抗凝血酶iii組合物的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗凝血酶III組合物的制造方法。具體而言，本發(fā)明提供一種含有具有復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III組合物的制造方法，其中所述的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)。
【專利說(shuō)明】抗凝血酶I I I組合物的制造方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年10月8日、中國(guó)國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?00480035813.9、發(fā)明名稱為“抗凝血酶III組合物的制造方法”申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及含有具有復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III組合物的制造方法，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0003]血栓的形成會(huì)帶來(lái)血流中斷的危險(xiǎn)。由于血栓形成引起的血流中斷成為一種致命因素，活體可以通過(guò)幾種機(jī)制來(lái)控制和調(diào)節(jié)血液凝固。即，通過(guò)絲氨酸蛋白酶直接滅活活化的凝血因子[The Thrombin, Volume I (Machovich R.主編)，pp.1-21，CRCPress, Boca Raton (1982)]，基于通過(guò)活化蛋白C來(lái)降解凝血因子V和凝血因子VIII的調(diào)控機(jī)制[Progress in Hemostasis and Thrombosis, Volume7 (Spaet T.H.主編)，pp.25-54, Grune&Stratton, New York (1984)],以及通過(guò)血液中的多種絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)活化凝血因子的抑制機(jī)制。另外，還發(fā)現(xiàn)了以依賴活化X因子的方式存在的抑制
VII因子活化的組織因子抑制劑[Journal of Japanese Society on Thrombosis andHemostasis, 2, 550 (1991)]。其中最重要的機(jī)制是血液中多種絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)活化凝血因子的抑制機(jī)制。 [0004]血液中存在多種絲氨酸蛋白酶抑制劑，其含量達(dá)到總血漿蛋白的10%。已知這些抑制劑中的4種抑制劑，即抗凝血酶II1、α I蛋白酶抑制劑、α 2巨球蛋白和肝素輔助因子II對(duì)于調(diào)節(jié)血液凝固是非常重要的。在這些因子中，抗凝血酶III尤其重要，占血漿抗凝血酶活性的70%。
[0005]抗凝血酶III是含有432個(gè)氨基酸的糖蛋白，其分子量大約為59，000至65，000，并且其分子中有 3 個(gè)二硫鍵，Cys8_Cysl28、Cys21_Cys95 和 Cys247_Cys430[Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 80, 1845 (1983)]。通過(guò)這些鍵，在C端形成一個(gè)大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在這個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中存在有作為活性中心的Arg393-Ser394鍵(圖1)。人抗凝血酶III的等電點(diǎn)為5.11。N糖苷連接糖鏈結(jié)合在抗凝血酶III的4個(gè)位點(diǎn)上，即從N端數(shù)第96個(gè)、第135個(gè)、第155個(gè)和第192個(gè)天冬酰胺殘基(下文中分別稱為Asn96、Asnl35、Asnl55和Asnl92)上?？鼓窱II在人血漿中以兩種異構(gòu)形式存在，α型具有4個(gè)N糖苷連接的糖鏈，β型僅有3個(gè)N糖苷連接的糖鏈，卻沒(méi)有Asnl35上的糖鏈[Pathophysiol.Haemost.Thromb., 32, 143(2002)]，人血漿中的抗凝血酶III中，90-95%是α型，其余5-10%是β型。
[0006]結(jié)合在抗凝血酶III上的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈由N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖和甘露糖構(gòu)成(圖2)。人血漿中分布的抗凝血酶III的特性之一是它的糖鏈結(jié)構(gòu)未經(jīng)巖藻糖修飾。
[0007]抗凝血酶III已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為一種血液凝固抑制劑，在全球廣泛用于治療先天性抗凝血酶III缺陷引起的血栓形成和伴有抗凝血酶III減少的多發(fā)性血管內(nèi)血液凝固綜合征。
[0008]諸如抗凝血酶III的血液制品使用混合的人血漿樣品作為原料而生產(chǎn)。在日本，混合血漿在日本紅十字會(huì)血漿分離中心制備，在進(jìn)行6個(gè)月的儲(chǔ)存后將大約5，000至10，000名志愿者的血漿樣品混合而提供。事實(shí)上，為生產(chǎn)一批血液制品如Cross Eight M(日本紅十字會(huì))的干燥濃縮人血液凝血因子VIII制品，需要幾批從上述混合血漿中獲得的冷凍沉淀物，使用大約80，000名志愿者的血衆(zhòng)樣品[Japanese Journal of Transfusion
Medicine, 48, 27 (2002)]。
[0009]混合血漿是使用獻(xiàn)血者提供的血液樣品作為原料生產(chǎn)的，已有報(bào)道日本獻(xiàn)血者中人細(xì)小病毒B19陽(yáng)性的比例估計(jì)為0.6-0.8%[Journal of Japan Society of BloodTransfusion, 42, 231( 1996)] ?因此,可以計(jì)算出與上述Cross Eight M等量的一份制品要被相當(dāng)于大概480至640名獻(xiàn)血者的人細(xì)小病毒B19陽(yáng)性血液樣品污染。人細(xì)小病毒B19是一種直徑為18至26nm、沒(méi)有被膜的小病毒，其即使在60°C進(jìn)行熱處理30分鐘、在大約pH3下的酸處理、氯仿處理、表面活性劑處理和類似處理后仍保持其抗性[Science，2盤(pán)，114(1993)]，使得它不能被一般的病毒清除方法清除。因此，清除人細(xì)小病毒B19需要有通過(guò)清除被膜病毒專用的膜的過(guò)濾步驟，所述膜的孔徑為幾納米至幾十納米。但是，人們認(rèn)為使用孔徑這樣小的過(guò)濾步驟，即納米過(guò)濾步驟很難被許多血漿分離制品的制造方法所米用[Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002)]。人們認(rèn)為人細(xì)小病毒B19是傳染性紅斑的病因，在沒(méi)有抗-B19抗體的健康人群中一般僅顯示短暫的類似感冒的癥狀，但是在一些病例中引發(fā)慢性溶血性貧血。而且，據(jù)說(shuō)在免疫缺陷患者中有時(shí)也可誘發(fā)嚴(yán)重的急性單純紅細(xì)胞發(fā)育不全。另外，有報(bào)道稱沒(méi)有抗-B19抗體的孕婦有時(shí)引起流產(chǎn)或?qū)е挛闯錾膵雰核[，15%的子宮內(nèi)胎兒死亡B19 DNA檢查的結(jié)果呈陽(yáng)性[Lancet, 357, 1494 (2001)]。在Cross Eight M (日本紅十字會(huì))的干燥濃縮人凝血因子
VIII制品中，1997年9月報(bào)道了一例懷疑由于給予這種制品而暫時(shí)感染人細(xì)小病毒B19的病例[Journal of Japanese Society of Child Hematology, 11, 289 (1997)]。
[0010]乙型肝炎陰性、丙型肝炎陰性和人免疫缺陷病毒I和II陰性的混合血漿被用作抗凝血酶 III 血液制品如 Neuart (Mitsubishi Pharma Corporation 制造)和 Anthrobin P(Aventis Boehring制造)的制造原料,但是在原料中并未確認(rèn)是否存在人細(xì)小病毒B19。
[0011]盡管抗凝血酶III血液制品的生產(chǎn)過(guò)程中要在60°C進(jìn)行病毒滅活處理10小時(shí)，gp巴氏滅菌，仍然有許多問(wèn)題還不能完全解決，如蛋白抗凝血酶III被變性，以及AIDS病毒、人細(xì)小病毒和可引起突變型克雅氏病的朊病毒(prion)。
[0012]如上所述，使用血液制品的缺點(diǎn)在于有病毒感染的危險(xiǎn)，這種危險(xiǎn)性采用現(xiàn)有技術(shù)不能完全排除。因此，抗凝血酶III制劑的安全性需要提高。
[0013]因此，為了不使用人體血漿作為原料提供人抗凝血酶III，已經(jīng)考慮使用重組體作為其替代品。但是，采用基因重組技術(shù)制備的重組抗凝血酶III在活性上次于從天然原料如血漿中獲得的抗凝血酶III。其原因考慮是因?yàn)榻Y(jié)合在重組體上的糖鏈結(jié)構(gòu)與從血漿中制備的抗凝血酶III 不同，具體地說(shuō)，推測(cè)由于巖藻糖結(jié)合在待與重組抗凝血酶III結(jié)合的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈上，其與肝素的親和性變低，因此便不能獲得足夠的抗血液凝固活性[Journal of Biological Chemistry, 268, 17588 (1993) !Biochemistry, 35, 8881(1996)] ο迄今，有報(bào)道通過(guò)自幼年倉(cāng)鼠腎得到的BHK細(xì)胞[Journal of BiologicalChemistry.268.17588 (1993) biochemistry.35.8881 (1996)]、自中國(guó)倉(cāng)鼠(Chinesehamster )卵巢得到的CHO細(xì)胞(W002/02793 )或轉(zhuǎn)基因山羊(US2003096974)生產(chǎn)的重組抗凝血酶III，但是在每一個(gè)這些例子中，巖藻糖結(jié)合在與重組抗凝血酶III結(jié)合的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上。在產(chǎn)生的重組抗凝血酶III中，結(jié)合有巖藻糖的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈與全部復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈的比例取決于宿主細(xì)胞而變化，但是估計(jì)其范圍為39-95%。已經(jīng)采取了許多努力通過(guò)多種裝置如改善培養(yǎng)方法來(lái)減少糖鏈中結(jié)合有巖藻糖的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈的比例，但是仍然不能成功地制造糖鏈結(jié)構(gòu)與天然抗凝血酶III相同的重組抗凝血酶III。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明涉及下列(I)至(24)的內(nèi)容:
[0015](I)一種抗凝血酶III組合物的制造方法,其包括:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過(guò)將編碼抗凝血酶III的DNA導(dǎo) 入經(jīng)基因重組修飾的宿主細(xì)胞中獲得的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中形成并積累含有具有復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III組合物，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)；和從培養(yǎng)物中回收抗凝血酶III組合物。
[0016](2)根據(jù)(I)的方法，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未結(jié)合巖藻糖1-位的結(jié)構(gòu)。
[0017](3)根據(jù)(I)或(2)的方法，其中所述的宿主細(xì)胞中的基因組被修飾成:與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶活性缺失，或者與所述復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶活性缺失。
[0018](4)根據(jù)(I)至(3)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的宿主細(xì)胞中編碼與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶或者與所述復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶的基因組中的所有等位基因已經(jīng)被敲除。
[0019](5)根據(jù)(3)或(4)的方法，其中所述與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶選自⑶P-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)和⑶Ρ-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶(Fx)。
[0020](6)根據(jù)(5)的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白:
[0021](a)含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的DNA ；
[0022](b)與由SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有⑶P-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白的DNA。
[0023](7)根據(jù)(5)的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脫水酶是選自(a)、(b)和(c)的蛋白:
[0024](a)含有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的蛋白；
[0025](b)由SEQ ID N0:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白；
[0026](c)由與SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白。
[0027](8)根據(jù)(5)的方法，其中所述的⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖_3，5_差向異構(gòu)酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白:
[0028](a)含有SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的DNA ；
[0029](b)與由SEQ ID N0:9所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。
[0030](9)根據(jù)(5)的方法，其中所述的⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖_3，5_差向異構(gòu)酶是選自(a)、(b)和(C)的蛋白:
[0031](a)含有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的蛋白；
[0032](b)由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白；
[0033](c)由與SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。 [0034](10)根據(jù)(3)或(4)的方法，其中所述與所述復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶是α I, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0035](11)根據(jù)(10)的方法，其中所述的α 1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)至Cd)的DNA編碼的蛋白:
[0036](a)含有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列的DNA ；
[0037](b)含有SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列的DNA ；
[0038](c)與由SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA ；
[0039](d)與由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。
[0040](12)根據(jù)(10)的方法，其中所述的α 1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列(a)至(f)的蛋白:
[0041](a)含有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列的蛋白；
[0042](b)含有SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的蛋白；
[0043](c)由SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；
[0044](d)由SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；
[0045](e)由與SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；
[0046](f)由與SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有α?，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。[0047](13)根據(jù)(I)至至(4)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化體為FERM BP-08472、FERM BP-10083.FERM BP-10084、FERM BP-10088 或 FERM BP-10089。
[0048](14)根據(jù)(I)至(12)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是選自下列(a)至(j)的細(xì)胞:
[0049](a)來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織的CHO細(xì)胞；
[0050](b)大鼠骨髓瘤細(xì)胞系 YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20 細(xì)胞；
[0051](C)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO細(xì)胞；
[0052](d)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0_Agl4細(xì)胞；
[0053]Ce)來(lái)源于敘利亞倉(cāng)鼠(Syrian hamster)腎組織的BHK細(xì)胞；
[0054](f)人白血病細(xì)胞系Namalwa細(xì)胞；
[0055](g)胚胎干細(xì)胞；
[0056](h)受精卵細(xì)胞；
[0057](i)植物細(xì)胞；
[0058](j)酵母。 [0059](15)根據(jù)(I)至(14)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III組合物具有復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈，所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)。
[0060](16)根據(jù)(I)至(15)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未結(jié)合巖藻糖1-位的結(jié)構(gòu)。
[0061](17)根據(jù)(I)至(16)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的多肽。
[0062](18)根據(jù)(I)至(17)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的多肽。
[0063](19)根據(jù)(I)至(18)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由與SEQ IDN0:4所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的多肽。
[0064](20)根據(jù)(I)至(19)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的多肽:
[0065]Ca)含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的DNA ；
[0066](b)與由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA。
[0067](21)根據(jù)(I)至(20)中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III來(lái)自哺乳動(dòng)物。
[0068](22)通過(guò)根據(jù)(I)至(21)中任意一項(xiàng)的方法獲得的抗凝血酶III組合物。
[0069](23)含有根據(jù)(22)的抗凝血酶III組合物作為活性成分的藥物。
[0070](24)根據(jù)(23)的藥物，其為診斷、預(yù)防或治療伴有血液凝固的疾病的藥劑。
[0071]下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。本申請(qǐng)要求2003年10月9日提交的日本申請(qǐng)N0.2003-350164的優(yōu)先權(quán)，在此引入該專利申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)和/或附圖的全部?jī)?nèi)容。
[0072]本發(fā)明涉及含有具有復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈的基因重組抗凝血酶III分子的抗凝血酶III組合物的制造方法以及含有所述抗凝血酶III組合物的藥物，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)。
[0073]在本發(fā)明中，抗凝血酶III包括由下列(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(f)中的DNA編碼的蛋白，下列(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(η)或(ο)中的蛋白，和類似蛋白:
[0074](a)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA ；
[0075](b)含有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA ；
[0076](c)含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA ；
[0077](d)與由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA ；
[0078](e)與由SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA ；
[0079](f)與由SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA ；
[0080](g)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白；
[0081](h)含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白；
[0082](i)含有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白；
[0083](j)由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白；
[0084](k)由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白；
[0085](I)由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白；
[0086](m)由與SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白；
[0087](η)由與SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白；
[0088](ο)由與SEQ ID Ν0:6所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的蛋白。
[0089]編碼抗凝血酶111氨基酸序列的DNA還包括含有SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列的DNA，與由SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA。
[0090]在本發(fā)明中，在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是指使用例如含有SEQ ID N0:l、2或3所示核苷酸序列的DNA或其片段作為探針，通過(guò)集落雜交、噬菌斑雜交、DNA雜交或類似方法獲得的DNA。這些DNA的一個(gè)具體例子是可以通過(guò)在存在0.7至1.0M氯化鈉的情況下在65°C下進(jìn)行雜交而鑒定的DNA，其使用其上固定有來(lái)自集落或噬菌斑的DNA的濾膜，然后在65 °C下用0.1至2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液:150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)洗滌濾膜?？梢愿鶕?jù)下列文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行雜交:Molecular Cloning，ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(下文中稱為 Molecular Cloning,第二 版)；Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons (1987-1997)(下文中稱為 Current Protocols in Molecular Biology) ；DNACloningl:Core Techniques, A Practical Approach,第二版，Oxford University (1995)等。具體地說(shuō),能夠在嚴(yán)格條件下雜交的DNA包括與SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列的同源性為至少60%或更高，優(yōu)選70%或更高，更優(yōu)選80%或更高，進(jìn)一步優(yōu)選90%或更高，尤其優(yōu)選95%或更高，最優(yōu)選98%或更高的DNA。
[0091]在本發(fā)明中，由SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有基本類似于肝素結(jié)合活性的活性的蛋白是可以通過(guò)下列方法獲得的蛋白:例如，通過(guò)位點(diǎn)定點(diǎn)誘變將位點(diǎn)定點(diǎn)突變引入編碼由SEQ ID NO: 4、5或6所示氨基酸序列組成的蛋白的DNA中，其描述見(jiàn)Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79, 6409 (1982) ；Gene, M, 315 (1985) ；Nucleic AcidsResearch, 13, 4431 (1985) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488 (1985)等。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)目是一個(gè)或多個(gè)，不進(jìn)行具體限定，但在其在通過(guò)一直方法如上述位點(diǎn)定向誘變可能實(shí)現(xiàn)的缺失、取代或添加的范圍內(nèi)。適當(dāng)?shù)臄?shù)目為I至數(shù)打，優(yōu)選I至20,更優(yōu)選I至10,進(jìn)一步優(yōu)選I至5。
[0092]由與SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有基本類似于肝素結(jié)合活性的活性的蛋白包括與由SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列組成的蛋白的同源性為至少80%或更高、優(yōu)選為85%或更高、更優(yōu)選為90%或更高、進(jìn)一步優(yōu)選為95%或更高、特別優(yōu)選為97%或更高、最優(yōu)選為99%或更高的蛋白，其分別俥用分析軟件如 BLAST「T.Mol.Biol..215.403 (1990)]或 FASTA [Methods inEnzymology, 183, 63 (1990)]進(jìn)行計(jì)算。
[0093]在本發(fā)明中，本文所使用的其中在復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的還原末端N-乙酰氨基葡萄糖并未結(jié)合巖藻糖的糖鏈?zhǔn)侵冈撎擎溨?，在?fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的還原末端N-乙酰氨基葡萄糖基本沒(méi)有結(jié)合巖藻糖，優(yōu)選在糖鏈中，在復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的還原末端N-糖苷連接糖鏈上結(jié)合的巖藻糖的含量比為0%。本發(fā)明的抗凝血酶III組合物具體是指當(dāng)進(jìn)行下文4中所述的糖鏈分析時(shí)，基本上檢測(cè)不到其中巖藻糖的組合物，巖藻糖的含量基本上檢測(cè)不到是指巖藻糖的含量低于檢出限。
[0094]已知與糖蛋白如抗凝血酶III結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈具有多種結(jié)構(gòu)，但是具有如下列結(jié)構(gòu)式(I)所示的共有核心結(jié)構(gòu):
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種抗凝血酶III組合物的制造方法，其包括:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過(guò)將編碼抗凝血酶III的DNA導(dǎo)入經(jīng)基因重組修飾的宿主細(xì)胞中獲得的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中形成并積累含有具有復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III組合物，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)；和從培養(yǎng)物中回收所述的抗凝血酶III組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未與巖藻糖1-位結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的宿主細(xì)胞中的基因組被修飾成:與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶活性缺失，或者與所述復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶活性缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的宿主細(xì)胞中編碼與所述細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶或者與所述復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶的基因組中的所有等位基因已經(jīng)被敲除。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法,其中所述與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶選自⑶P-甘露糖4，6-脫水酶(GMD)和⑶Ρ-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶(Fx)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA ； (b)與由SEQ ID N0:7所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有⑶P-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脫水酶是選自(a)、(b)和(c)的蛋白: (a)含有SEQID NO:8所示氨基酸序列的蛋白； (b)由SEQID N0:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白； (c)由與SEQID N0:8所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有⑶P-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的DNA ； (b)與由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶是選自(a)、(b)和(C)的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白； (b)由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白； (c)由與SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有⑶P-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖-3，5-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中所述與復(fù)合體型N-糖苷連接糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通過(guò)α -鍵與巖藻糖1-位結(jié)合的糖鏈修飾相關(guān)的酶是α I, 6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的al，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)至Cd)的DNA編碼的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的DNA ； (b)含有SEQID NO: 12所示核苷酸序列的DNA ； (c)與由SEQID NO: 11所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有α 1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA ； (d)與由SEQID NO: 12所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有α 1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要 求10的方法，其中所述的α?，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列(a)至Cf)的蛋白: (a)含有SEQID NO: 13所示氨基酸序列的蛋白； (b)含有SEQID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白； (c)由SEQID NO: 13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白； (d)由SEQID NO: 14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白； Ce)由與SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白； (f)由與SEQID NO: 14所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有α 1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化體為FERMBP_08472、FERMBP-10083、FERM BP-10084、FERM BP-10088 或 FERM BP-10089。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的宿主細(xì)胞是選自下列(a)至(j)的細(xì)胞: Ca)來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織的CHO細(xì)胞； (b)大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20細(xì)胞； (c)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系NSO細(xì)胞； Cd)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0-Agl4細(xì)胞； Ce)來(lái)源于敘利亞倉(cāng)鼠腎組織的BHK細(xì)胞； Cf)人白血病細(xì)胞系Namalwa細(xì)胞； (g)胚胎干細(xì)胞； (h)受精卵細(xì)胞；(i)植物細(xì)胞； (j)酵母。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III組合物具有復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈，所述復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未結(jié)合巖藻糖的結(jié)構(gòu)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的復(fù)合體型N-糖苷連接的糖鏈具有在該糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未與巖藻糖1-位結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQIDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由與SEQIDN0:4所示氨基酸序列的同源性為80%或更高的氨基酸序列組成、并具有肝素結(jié)合活性的多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III是由選自下列(a)和(b)的DNA編碼的多肽: Ca)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA ； (b)與由SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、并編碼具有肝素結(jié)合活性的蛋白的DNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的抗凝血酶III來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
22.—種通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至21中任意一項(xiàng)的方法獲得的抗凝血酶III組合物。
23.—種含有根據(jù)權(quán)利要求22的抗凝血酶III組合物作為活性成分的藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的藥物，其為診斷、預(yù)防或治療伴有血液凝固的疾病的藥劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/15GK103993056SQ201410016193
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2003年10月9日
【發(fā)明者】山田剛士, 佐藤光男, 神田豐, 山野和也 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社