對沉積在羥基磷灰石柱上的蛋白質(zhì)負(fù)載。圖4:對應(yīng)于在羥基磷灰石上層析期間預(yù)洗脫過程中去除的蛋白質(zhì)的量的 SDS-PAGE凝膠。對應(yīng)于來自HA Biorad上的層析的預(yù)洗脫物和洗脫物的12% SDS-PAGE凝膠——非還原——沉積物10 μ g蛋白質(zhì)?？?和10 分子量標(biāo)準(zhǔn)。孔2 =PI-I0孔3 測試 3預(yù)洗脫物0. 25M NaCl?？? 測試3洗脫物?？? 測試5預(yù)洗脫物0. 25M NaCl ；30mM磷酸鹽?？? 測試5洗脫物?？? =PI-I0孔8 測試6預(yù)洗脫物0. 25M NaCl ；30mM磷酸鹽。 孔9 測試6洗脫物。圖5 過濾壓力對時(shí)間的變化。圖6 過濾流速對濾過重量的變化。
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圖7 無任何還原劑的4-12% SDS-PAGE Novex上的電泳——膠體考馬斯藍(lán)染色。 孔 1:97E 0801-PI-1。孔 2 :97E 0801-未吸附的 HA 陶瓷?？?3 :97E 0801-預(yù)洗脫?？?4: 97E 0801-洗脫?？?5:97E 0801-透析洗脫 lOkDa?？?6 :97E 0901_15nm 過濾后。孔 7: 97E 1401-15nm 過濾后?？?8 :97E 1601_15nm 過濾后?？?9 :97E 1601-最終的 15nm 存留物?？?0 =Novex分子量對照。圖8 因子IX的免疫印跡表征。孔1 :97E 1106-納米過濾前透析的HA洗脫物?？?2 和 3:97E 1106-PI-1?？?4 :97E 1504_15nm 濾過物?？?5:因子 IX HP 對照。因子 IX HP 是高純度的因子IX，即具有高于100U/mg的比活性(表示為每毫克蛋白質(zhì)的FIX單位)的因子IX濃縮物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的用于純化依賴于維生素K的蛋白質(zhì)，尤其是凝血酶原復(fù)合體的方法包括以下步驟a)提供血漿冷沉物的上清液。在具體實(shí)施方案中，可以通過Cohn分級(jí)分離獲得該血漿冷沉物上清液。在此具體情況下，證明有必要避免乙醇變性蛋白質(zhì)，因此有必要在低溫下操作或在進(jìn)行到蛋白質(zhì)吸附在羥基磷灰石上之前去除醇。在另一實(shí)施方案中，可以通過用硫酸銨鹽分級(jí)分離來獲得該血漿冷沉物上清液。在此具體情況下，證明有必要進(jìn)行透析， 以處于吸附在羥基磷灰石上的最適條件之下；b)將該上清液應(yīng)用在陰離子交換樹脂上，并洗脫在包含該復(fù)合體和高分子量蛋白質(zhì)的洗脫物中；c)將產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物應(yīng)用在羥基磷灰石柱上；d)洗脫在包含該復(fù)合體的洗脫液中。高分子量蛋白質(zhì)是具有超過300、優(yōu)選超過200、尤其是超過160或甚至超過100 的以kDa表示的麗的蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明中的羥基磷灰石樹脂可以是例如陶瓷-羥基磷灰石(陶瓷HA)、Biogel HT等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括附加的預(yù)洗脫步驟Cl)，優(yōu)選用0. OlM磷酸鉀緩沖液、0. 25M NaCUpH 8. 0或0. 03M磷酸鉀緩沖液、0. 25M NaCUpH 8. 0在室溫下進(jìn)行該預(yù)洗脫。預(yù)洗脫緩沖液的磷酸鉀濃度優(yōu)選從0.02至0.05M變動(dòng)，且優(yōu)選等于0.03M。預(yù)洗脫緩沖液的PH值優(yōu)選從pH 6. 5至pH 8. 5變動(dòng)，且優(yōu)選等于pH 8。優(yōu)選地，用0. 5M磷酸鉀緩沖液、0. 075M NaCl, pH 8進(jìn)行步驟d)的洗脫。洗脫緩沖液的PH值優(yōu)選從pH 6.5至pH 8.5變動(dòng)，且優(yōu)選等于pH 8。洗脫緩沖液的磷酸鉀濃度優(yōu)選從0. IM至0. 5M變動(dòng)，且優(yōu)選等于0. 25M。通過羥基磷灰石柱上，且優(yōu)選陶瓷羥基磷灰石柱(HA-Biorad)上的層析，有可能去除陰離子交換樹脂上的層析步驟b)過程中隨依賴于維生素K的蛋白質(zhì)(尤其是凝血酶原復(fù)合體)洗脫的高分子量蛋白質(zhì)。通過去除這些高分子量蛋白質(zhì)，有可能降低或優(yōu)選去除一般產(chǎn)生自凝血酶原復(fù)合體溶液的治療用途的繼發(fā)效應(yīng)。事實(shí)上，在羥基磷灰石上的層析過程中去除的高分子量污染蛋白質(zhì)例如包含補(bǔ)體的某些因子(如C4)，其直接或間接(例如在以過敏毒素的形式切割后)降低患者對目前市售凝血酶原復(fù)合體溶液的耐受。申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過羥基磷灰石上的單個(gè)層析步驟，有可能在無需諸如硅膠上的純化的預(yù)先實(shí)施的情況下去除包含在血漿冷沉物上清液中的大部分高分子量污染蛋白質(zhì)，例如，還去除了諸如纖維蛋白原、纖連蛋白、Ig的蛋白質(zhì)。羥基磷灰石上的層析還提供了在它們的純化過程中不改變依賴于維生素K的因子各自的比例的可能性，因?yàn)橥ㄟ^本發(fā)明的方法獲得的凝血酶原復(fù)合體濃縮物中因子II、 VII、IX或X之間的比值與見于天然血漿中的比值極其可比。結(jié)果是，產(chǎn)生自羥基磷灰石上的層析的凝血酶原復(fù)合體組合物(依賴于維生素K 的蛋白質(zhì)的濃縮物)被顯著富集。相對于蛋白質(zhì)含量，此凝血酶原復(fù)合體組合物或蛋白質(zhì)濃縮物的含量是約60%、優(yōu)選約70%和更優(yōu)選約80%，且因子II、VII、IX、X的比活性相對于市售凝血酶原濃縮物，例如Kaskadil⑧顯著提高(高4至8倍，優(yōu)選高5倍)。此外，在羥基磷灰石上的層析過程中去除高分子量蛋白質(zhì)是工業(yè)優(yōu)勢，因?yàn)閺拇艘院?，它允許通過具有15nm等級(jí)孔隙度的濾器上的納米過濾來對依賴于維生素K的蛋白質(zhì)的濃縮物進(jìn)行病毒滅活。否則濾器將由于這類高分子量蛋白質(zhì)在待過濾的溶液中的存在而快速堵塞。最后，在步驟b)的陰離子交換樹脂上的層析和步驟d)的羥基磷灰石上的層析之間進(jìn)行通過溶劑-去垢劑處理的病毒滅活時(shí)，通過羥基磷灰石上的純化，有可能基本上去除存在于負(fù)載在羥基磷灰石上的蛋白質(zhì)濃縮物中的全部溶劑和去垢劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物和/或產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物的病毒滅活的至少一個(gè)附加步驟。優(yōu)選地，對產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物進(jìn)行的病毒滅活步驟對應(yīng)優(yōu)選存在吐溫(聚山梨酸酯80)-TnBP混合物的情況下、優(yōu)選使用 (v/v)聚山梨酸酯80-0. 3% (v/v)TnBP混合物的溶劑-去垢劑處理。在具體實(shí)施方案中， 以UV-C (紫外線C)處理、辛酸鹽離子處理的形式和/或通過干熱來進(jìn)行該至少一個(gè)病毒滅活步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以包括對產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物進(jìn)行，且對應(yīng)于優(yōu)選至少在具有15nm孔隙度的濾器上、優(yōu)選Plan0Va15N濾器(Asahi)上的至少一次納米過濾的用于病毒去除的第二步驟。可以藉此去除有包膜病毒和無包膜病毒。因此，本發(fā)明的方法可以包括至少一個(gè)病毒滅活步驟，該步驟旨在從病毒學(xué)的觀點(diǎn)保障預(yù)期用于治療性施用的終產(chǎn)物的安全?？梢栽谠摲椒ǖ娜我怆A段、且優(yōu)選在陰離子交換樹脂上的純化后實(shí)施用溶劑-去垢劑混合物處理、且允許滅活有包膜病毒的第一病毒滅活步驟。所使用的溶劑-去垢劑混合物可以對應(yīng)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意適宜的混合物，且優(yōu)選按上文所示組成。溶劑-去垢劑病毒滅活處理一般在基本上為室溫的溫度(例如25士 1°C )下進(jìn)行幾小時(shí)(例如7小時(shí))的時(shí)間。此外，本發(fā)明的方法還可以包括通過至少一個(gè)具有低孔隙度的濾器上，例如至少一個(gè)具有包含在15nm和IOOnm之間的孔隙度的濾器上的納米過濾的至少一個(gè)病毒去除步驟。通過這種納米過濾步驟，更尤其可能就無包膜病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒或細(xì)小病毒類型的病毒)和非常規(guī)感染性物質(zhì)(阮病毒類型)保障終產(chǎn)物的安全。在本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)，在至少一個(gè)具有15nm孔隙度的濾器上、優(yōu)選在至少一個(gè)Planova 15N濾器(Asahi)上進(jìn)行納米過濾。在具體實(shí)施方案中，在至少兩個(gè)具有不同孔隙度、優(yōu)選遞減孔隙度的濾器上進(jìn)行納米過濾。優(yōu)選在羥基磷灰石上的層析后進(jìn)行此納米過濾，因?yàn)轱@著濃度的高分子量蛋白質(zhì)(例如纖維蛋白原、纖連蛋白或IgM)在待過濾的蛋白質(zhì)提取物中的存在一般導(dǎo)致濾器的堵塞，在工業(yè)規(guī)模上實(shí)施該方法時(shí)更甚。產(chǎn)生自包括前述兩個(gè)病毒滅活步驟的方法的PPSB濃縮物證明符合EMEA或FDA就血漿和生物技術(shù)制品提出的國際建議，因?yàn)樗蠠o包膜病毒和裸病毒二者所需的安全性條件。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在步驟b)之后和/或步驟d)之后包括至少一個(gè)附加的滲濾-超濾步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括陰離子交換樹脂上的兩個(gè)層析亞步驟。 然后存在附加的步驟1^2)，該步驟包括將步驟b)的洗脫物應(yīng)用于第二陰離子交換樹脂上，并洗脫包含高分子量蛋白質(zhì)的依賴于維生素K的蛋白質(zhì)的濃縮物。優(yōu)選地，該第二陰離子交換樹脂是DEAE-S印harose型樹脂，且優(yōu)選DEAE-Sepharose FF (Amersham)。 DEAE-kpharose樹脂具有耐受壓力以及通常用來消毒和再生凝膠的氫氧化鈉處理的優(yōu)點(diǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括最終的附加配制步驟，其優(yōu)選通過凍干和/ 或加入可藥用佐劑或載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，配制后獲得的產(chǎn)物包含0. 13M NaCl、2g/L 精氨酸、28/1賴氨酸、38/1檸檬酸鈉，且具有從6.9至7. 1的pH值。在另一實(shí)施方案中，配制后獲得的產(chǎn)物包含10g/L精氨酸、35g/L甘露醇，且具有從6. 9至7. 1的pH值。在另一實(shí)施方案中，配制后獲得的產(chǎn)物包含45g/L甘露醇，且具有從6. 9至7. 1的pH值。在另一實(shí)施方案中，配制后獲得的產(chǎn)物包含lg/L檸檬酸鈉、35g/L甘露醇，且具有從6. 9至7. 1的pH 值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括加入凝血酶抑制劑，優(yōu)選抗凝血酶III或抗凝血酶III和肝素的混合物的步驟?？鼓缚梢詠碓从谌搜獫{或具有重組人來源，例如由GTC Biotherapeutics銷售的Atryn 。可以在步驟b)之后和/或步驟d)之后進(jìn)行此加入。優(yōu)選地，在產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物的溶劑-去垢劑處理之后，或在產(chǎn)生自步驟d) 的洗脫物的納米過濾之前進(jìn)行凝血酶抑制劑的加入。還可以以與針對抗凝血酶提出的那些相同的濃度將肝素的輔因子II用作凝血酶抑制劑。通過加入凝血酶抑制劑，有利地有可能防止或限制凝血酶原(FII)在本發(fā)明的方法過程中實(shí)施的純化步驟中活化為凝血酶。通過本發(fā)明的方法獲得的依賴于維生素K的蛋白質(zhì)的濃縮物中凝血酶活性的缺乏使得它與在人類中用作治療性或預(yù)防性藥物相容，且允許令人滿意地保存此濃縮物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法的步驟b)的陰離子交換樹脂具有選自二乙氨基乙烷 (DEAE)、聚乙烯亞胺(PEI)和四級(jí)氨基乙烷(QAE)的帶正電荷的基團(tuán)。此陰離子交換樹脂更優(yōu)選是由GE Healthcare銷售的DEAE-S^hadex A-50 。通過步驟b)的層析，有可能去除由清蛋白、免疫球蛋白(在某種程度上除了某些Ig，如IgM)、抗凝血酶III和α-抗胰蛋白酶組成的蛋白質(zhì)的一部分(其可以是顯著的)。通過逐漸增加離子力來進(jìn)行吸附在陰離子交換樹脂上的血漿蛋白質(zhì)的回收。在具體實(shí)施方案中，然后可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，例如在親和凝膠上獨(dú)立純化步驟d)之后獲得的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及凝血酶原因子(可通過上文所述的方法獲得的依賴于維生素K的蛋白質(zhì))的濃縮物。此蛋白質(zhì)濃縮物優(yōu)選包含因子ΙΙ、ν Ι、ΙΧ和X，且具有低于0. (基于濃縮物總蛋白質(zhì)水平的百分比)的IgM濃度、低于0.1% (基于濃縮物總蛋白質(zhì)水平的百分比)的纖維蛋白原濃度、低于0.1%的纖連蛋白濃度和低于0.1%的補(bǔ)體因子濃度。優(yōu)選地，本發(fā)明的濃縮物還包含蛋白質(zhì)C、S和Z，且具有至少4IU/毫克蛋白質(zhì)的平均FIX比活性。最后，本發(fā)明涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的凝血酶原因子的濃縮物作為藥物， 且更尤其是作為用于治療和預(yù)防與依賴于維生素K的因子的缺乏，如因子II或因子X的組成性缺乏，或抗維生素K的超劑量相關(guān)的出血性事故的藥物的用途。通過以下實(shí)施例以更詳細(xì)的方式闡述本發(fā)明的方法。這些實(shí)施例描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，不能認(rèn)為其限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 純化依賴于維生素K的蛋白質(zhì)的濃縮物所實(shí)施的實(shí)驗(yàn)條件。
A-血漿冷沉物上清液的制備作為起始材料，使用了血漿冷沉物上清液，其是通過在0_3°C下冷凍-解凍和離心冷凍的新鮮血漿獲得的。為了在低于4°的溫度下分離主要由因子VIII、纖連蛋白和纖維蛋白原組成的不可溶性冷沉物，在低于2V的溫度下在血漿分級(jí)分離上游完成冷沉。通過在接近+4°C的溫度下連續(xù)離心來從上清液分離冷沉物。將離心上清液稱為冷上(cryosupernatant)。冷上清液基本上包含清蛋白、免疫球蛋白以及包括由凝血酶原(因子II)、因子 VII、因子IX、因子X、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Z組成的維生素K依賴性因子的其他凝血因子。B-陰離子交換樹脂上的層析以下步驟包括在吸附在弱陰離子交換凝膠DEAE Sephadex A_50( 二乙氨乙基 Sephadex)上后制備富集維生素K依賴性因子的級(jí)分。將冷上清液加熱至+10°C的最低溫度(+16至18°C最佳)。在DEAE-kphadex凝膠上純化此冷上清液之前，若有必要，可以在1 μ m濾器上和然后在0. 5 μ m濾器上對其進(jìn)行澄清過濾。純化的冷上清液的體積通常從2，000至3，000升。每升純化的冷上清液使用約 1.5g 干 DEAE-Sephadex0純化前，膨脹DEAE-kphadex粉末(3次洗滌)，每次洗滌后在不銹鋼網(wǎng)上篩選凝膠。在具有攪拌槳和可以使流體逃逸但保留DEAE-kphadex球珠的罐底刪檔(篩)的容器中，在0. 075M氯化鈉溶液中進(jìn)行DEAE-kphadex的制備、膨脹和平衡。在室溫(15_25°C ) 下進(jìn)行DEAE-S印hadex的膨脹操作。通過測量流出物的重量摩爾滲透壓濃度來控制最終的凝膠平衡。在平衡所提供的流速后，以400kg/小時(shí)的流速將17士 1°C的優(yōu)選溫度下的冷上清液連續(xù)送至經(jīng)膨脹和平衡的DEAE-kphadex上。從而伴隨連續(xù)攪拌，使全部冷上清液與DEAE-kphadex接觸，允許依賴于維生素K 的因子在凝膠上不斷結(jié)合。然后以每2，200升純化的冷上清液140升緩沖液的量用包含0. 2MNaCl、10mM檸檬酸，PH 7的緩沖液洗滌凝膠3次。以每2，200升純化的冷上清液75升緩沖液的量，利用2M NaCl、10mM檸檬酸、pH 7 的緩沖液完成依賴于維生素K的蛋白質(zhì)(和與它們共純化的高分子量蛋白質(zhì))的洗脫。然后通過常規(guī)手段脫鹽洗脫過程中獲得的蛋白質(zhì)級(jí)分，即通過用具有IOkDa和可選地30kDa截留閾值的盒超濾，并對pH 7的0. 15M NaClUOmM檸檬酸緩沖液透析。在本申請的范圍內(nèi)，將產(chǎn)生自DEAE-S^hadex上的純化的蛋白質(zhì)洗脫物稱為 "PPSB 中間產(chǎn)物 1” 或"PPSB-PI-1”。在純化方法的此階段，證明有可能冷凍PPSB-PI-1，同時(shí)等待此階段的產(chǎn)生自 DEAE-Sephadex的洗脫物的其他純化步驟的實(shí)施。C-溶劑-去垢劑處理病毒滅活然后通過用溶劑-去垢劑混合物處理，更具體而言，通過用(1% ν/ν)聚山梨酸酯 80-(0. 3% ν/ν)磷酸三正丁酯(TnBP)處理來對PPSB-PI-I進(jìn)行病毒滅活。在從M至25°C 的溫度下進(jìn)行病毒滅活處理至少6小時(shí)的時(shí)間。在15 30°C但優(yōu)選約25°C的溫度下，在存在TnBP的情況下，可以將其他去垢劑用作聚山梨酸酯的替代物，如濃度在0.5 2%的范圍內(nèi)的膽酸酯或辛苯聚醇(Triton X100)。進(jìn)行病毒滅活的最少孵育時(shí)間是4小時(shí)，但此孵育可以延長至12小時(shí)。一般應(yīng)用的PH值在6 8的范圍內(nèi)，總蛋白質(zhì)濃度在10 40g/L的范圍內(nèi)。D-羥基磷灰石HA上的層析D.1-凝膠的填充所使用的層析凝膠是具有40微米的粒徑的大量制備陶瓷羥基磷灰石(Biorad)。 將干凝膠懸浮在PH 6.8的0.4M磷酸鹽緩沖液中，然后轉(zhuǎn)入Wiarmacia K50/30柱。以 lOOcm/h的流速完成填充。所使用的量是30g干凝膠，其提供50mL填充凝膠的柱。用5個(gè)柱體積的2M NaOH漂洗柱，并保存在2M NaOH中。D. 2-待注射至柱上的PPSB-PI-I的制備若有必要，解凍PPSB-PI-I，并在存在1 %聚山梨酸酯80和0. 3% TnBP的情況下進(jìn)行3小時(shí)的病毒滅活。然后可選地用20mM芐脒溶液1/2稀釋經(jīng)病毒滅活的PPSB-PI-I ；用 0. IM NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8。D. 3-層析將柱連接至具有工業(yè)檢測單元的Wiarmacia UV檢測器，并在^Onm記錄流出物的光密度。用5體積的預(yù)平衡緩沖液(0. 4M磷酸鉀、pH 6. 8)洗滌保存在2M NaOH中的凝膠。然后用15體積的平衡緩沖液(0. OlM磷酸鉀、0. 075M NaClUOmM芐脒(可選)、pH 8)平衡柱。然后以lOOcm/h的流速注入PPSB溶液，并用平衡緩沖液洗滌柱，直至回到基線。用預(yù)洗脫緩沖液(0. OlM磷酸鉀、0. 25M NaClUOmM芐脒、pH 8或0. 03M磷酸鉀、 0.25M NaCl、芐脒IOmM(可選)、pH 8)以相同的流速進(jìn)行預(yù)洗脫，并收集5個(gè)柱體積的預(yù)洗脫物。然后用15體積的相同緩沖液洗滌凝膠。用洗脫緩沖液(0.5M磷酸鉀、0.075M NaClUOmM芐脒(可選)、pH 8)以相同的流速進(jìn)行洗脫，并收集5個(gè)柱體積的洗脫物。用5個(gè)柱體積的2M NaOH再生凝膠，并保存在2M NaOH 中。E-超濾和透析
對產(chǎn)生自羥基磷灰石上的層析的洗脫物進(jìn)行在具有IOkDa截留閾值的0. Im2 Sartorius ultrasart slice 聚Pi盒上完成的超濾。將洗脫物濃縮3倍，并以恒定體積對純化注射用水(pwi)透析，直至獲得70歐姆的電阻率(盒上的入口壓力為0.5巴，超濾流速為45mL/分鐘)，然后以恒定體積對5體積的透析緩沖液(3g/L檸檬酸三鈉、0. 13MNaCl、2g/L賴氨酸、2g/L精氨酸、pH 7)透析。然后再濃縮產(chǎn)物兩次，并用透析緩沖液漂洗盒，以獲得等于起始體積的80%的終體積。最后冷凍產(chǎn)物并保存在_40°C，若需要，隨后可以在具有15nm孔隙度的濾器上過濾。F-測定測定(通過測量誘導(dǎo)凝固的能力)組成凝血酶原復(fù)合體(或PPSB)的凝血因子 II (FII)、因子VII (FVII)、因子IX(FIX)和因子X(FX)的量和/或濃度，并測量凝血酶活性。還利用由 Stago銷售的試劑盒Asserachrom Total Protein S禾口Asserachrom Protein C測定了 C、S蛋白質(zhì)的量和/或濃度。利用由 Stago 銷售的試劑盒 Asserachrom VII Ag、Asserachrom ⑧ IX: Ag、 Asserachrom X:Ag、Asserachrom Protein Z，通過 ELISA 完成因子 VII、IX、X 和蛋白質(zhì) Z的抗原測定。測量了聚山梨酸酯80和TnBP的量和/或濃度。實(shí)施例2:實(shí)驗(yàn)結(jié)果A 柱容量的研究在與上文所述的那些相同的實(shí)驗(yàn)條件下，用每毫升凝膠3、5、7和9mL經(jīng)病毒滅活的PPSB-PI-I的劑量測試了羥基磷灰石柱的容量。未進(jìn)行預(yù)洗脫。針對各因子計(jì)算的產(chǎn)率對應(yīng)于產(chǎn)生自羥基磷灰石的洗脫物中的凝固單位總量與 PPSB-PI-I中的凝固單位總量之比。按照負(fù)載獲得的產(chǎn)率詳述于以下表I中ΜΛ-因子II、IX、VII和X取決于凝膠上的負(fù)載的洗脫產(chǎn)率
權(quán)利要求
1.用于制備凝血酶原復(fù)合體組合物的方法，其包括以下步驟a)提供血漿冷沉物的上清液；b)將所述上清液應(yīng)用在陰離子交換樹脂上，并洗脫在包含所述復(fù)合體和具有高分子量的蛋白質(zhì)的洗脫物中；c)將產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物應(yīng)用在羥基磷灰石柱上；d)洗脫在包含所述復(fù)合體的洗脫液中。
2.權(quán)利要求1的方法，其包括附加的預(yù)洗脫步驟cl)，優(yōu)選用尤其是濃度從0.005 0. 05M、有利地從0. 01 0. 05M、有利地從0. 02 0. 05M和優(yōu)選為0. 03M的磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液，在包含于6. 5和8. 5之間、優(yōu)選約為8的pH值下進(jìn)行所述預(yù)洗脫，所述緩沖液還優(yōu)選有利地以0. 25M的濃度包含NaCl。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中用優(yōu)選0.5M的磷酸鉀緩沖液、0. 075M NaCUpH 8進(jìn)行步驟d)的洗脫。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括至少一個(gè)用于產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物和/或產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物的病毒滅活的附加步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中優(yōu)選在存在吐溫(聚山梨酸酯80)-TnBP混合物的情況下， 優(yōu)選用(ν/ν)聚山梨酸酯80-0. 3% (v/v)TnBP混合物，以溶劑-去垢劑處理的形式對產(chǎn)生自步驟b)的洗脫物進(jìn)行所述至少一個(gè)病毒滅活步驟。
6.權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)的方法，其包括優(yōu)選在具有15至IOOnm孔隙度的濾器上、 優(yōu)選在具有15nm孔隙度的濾器上以納米過濾的形式對產(chǎn)生自步驟d)的洗脫物進(jìn)行的至少一個(gè)附加的病毒去除步驟。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其在步驟b)之后和/或步驟d)之后包括至少一個(gè)附加的滲濾-超濾步驟。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括在兩種不同陰離子交換樹脂上實(shí)施的兩個(gè)亞步驟。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的陰離子交換樹脂具有選自二乙氨基乙烷(DEAE)、聚乙烯亞胺(PEI)和四級(jí)氨基乙烷(QAE)的帶正電荷的基團(tuán)，所述陰離子交換樹脂優(yōu)選屬于DEAE型。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括在步驟b)之后或步驟d)之后加入凝血酶抑制劑，優(yōu)選抗凝血酶III或抗凝血酶III和肝素的混合物。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含依賴于維生素K的其他蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)C、S和Z。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包括最終的附加配制步驟，優(yōu)選通過凍干和/或加入佐劑或可藥用載體。
13.凝血酶原復(fù)合體組合物，其可通過權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法獲得，且其免疫球蛋白、優(yōu)選IgM的濃度低于0. 1 %，和/或其纖維蛋白原濃度低于0. 1 %，和/或其纖連蛋白濃度低于0. 1 %，和/或其補(bǔ)體因子濃度低于0. 1 %。
14.權(quán)利要求13的凝血酶原復(fù)合體組合物，其FIX的平均比活性為每毫克蛋白質(zhì)至少4IU。
15.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的凝血酶原復(fù)合體組合物，其進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Ζ。
16.權(quán)利要求15的凝血酶原復(fù)合體組合物，其中，由因子II(FII)、因子VII (FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Z組成的依賴于維生素K的蛋白質(zhì)代表了所述組合物總蛋白質(zhì)的至少80 %、優(yōu)選85 %和更優(yōu)選90 %。
17.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的凝血酶原復(fù)合體組合物，其作為藥物。
18.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的凝血酶原復(fù)合體組合物，其作為用于治療和預(yù)防與依賴于維生素K的因子的缺乏或與抗維生素K的超劑量相關(guān)的出血性事故的藥物。
19.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的凝血酶原復(fù)合體組合物，其作為用于治療和預(yù)防與因子II或因子X的組成性或獲得性缺乏相關(guān)的出血性事故的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備包含II、VII、IX和X凝血因子的凝血酶原復(fù)合體的組合物或濃縮物的方法，其中該方法包括以下步驟提供血漿冷沉物的上清液；將該上清液應(yīng)用在陰離子交換樹脂上，以產(chǎn)生包含該復(fù)合體和具有高分子量的蛋白質(zhì)的洗脫物；將該洗脫物應(yīng)用在羥基磷灰石柱上，以產(chǎn)生包含該復(fù)合體的第二洗脫物。本發(fā)明還涉及可以通過該方法產(chǎn)生的組合物。
文檔編號(hào)C12N9/74GK102459583SQ201080025034
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者雅克·沙巴 申請人:法國分餾學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室