專利名稱：含有耐熱性dna聚合酶的酶制品及其制造方法、以及檢測(cè)對(duì)象生物的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有耐熱性DNA聚合酶的酶制品及其制造方法、以及檢測(cè)對(duì)象生物的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年，由于以特定的菌或細(xì)菌、病毒等的檢測(cè)為目的的聚合酶鎖式反應(yīng)(PCR)在2 小時(shí)左右的短時(shí)間內(nèi)便可獲知分析結(jié)果，所以在醫(yī)療領(lǐng)域或獸醫(yī)領(lǐng)域、食品領(lǐng)域等普及起來。但是，在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)不特定的菌或細(xì)菌、病毒等的技術(shù)尚未確立。從本來應(yīng)該為無菌環(huán)境的場(chǎng)所檢測(cè)鑒定極微量的非特定生物并進(jìn)行定量，例如以血液、腦脊髓液、羊水、尿等作為樣品進(jìn)行分析，在初期檢測(cè)鑒定人或家畜的感染，結(jié)合早期階段的有效的抗生素給與，進(jìn)而通過感染菌的定量值能夠監(jiān)測(cè)恢復(fù)情況等，能夠期待獲得非常大的益處。另外，能夠迅速地檢測(cè)鑒定在自來水、供水槽、空調(diào)循環(huán)水、加濕器、溫泉水、 池塘水等人在生活中可能吸入(飲水)的生活用水或食品、化妝品中不希望的不特定的細(xì)菌、真菌、病毒等生物的混入、并能夠以高靈敏度監(jiān)測(cè)混入水平等，在生活用水或食品、化妝品等的質(zhì)量管理領(lǐng)域中也能期待獲得很大的益處。預(yù)想如果能夠如上所述確立高靈敏度、 簡(jiǎn)便且迅速地對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象微生物進(jìn)行定量或鑒定的方法，則技術(shù)的波及領(lǐng)域?qū)⒎浅V，人們迫切需求。因嚴(yán)重的全身感染癥而在確定診斷中必需對(duì)血液中的起因微生物進(jìn)行檢測(cè) 鑒定的敗血癥患者的數(shù)量，近年來隨著癌治療或臟器移植等醫(yī)療的高度化而增加。從院內(nèi)感染的觀點(diǎn)考慮，以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為代表的多藥耐藥菌多為敗血癥的起因菌，為了選擇適當(dāng)?shù)目股赝炀然颊叩纳?，盡可能迅速地檢測(cè) 鑒定血液中的起因微生物，在臨床上是重要的。另外，作為早產(chǎn)最大原因的子宮內(nèi)感染癥是導(dǎo)致胎兒死亡的嚴(yán)重感染癥，盡可能迅速地檢測(cè)·鑒定羊水中的起因微生物、在發(fā)病早期給與最合適的抗生素對(duì)挽救胎兒的生命至關(guān)重要。同樣在獸醫(yī)領(lǐng)域，例如牛的乳房炎是對(duì)奶牛而言相當(dāng)嚴(yán)重的疾病，如果延誤治療則多數(shù)情況下束手無策只有將其淘汰，這在產(chǎn)業(yè)上也成為問題。但是，由于現(xiàn)行的感染微生物檢查法中通常使用包括培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)及使用選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)的培養(yǎng)法，所以在獲得結(jié)果前至少需要數(shù)日，在至判明結(jié)果為止的期間不得不基于經(jīng)驗(yàn)實(shí)施治療(empiric therapy)，不得已盲目地選擇抗生素，這是臨床上的現(xiàn)狀， 在要求迅速性的檢查中成為嚴(yán)重缺陷。另外，由于微生物中也有時(shí)具有耐抗生素基因，所以多同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但與鑒定檢查法同樣，在獲得結(jié)果前需要數(shù)日。其結(jié)果，產(chǎn)生因使用廣譜抗生素而導(dǎo)致產(chǎn)生多藥耐藥菌、或由于選擇不適當(dāng)?shù)目股囟荒芡炀葦⊙Y患者或子宮內(nèi)感染癥胎兒的生命的情況，或者產(chǎn)生不得不淘汰乳腺炎的奶牛的情況等。進(jìn)而，由于檢測(cè)異養(yǎng)菌時(shí)需要特殊的培養(yǎng)條件，所以產(chǎn)生假陰性的風(fēng)險(xiǎn)也很高。鑒于上述背景，針對(duì)使用PCR的未鑒定菌檢測(cè)進(jìn)行研究，通過PCR擴(kuò)增敗血癥起因微生物DNA的痕跡，使被擴(kuò)增的起因微生物DNA與憑經(jīng)驗(yàn)設(shè)定的在微生物中規(guī)定為目標(biāo)的菌種固有的核苷酸探針形成混合物，嘗試著對(duì)起因微生物進(jìn)行檢測(cè)·鑒定(日本特開平 6-90799號(hào)公報(bào))。進(jìn)而，對(duì)謀求檢測(cè)·鑒定的迅速性、以使用雜交探針的實(shí)時(shí)PCR為基本原理的敗血癥檢查技術(shù)開發(fā)進(jìn)行了探討(生物試樣分析，Vol. 28，No5. (2005),400-4040)。 另外，研究了下述方法通過以微生物DNA為模板使用特定引物組的PCR等進(jìn)行基因擴(kuò)增， 然后通過解析對(duì)微生物特異的熔解溫度(Tm值)的組合、或者各Tm值之間的差，迅速地檢測(cè)鑒定起因菌(W02007/097323)。但是，即使在使用PCR以短時(shí)間得到的結(jié)果中也必須確保精度，因此也可以說在PCR中同時(shí)實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高特異度是重要的。上述現(xiàn)有技術(shù)是雖然應(yīng)用利用了 PCR的基因擴(kuò)增技術(shù)，但是為一種限定于設(shè)想的目的微生物的方法，為設(shè)想外的微生物時(shí)則不能檢測(cè)到，或者即使為以未鑒定的微生物為對(duì)象的檢測(cè)鑒定方法，其定量技術(shù)尚未確立也是不可能實(shí)現(xiàn)的。由于實(shí)時(shí)PCR是能夠經(jīng)時(shí)地表示擴(kuò)增曲線的唯一方法，所以現(xiàn)在成為基因定量檢查中不可或缺的實(shí)驗(yàn)方法。特別是使用STORGreen等嵌入劑的檢測(cè)法廉價(jià)且簡(jiǎn)便，因此在世界上廣泛應(yīng)用。但是，使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR存在有時(shí)不僅目的物而且非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物也同樣被檢測(cè)、檢測(cè)靈敏度下降的問題。特別是成為問題的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物是引物二聚體(primer dimer)的形成。作為抑制引物二聚體形成的方法，公開了下述方法 對(duì)引物設(shè)計(jì)進(jìn)行研究、或利用熱啟動(dòng)(Hot Start)法、使用修飾引物的擴(kuò)增法(日本特開 2002-291490號(hào)公報(bào))；使用經(jīng)改良的PCR用試劑的熱啟動(dòng)PCR(日本特開2003-259882號(hào)公報(bào))、將結(jié)合在引物二聚體上的物質(zhì)添加到樣品中的方法(日本特開2006-2M784號(hào)公報(bào))等。但是，完全阻礙以引物二聚體為代表的上述非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成非常困難， 即使使用各種引物二聚體形成抑制方法，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加也會(huì)檢測(cè)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，這成為使用實(shí)時(shí)PCR的定量測(cè)定中靈敏度下降的主要原因。另外，在定性檢查中每次測(cè)定必須檢查Tm值(熔解溫度melting temperature)排除由引物二聚體引起的“假陽性” 等，這對(duì)實(shí)時(shí)PCR的測(cè)定體系而言成為嚴(yán)重問題。為了提供用于PCR的DNA聚合酶，對(duì)利用基因重組技術(shù)制造DNA聚合酶制品的方法進(jìn)行了研究(日本特開2006-180886號(hào)公報(bào))。PCR反應(yīng)中通常使用的市售耐熱性DNA 聚合酶制品中，高純度純化制品也被市售，但即使為使用了這些高純度純化制品的PCR反應(yīng)，在需要進(jìn)行通常的30個(gè)循環(huán)程度以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)的情況等中，也檢測(cè)到原因不明的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其使用存在限制。為了確保PCR法中的高特異度，開發(fā)了多種方法。最簡(jiǎn)便的方法為嵌套式PCR法， 但需要進(jìn)行2次PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，提出了以1次PCR進(jìn)行嵌套式PCR的“套匣擴(kuò)增方法”(日本特開平05-292968號(hào)公報(bào))。該方法為僅以1次熱循環(huán)構(gòu)成就能夠進(jìn)行嵌套式 PCR的優(yōu)異方法，也許是由于其申請(qǐng)時(shí)還沒有簡(jiǎn)單地實(shí)際測(cè)定引物或擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值的技術(shù)，所以未被實(shí)用化。該方法在具有實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的現(xiàn)在是可以實(shí)用化的。另外，通?？梢圆捎檬褂秒s交探針的方法和TaqMan PCR法等，但并非任何人都能簡(jiǎn)單地制備探針，并且費(fèi)用也昂貴等，因此現(xiàn)狀是尚不存在迅速性·簡(jiǎn)便性·經(jīng)濟(jì)性均得到滿足的方法。如上所述，通常認(rèn)為，如果能簡(jiǎn)便地?cái)U(kuò)增極微量的來自樣品微生物的DNA，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分析，特別是進(jìn)行定量或鑒定分析，則不僅甚至能夠?qū)Φ侥壳盀橹共荒芙馕龅臉O微量水平的基因進(jìn)行解析，而且在醫(yī)療領(lǐng)域或獸醫(yī)領(lǐng)域、生活用水或食品等各種樣品的分析領(lǐng)域中也與迅速且正確的判斷密切相關(guān)，但另一方面，在擴(kuò)增極微量的樣品微生物DNA 時(shí)的PCR中，尚不能將靈敏度和特異度均控制在較高水平，也不能在以未鑒定的微生物為對(duì)象的情況下迅速地定量、或定量鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在使用PCR法的極微量的樣品微生物DNA擴(kuò)增中最適合的耐熱性DNA聚合酶制品，并且提供一種分析方法，該分析方法使用該DNA聚合酶制品， 適合用于極微量的樣品微生物的新型檢查。本說明書中包括以下各發(fā)明。( I ) 一種耐熱性DNA聚合酶制品，是含有耐熱性DNA聚合酶的酶制品，其特征在于，(1)1單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述酶制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。( II ) 一種耐熱性DNA聚合酶制品的制造方法，其特征在于包括以下步驟(1)將編碼耐熱性DNA聚合酶的基因轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞中，得到耐熱性DNA聚合酶基因表達(dá)轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的步驟，(2)培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的步驟，(3)從經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中取得含有耐熱性DNA聚合酶的提取物，對(duì)該提取物進(jìn)行熱處理的步驟；或?qū)?jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞進(jìn)行熱處理后，從經(jīng)熱處理的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中取得含有耐熱性DNA聚合酶的提取物的步驟。(III )樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的檢測(cè)方法，其特征在于，在對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行檢測(cè)的方法中，包括以下步驟(1)擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(2)檢測(cè)步驟，檢測(cè)上述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物中的上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，上述耐熱性DNA聚合酶制品為下述(A)及(B)耐熱性DNA聚合酶制品中的任一種，(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。( IV )樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，其特征在于，在對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定的方法中，包括以下步驟
(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(B)及(M)、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(4)第二定量鑒定步驟，基于上述對(duì)靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定上述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟和上述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果對(duì)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定，其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，第一擴(kuò)增步驟中的耐熱性DNA聚合酶制品為下述㈧及⑶中的任一種，(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I) 1單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。( V )樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，其特征在于，在對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定的方法中，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(B)、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(4)第二定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定上述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟和上述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果對(duì)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定，(5)第三擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(M)、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(6)第三定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)，解析上述第三擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)，進(jìn)行上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，第一及第三擴(kuò)增步驟中的耐熱性DNA聚合酶制品為(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，及(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。(VI) 一種定量或鑒定用組合，所述組合用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定，其特征在于，具有用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的耐熱性DNA聚合酶制品和用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物，上述耐熱性DNA聚合酶制品為(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，及(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I) 1單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。(ΥΠ)—種定量及/或鑒定用組合，所述組合用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定，其特征在于，具有用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的、為下述㈧及⑶中的任一種的耐熱性DNA聚合酶制品，用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的、以細(xì)菌細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，禾口
用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物，其中，(A)及⑶耐熱性DNA聚合酶制品如下所述，(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。(VDI) 一種定量及/或鑒定系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)用于進(jìn)行上述的檢測(cè)方法或定量鑒定方法，在用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定的系統(tǒng)中，具有(1)擴(kuò)增裝置，用于使用下述物質(zhì)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述物質(zhì)為由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和耐熱性DNA聚合酶，(2)定量裝置，用于定量上述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物，(3)計(jì)算裝置，根據(jù)上述擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果，計(jì)算上述樣品中檢測(cè)對(duì)象生物的量，和(4)數(shù)據(jù)庫，用于根據(jù)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果計(jì)算上述樣品中檢測(cè)對(duì)象生物的量。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供耐熱性DNA聚合酶制品，所述耐熱性DNA聚合酶制品在利用基因擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)樣品微生物中，即使在樣品微生物量少、從其中提取的DNA也為微量的情況下，也可以對(duì)用于樣品微生物檢測(cè)的DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并且可以降低制造成本。如果使用上述耐熱性DNA聚合酶制品并且使用掩蔽引物二聚體(masked Primer Dimer)法，則引物二聚體的形成不會(huì)成為使用嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR法的阻礙因素，能夠不降低靈敏度地進(jìn)行定量檢查，定性檢查中也沒有因引物二聚體引起的假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。即，可以實(shí)現(xiàn)達(dá)至檢測(cè)靈敏度界限的準(zhǔn)確定量(高靈敏度定量法)。并且，與使用抗Taq抗體的熱啟動(dòng)法等現(xiàn)有方法相比，本方法簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)。進(jìn)而，通過應(yīng)用“套匣擴(kuò)增法”(日本特開平05-292968號(hào)公報(bào))或者對(duì)PCR的延伸時(shí)間進(jìn)行研究，可以僅以1次PCR(0ne Step)迅速地實(shí)施通常需要2次PCR的高特異性的嵌套式PCR。另外，與雜交探針法、TaqMan法等相比，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)。通過使用本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品并組合使用掩蔽引物二聚體法及一步嵌套式PCR(One Step nested PCR)法，能夠迅速 簡(jiǎn)便地進(jìn)行高靈敏度 高特異度的PCR。根據(jù)本發(fā)明，能夠迅速地提供利用基因檢查的檢測(cè)對(duì)象生物的高靈敏度且簡(jiǎn)易的定量或鑒定法。根據(jù)該方法，對(duì)于本來應(yīng)該為無菌環(huán)境或者混入極微量的檢測(cè)對(duì)象生物成為問題的任何樣品均能夠迅速·簡(jiǎn)便地以高靈敏度定量檢測(cè)對(duì)象生物。進(jìn)而，利用本定量或定量鑒定法，能夠監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)的菌數(shù)控制狀態(tài)或菌數(shù)變化狀態(tài)，如無菌狀態(tài)或一定菌數(shù)的維持、根據(jù)感染菌量的變化進(jìn)行治療效果的確認(rèn)等。另外，通過將樣品的培養(yǎng)和本發(fā)明的高靈敏度定量法組合，能夠進(jìn)行迅速的藥敏試驗(yàn)。


[圖1]是關(guān)于基于細(xì)菌16srRNA、真核細(xì)胞ISsrRNA基因序列進(jìn)行的系統(tǒng)樹解析的圖。[圖2]為表示熱處理后的SDS-PAGE照片的圖。[圖3]為表示以大腸桿菌DNA作為模板使用耐熱性DNA聚合酶制品的PCR的檢測(cè)限的圖。[圖4]為表示使用耐熱性DNA聚合酶制品的非特異性核酸混入的驗(yàn)證結(jié)果的圖。[圖5](A)為表示使用了 AmpliTaq Gold LD的實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線解析的圖。⑶ 為表示使用了以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品的實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線解析的圖。[圖6](A)為表示使用了 AmpliTaq Gold LD的實(shí)時(shí)PCR的熔解曲線解析的圖。⑶ 為表示使用了以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品的實(shí)時(shí)PCR的熔解曲線解析的圖。[圖7]為表示使用了以A.0ryZae作為宿主生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品的非特異性核酸混入的驗(yàn)證結(jié)果的圖。[圖8]為表示使用了掩蔽引物二聚體法的實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線解析的圖。㈧使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自突變P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶制品，(C)使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自突變T. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶制品，(D) 使用以P. Pastoris作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品，(E)使用以TobaccoBY-2作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品。[圖9]為表示實(shí)時(shí)PCR的熔解曲線解析的圖。㈧使用以S.cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自突變P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶制品，(C)使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自突變T. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶制品，(D)使用以P. pastoris作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品，(E)使用以TcAacco BY-2作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品。[圖10](A)為表示通常的PCR條件設(shè)定和其熒光檢測(cè)點(diǎn)的圖。⑶為表示掩蔽引物二聚體法的熒光檢測(cè)點(diǎn)的圖。[圖11] (A)表示一步半嵌套式PCR(One Step semi-nested PCR)法中的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物的配置。(B)表示一步嵌套式PCR法中的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物的配置。(C)表示由細(xì)菌得到的多個(gè)Tm值(Bacl Bac5)、和它們與平均值(average)的相對(duì)值(dl d5)。[圖12]為表示用于進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定的系統(tǒng)的例子之一的方塊圖。[圖13]為利用表1程序條件實(shí)施解析的擴(kuò)增曲線。圖中A為E.coli中的擴(kuò)增曲線，B為蒸餾水(D.W.)中的擴(kuò)增曲線。[圖14]為利用表1程序條件實(shí)施解析的熔解曲線圖。圖中A為E.coli的熔解曲線，B為引物二聚體的熔解曲線。[圖15]㈧為利用表2程序條件的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的擴(kuò)增曲線圖。圖中A為E.coli中的擴(kuò)增曲線，B為蒸餾水(D.W.)中的擴(kuò)增曲線。(B)為表示以各試樣的DNA提取液作為模板進(jìn)行真菌的感染菌檢查所得的結(jié)果的圖。圖中A為作為陽性對(duì)照的C. albicans中的擴(kuò)增曲線，B為蒸餾水(D.W.)、自來水(Tap water)、泉水(Spring water)、溫泉水(Hot spring water)、空調(diào)循環(huán)水(Air-conditioning water)中的擴(kuò)增曲線。(C)為表示以各試樣的DNA提取液作為模板進(jìn)行細(xì)菌的感染菌檢查所得的結(jié)果的圖。圖中，A D分別為，A 作為陽性對(duì)照的E. coli (循環(huán)數(shù)14. 47)中的擴(kuò)增曲線，B 溫泉水(Hot spring water 循環(huán)數(shù)30. 54)中的擴(kuò)增曲線，C 空調(diào)循環(huán)水(Air-conditioning water 循環(huán)數(shù)觀.96)中的擴(kuò)增曲線，及D 蒸餾水(D.W.)、自來水(Tap water)、泉水(Spring water)中的擴(kuò)增曲線。[圖16]為表示以奶油泡芙作為樣品時(shí)進(jìn)行真菌的感染菌檢查所得的結(jié)果的圖。 (A)為新鮮的奶油泡芙中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的C.albicans(循環(huán)數(shù) 23. 78)中的增殖曲線，B為蒸餾水(D. W.)及奶油泡芙(奶油)(循環(huán)數(shù)45. 71)中的增殖曲線。(B)為不新鮮的奶油泡芙中的增殖曲線，圖中，A為作為陽性對(duì)照的C.albicans(循環(huán)數(shù)23. 78)中的增殖曲線，B為蒸餾水(D. W.)及奶油泡芙(奶油)(循環(huán)數(shù)44. 37)中的增殖曲線。[圖17]為表示以奶油泡芙作為樣品時(shí)進(jìn)行細(xì)菌的感染菌檢查所得的結(jié)果的圖。 (A)為新鮮的奶油泡芙中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的E. coli (循環(huán)數(shù)沈.55) 中的增殖曲線，B為蒸餾水(D. W.)及奶油泡芙(奶油)中的增殖曲線。(B)為不新鮮的奶油泡芙中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的E. coli (循環(huán)數(shù)23. 78)中的增殖曲線，B 為奶油泡芙(奶油)(循環(huán)數(shù)48)中的增殖曲線，C為蒸餾水(D.W.)中的增殖曲線。[圖18]為表示使用由C.albicans引起的敗血癥患者A的血液樣品的檢查結(jié)果的圖。(A)為真菌通用引物中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的C. albicans(循環(huán)數(shù)27. 51)中的增殖曲線，B為血液樣品(患者A 循環(huán)數(shù)33. 70)中的增殖曲線，C為蒸餾水(D. W.)中的增殖曲線。(B)為細(xì)菌通用引物中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的 E. coli (循環(huán)數(shù)33. 70)中的增殖曲線，B為血液試樣(患者A)及蒸餾水(D. W.)中的增殖曲線。[圖19]為表示使用由Bacillusspecies引起的敗血癥患者B的血液樣品的檢查結(jié)果的圖。(A)為真菌通用引物中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的C. albicans 中的增殖曲線，B為血液樣品(患者B)及蒸餾水(D.W.)中的增殖曲線。⑶為針對(duì)血液樣品的細(xì)菌通用引物中的增殖曲線。圖中，A為作為陽性對(duì)照的E. coli (循環(huán)數(shù)22. 53)中的增殖曲線，B為血液樣品(患者B:循環(huán)數(shù)34. 07)中的增殖曲線，C為蒸餾水(D.W.)中的增殖曲線。(C)為針對(duì)血液培養(yǎng)試樣的細(xì)菌通用引物中的增殖曲線。圖中，A為血液培養(yǎng)試樣 (患者B:循環(huán)數(shù)14.47)中的增殖曲線，B為作為陽性對(duì)照的E. coli (循環(huán)數(shù)25. 64)中的增殖曲線，C為蒸餾水(D.W.)中的增殖曲線。[圖20]為表示以MRSA的DNA作為模板、使用MRSA特異性引物的實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果的圖。A為Spa引物中的增殖曲線，B為mecA弓丨物中的增殖曲線，C為細(xì)菌通用引物中的增殖曲線，D為真菌通用引物中的增殖曲線。[圖21](A)為對(duì)于被檢測(cè)的表皮葡萄球菌，根據(jù)經(jīng)時(shí)的增菌量檢查慶大霉素(GM) 和紅霉素(EM)的藥物敏感性的圖。(B)為對(duì)于被檢測(cè)的蠟狀芽孢桿菌，根據(jù)經(jīng)時(shí)的增菌率檢查頭孢唑林(CZ)、氨芐西林(AP)、紅霉素(EM)各自的藥物敏感性的圖。
[圖22](A)為表示子宮內(nèi)感染癥的羊水樣品1的感染菌檢查結(jié)果的圖，(B)為表示先兆早產(chǎn)的羊水樣品2的感染菌檢查結(jié)果的圖。需要說明的是，A C為使用細(xì)菌通用引物嘗試進(jìn)行檢測(cè)所得的結(jié)果。A 為蒸餾水，B 為作為陽性對(duì)照的E. coli, C 羊水樣品。 D F為使用真菌通用引物嘗試進(jìn)行檢測(cè)所得的結(jié)果，D 為蒸餾水，E 為作為陽性對(duì)照的 C. albicans,F 為羊水樣品。G H為使用支原體屬特異性引物嘗試進(jìn)行檢測(cè)所得的結(jié)果， G 為蒸餾水，H:為支原體屬陽性對(duì)照，I 為羊水樣品。J L為使用對(duì)尿素原體屬為特異性的引物嘗試進(jìn)行檢測(cè)所得的結(jié)果，J 為蒸餾水，K 為尿素原體陽性對(duì)照，L 為羊水樣品。[圖23]將包括半嵌套式引物的3個(gè)引物混合，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值確認(rèn)是否能順利地進(jìn)行嵌套式PCR。(A)表示只實(shí)施表3及表4的擴(kuò)增1，只有外側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物I (Tm 值87°C)被擴(kuò)增。(B)表示只實(shí)施表3及表4的擴(kuò)增2，只有內(nèi)側(cè)的嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物II (Tm 值83°C )(其他為引物二聚體)被擴(kuò)增。[圖24]使用實(shí)際的樣品確認(rèn)了通過合并使用e-DNAP及不顯示法的高靈敏度檢測(cè)方法和一步嵌套式PCR法順利地進(jìn)行了高靈敏度且高特異度的PCR。(A)為在E. Coli特異性的引物中實(shí)施了表3或表4的程序時(shí)的增殖曲線。圖中，A為E. Coli中的增殖曲線， B為蒸餾水(D. W.)、S. aureus、Human DNA中的增殖曲線。(B)為在E. Coli特異性的引物中實(shí)施表3或表4的程序時(shí)的熔解曲線。A為E. Coli中的熔解曲線，B為蒸餾水(D.W.)、 S. aureus,Human DNA中的熔解曲線。圖中的擴(kuò)增產(chǎn)物只為嵌套式內(nèi)側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物II (Tm值 83°C )，此外，蒸餾水(D. W.)、S. aureus、Human DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物未確認(rèn)到。[圖2 將包括半嵌套式引物的3個(gè)引物混合，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的大小確認(rèn)是否順利地進(jìn)行嵌套式PCR。只實(shí)施擴(kuò)增1，只有外側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物I (MSbp)被擴(kuò)增，只實(shí)施擴(kuò)增2， 只有內(nèi)側(cè)的嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物II (IlObp)被擴(kuò)增。實(shí)施擴(kuò)增1+2，只有內(nèi)側(cè)的嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物 II (IlObp)被擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式(1)耐熱性DNA聚合酶制品本發(fā)明人等與市售的耐熱性DNA聚合酶制品同樣地利用將細(xì)菌用作宿主的基因重組生產(chǎn)耐熱性DNA聚合酶，并針對(duì)所生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品在用于對(duì)樣品中含有的檢測(cè)對(duì)象微生物進(jìn)行檢測(cè)的PCR中的適用性進(jìn)行探討。然而，不能提供下述耐熱性DNA 聚合酶制品，即，在利用PCR的檢測(cè)對(duì)象微生物的檢測(cè)中，即使樣品中所含的微生物量少、 從其中獲取的DNA也為微量的情況下，也能夠使PCR的循環(huán)數(shù)增加且能夠?qū)τ糜跈z測(cè)對(duì)象微生物的檢測(cè)的DNA進(jìn)行選擇性地?cái)U(kuò)增，并且能夠降低制造成本。因此，考慮到宿主的適合性和所生產(chǎn)的耐熱性聚合酶的純化效率等，以系統(tǒng)樹 (參見 Carl R. ffoese, "Bacterial Evolution, "Micro. Biol. Reviews, 51 :221-271 (1987) 及圖1)為參考，驗(yàn)證各生物的遠(yuǎn)緣關(guān)系，著眼于能夠用作宿主的真核細(xì)胞。將真核細(xì)胞用作宿主對(duì)耐熱性DNA聚合酶的生產(chǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得的培養(yǎng)提取沉淀物中耐熱性 DNA聚合酶的大部分以不溶性的形式生產(chǎn)，通過對(duì)沉淀物及上清液進(jìn)行加熱處理可以不可逆地增溶，另外通過該步驟能夠容易地回收具有活性并且被純化為高純度的耐熱性DNA聚合酶。在進(jìn)行各種研究中發(fā)現(xiàn)，該耐熱性DNA聚合酶制品至少具有下述特征對(duì)于在細(xì)菌 IBSrRNA基因擴(kuò)增中不添加模板的情況，不發(fā)生DNA擴(kuò)增。
以下詳細(xì)地說明本發(fā)明。本發(fā)明中使用的耐熱性DNA聚合酶制品為含有耐熱性DNA聚合酶的制品，具有以下㈧及⑶條件中的至少一者的特征。(A)滿足以下(1)及O)的條件的耐熱性DNA聚合酶制品。(1)耐熱性DNA聚合酶1單位中，除編碼該耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下。(2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)上述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。(B)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品。所謂來自細(xì)菌的核酸的混入量為“10fg以下”，是指在下述實(shí)施例2-1的“(6-3) PCR的檢測(cè)限”的檢測(cè)方法中被判定為“10fg以下”的情況。另一方面，本發(fā)明中的所謂“提取物”，只要為從細(xì)胞或菌體中取得含有耐熱性DNA 聚合酶的成分的物質(zhì)即可，對(duì)于為了得到提取物而使用的溶劑和提取方法等沒有特殊限定。作為得到提取物的方法，例如可以舉出以下方法。(1)利用酵母裂解酶、纖維素酶、殼多糖酶、殼二糖酶、殼聚糖酶、β -1,3-葡聚糖酶、溶菌酶等溶解細(xì)胞壁的酶對(duì)生產(chǎn)耐熱性DNA聚合酶的真核細(xì)胞進(jìn)行處理的方法。(2)使用超聲波、弗氏壓碎器、玻璃珠等物理方法、通過加熱破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的方法等，用水或緩沖液等溶劑提取細(xì)胞或菌體中含有的成分獲得提取物的方法。(3)采用通過在耐熱性DNA聚合酶基因上游添加分泌信號(hào)肽等使該耐熱性DNA聚合酶在細(xì)胞外分泌生產(chǎn)的方法等，并將由此生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶提取至菌體外，獲得提取物的方法。本發(fā)明中所謂的“耐熱性DNA聚合酶制品”，是指含有耐熱性DNA聚合酶的制品，作為上述提取物本身，進(jìn)而可以為使用上述提取物經(jīng)過純化、稀釋、與其他物質(zhì)或化合物混合等各種處理而得到的物質(zhì)。例如，作為制品也可以舉出以下物質(zhì)。(A)為下述狀態(tài)的物質(zhì)，即，來自上述提取物的耐熱性DNA聚合酶溶解在緩沖液中，所述緩沖液中作為具有緩沖作用的成分含有下述物質(zhì)磷酸、硼酸、碳酸、檸檬酸、乙酸、 TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、veronal、HEPES, PIPES、CAPS、TAPS、TES, MOPS、MES 等。(B)為下述狀態(tài)的物質(zhì)，即，與MgCl2或dN PS等共同存在于溶液中。(C)為下述干燥狀態(tài)的物質(zhì)，即，通過冷凍干燥等方法使上述(A)及(B)的溶液干
O作為由“提取物”得到“耐熱性DNA聚合酶制品”的方法，可以舉出純化、稀釋、與其他物質(zhì)或化合物的混合等。作為純化方法，可以舉出以下方法。( I )對(duì)含有耐熱性DNA聚合酶的培養(yǎng)基等的提取物實(shí)施離子交換色譜法或羥基磷灰石色譜法等利用了電荷的方法。( II )親和色譜法等利用了特異親和性的方法、反相色譜法等利用了疏水性差異的方法。(III )采用凝膠過濾等利用分子量的差的方法等的柱色譜法。
( IV )使用硫酸銨沉淀、丙酮沉淀、PEG沉淀、pH沉淀等進(jìn)行分離的方法。( V )使用聚乙烯亞胺等的核酸除去法?？梢越M合上述方法中的2種以上進(jìn)行使用。通過上述方法可以濃縮提取物中含有的耐熱性DNA聚合酶或者降低或除去來自宿主的夾雜蛋白質(zhì)或核酸等。作為稀釋方法，可以舉出將水或上述緩沖液等與提取物混合的溶劑添加到提取物中的方法。另外，在與其他的物質(zhì)或化合物混合的方法中，作為混合的物質(zhì)或化合物，沒有特殊限定，例如可以舉出選自下述物質(zhì)中的1種或2種以上，所述物質(zhì)為氯化鉀、乙酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、氯化錳、乙酸錳、硫酸錳、氯化鈉、乙酸鈉、氯化鋰、乙酸鋰、氯化鈣、β -巰基乙醇、二硫蘇糖醇、DMS0、甘油、甲酰胺、四甲基氯化銨、 PEG、Tween2O、Tween8O、Triton-XlOO, NP40, DNA, RNA、蛋白質(zhì)(酶類、抗體、BSA 等)、dATP、 dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、dNTPs, SYBR Green、EVERGREEN、SYT09、蠟等。所謂“嗜熱菌”，是指在最適生長(zhǎng)溫度為45°C以上、或55°C以上的條件下生長(zhǎng)的真細(xì)菌或古細(xì)菌(原始菌)。可適用于本發(fā)明中的嗜熱菌只要符合上述定義即可，沒有特殊限制。所謂“超嗜熱菌”，是指在最適生長(zhǎng)溫度為80°C以上、或者90°C以上的條件下生長(zhǎng)的真細(xì)菌或古細(xì)菌(原始菌)。可適用于本發(fā)明的超嗜熱菌只要符合上述定義即可， 沒有特殊限制。目前已經(jīng)分離·鑒定了 100種以上的嗜熱菌、超嗜熱菌，它們均可以適用于本發(fā)明。作為所述嗜熱菌、超嗜熱菌，可以舉出屬于棲熱菌屬(Thermus)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、熱球菌屬(Thermococcus)、熱球菌屬(Pyrococcus)、氣火菌屬(Aeropyrum)、 產(chǎn)液菌屬(Aquifex)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、火葉菌屬(Pyrolobus)、甲烷嗜熱菌屬 (Methmopyrus)的嗜熱菌或超嗜熱菌。更具體而言，例如可以舉出水生棲熱菌(Thermus aquatics)、嗜熱棲熱菌 (Thermus thermophilus)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜火產(chǎn)液菌(Aquifex pyrophilus)、Geothermobacterium ferrireducens、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neopolitana)、Thermotoga petrophila、 Thermotoga naphthophila、下層酸菌(Acidianus infernus)、Aeropyrum pernix、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、深處古生球菌(Archaeoglobus profundus)、 Caldivirga maquilingensis、Desulfurococcus amylolyticus、運(yùn)動(dòng)硫還原球菌 (Desulfurococcus mobilis)、粘硫還原球菌(Desulfurococcus mucosus)、Ferroglobus placidus、Geoglobus ahangari、丁酉享?xiàng)邷鼐?Hyperthermus butylicus)、Ignicoccus islandicus、 Ignicoccus pacificus、詹氏甲焼球菌(Methanococcus jannaschii)、 Methanococcus fervens、火源甲焼球菌(Methanococcus igneus)、Methanococcus infernus、坎氏甲烷嗜熱菌(甲烷嗜熱菌)、熾熱甲烷嗜熱菌(Methmothermus fervidus)、
(Methanothermus sociabilis) ^Palaeococcus ferrophiIusΛ 1 棒菌、Pyrobaculum calidifontis、冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)、Pyrobaculum oguniense、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcus abyssi、掘越式熱球菌、沃氏熱球菌(Pyrococcus woesei)、極端鐵代謝嗜熱菌、布氏熱網(wǎng)菌(Pyrodictium brockii)、 隱蔽熱網(wǎng)菌(Pyrodictium occultum)、延胡索酸火葉菌、海葡萄嗜熱菌Gtaphylothermusmarinus)、喜氫斯式菌、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)、希氏硫化葉菌 (Sulfolobus shibatae)、硫化葉菌、Sulfophobococcus zilligii、 Sulfurisphaera ohwakuensis、Thermococcus kodakaraensis、速生熱球菌(Thermococcus celer)、極端嗜熱細(xì)菌、Thermodiscus maritimus、下垂熱絲菌(Thermofilum pendens)、附著熱變形菌(Thermoproteus tenax)、嗜中性熱變形菌(Thermoproteus neutrophilus)、 Thermosphaera aggregans、Vulcanisaeta distributa、Vulcanisaeta 8〇1111土8118等。本發(fā)明涉及的耐熱性DNA聚合酶制品的制造方法是使用宿主細(xì)胞生產(chǎn)耐熱性DNA 聚合酶的方法，使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。作為真核細(xì)胞可以舉出菌類、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等，作為宿主細(xì)胞只要為來自真核生物的細(xì)胞即可，沒有特殊限定。作為菌類，可以舉出酵母或霉等子囊菌、絲狀菌、擔(dān)子菌、接合菌等，其中，優(yōu)選酵母或絲狀菌，作為具體例，可以舉出酵母屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母菌屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬、接合酵母 (Zygosaccharomyces)屬、耶羅維亞酵母屬、絲孢酵母(Trichosporon)屬、紅冬孢酵母 (Rhodosporidi)屬、曲霉(Aspergillus)屬、鍵抱霉(Fusarium)屬、木霉(Trichoderma)屬寸。作為更詳細(xì)的具體例，可以舉出釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、博伊丁絲酵母(Candida boidini)、畢赤嗜甲醇酵母、安格斯畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris)、異常畢赤酵母、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、魯式酵母、解脂耶式酵母、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)及里氏木霉等。作為動(dòng)物細(xì)胞，可以舉出來自人的培養(yǎng)細(xì)胞、來自小鼠的培養(yǎng)細(xì)胞等，作為具體例，可以舉出CHO細(xì)胞、Hela細(xì)胞等。作為植物細(xì)胞，只要為由植物衍生的細(xì)胞即可，優(yōu)選為株化的培養(yǎng)細(xì)胞，可以舉出煙草(Nicotiana)屬細(xì)胞、擬南芥(Arabidopsis)屬細(xì)胞、番薯 (Ipomoea)屬細(xì)胞、胡蘿卜(Daucus)屬細(xì)胞、水稻(Oryza)屬細(xì)胞等，具體而言可以舉出煙草BY-2培養(yǎng)細(xì)胞、阿拉伯芥培養(yǎng)細(xì)胞、番薯培養(yǎng)細(xì)胞、胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞、水稻培養(yǎng)細(xì)胞等。 作為昆蟲細(xì)胞，只要為由昆蟲衍生的細(xì)胞即可，優(yōu)選為株化的培養(yǎng)細(xì)胞，可以舉出來自斜紋夜蛾近似種草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞sf9株、sf21株、 蠶(Bombix mori)培養(yǎng)細(xì)胞Bm-N株等。作為宿主細(xì)胞，優(yōu)選為酵母等增殖快的微生物或真核生物，例如可以舉出以釀酒酵母等酵母屬為代表的酵母、以煙草等煙草(Nicotiana)屬植物的培養(yǎng)細(xì)胞為代表的植物細(xì)胞、以米曲霉等曲霉(Aspergillus)屬為代表的絲狀菌。使用真核細(xì)胞生產(chǎn)耐熱性DNA聚合酶時(shí)，例如可以舉出在真核細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因使其表達(dá)來生產(chǎn)該耐熱性DNA聚合酶的方法等，所述基團(tuán)含有至少一個(gè)以上的編碼耐熱性 DNA聚合酶的基因。另外本說明書中的編碼耐熱性DNA聚合酶的基因可以為編碼耐熱性DNA聚合酶的 cDNA、基因組DNA、合成DNA等任意基因，另外可以為單鏈、或具有其互補(bǔ)鏈的雙鏈，也可以包含天然、或人工的核苷酸衍生物。進(jìn)而，耐熱性DNA聚合酶來自生物時(shí)，對(duì)于該耐熱性DNA 聚合酶的由來沒有特殊限定。DNA聚合酶根據(jù)生物的種類存在各種同屬體。作為本發(fā)明中使用的耐熱性DNA聚合酶的具體例，可以舉出來自水生棲熱菌 (Thermus aquatics)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿(Bacillus stearother mophilus)、 Thermococcus gorgonarius、 Thermococcus kodakaraensis K0D1、沃氏熱球菌(Pyrococcus woesei)、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus) > Aeropyrum pernix, Aquifex aeolicus、硫化葉菌、延胡索酸火葉菌、或甲烷嗜熱菌的耐熱性DNA聚合酶。耐熱性DNA聚合酶包括基因工程學(xué)上人工合成的耐熱性DNA聚合酶。另外，耐熱性DNA聚合酶優(yōu)選來自具有耐熱性的生物，較優(yōu)選來自產(chǎn)甲烷菌、嗜熱嗜酸菌、嗜熱菌、超嗜熱菌等原核生物。本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶基因優(yōu)選具有下述堿基序列，所述堿基序列采用在轉(zhuǎn)化的宿主生物中多使用的密碼子用法。例如，在釀酒酵母中導(dǎo)入耐熱性DNA聚合酶基因時(shí)的密碼子用法，如下所述?；诮湍笇俚犬惙N生物的密碼子用法改變?cè)械哪蜔嵝訢NA聚合酶基因時(shí)，優(yōu)選該密碼子用法對(duì)來自天然的耐熱性DNA聚合酶基因的堿基序列的70 %以上適用，較優(yōu)選為 80%以上，更優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選該密碼子用法對(duì)全部的密碼子均適用。作為本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶基因的優(yōu)選形態(tài)，可以舉出采用釀酒酵母的密碼子用法設(shè)計(jì)來自水生棲熱菌的耐熱性DNA聚合酶基因的堿基序列而得到的耐熱性DNA聚合酶基因。其中，優(yōu)選方案為具有序列號(hào)11的序列、或由這些堿基序列形成的耐熱性DNA聚合酶基因。另外，耐熱性DNA聚合酶基因中，優(yōu)選不含使mRNA不穩(wěn)定化的序列，作為使mRNA 不穩(wěn)定化的序列，可以舉出明顯重復(fù)的序列和耐熱性DNA聚合酶基因的GC含量高的基因序列等。作為除去使mRNA不穩(wěn)定化的序列的目標(biāo)，具體而言可以舉出將IObp左右的基因序列的出現(xiàn)頻率抑制至編碼耐熱性DNA聚合酶的基因的2%以下，或?qū)⒛蜔嵝訢NA聚合酶基因整體的GC含量設(shè)在約20%以上、約45%以下等。作為本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶基因，優(yōu)選具有至少一種下述特征，所述特征為適用要導(dǎo)入的宿主生物中的密碼子用法、不含引起mRNA不穩(wěn)定化的序列、合適的GC含量。 較優(yōu)選具有2種以上的特征，最優(yōu)選具有3種特征。另外，該耐熱性DNA聚合酶基因中，優(yōu)選適用宿主生物中的密碼子用法。特別是在以酵母屬、特別是以釀酒酵母為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，優(yōu)選適用釀酒酵母中的密碼子用法。進(jìn)而，耐熱性DNA聚合酶基因中，特別優(yōu)選如下設(shè)計(jì)，S卩，使編碼區(qū)中不具有基因克隆步驟上不合適的限制酶位點(diǎn)。具體而言，優(yōu)選不含有ECoR I ,HindIILNot I ,SnaB I 等位點(diǎn)。另一方面，如果考慮基因克隆操作，優(yōu)選在編碼區(qū)的外側(cè)具有操作上有用的限制酶位點(diǎn)。例如，可以在編碼區(qū)的上游、或下游具有ECoR I , Hind IIL Not I , SnaB I等限制酶位點(diǎn)。作為耐熱性DNA聚合酶基因同系物，例如可以舉出與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA聚合酶基因同系物。即，與上述任一種DNA聚合酶基因的整體或一部分或其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交的DNA聚合酶基因同系物。所述同系物同時(shí)編碼具有DNA聚合酶活性的蛋白質(zhì)。所謂在嚴(yán)格條件下雜交的耐熱性DNA聚合酶基因同系物，例如包括下述DNA，即， 以選擇一個(gè)或多個(gè)下述序列所得到的DNA作為探針DNA，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的雜交技術(shù)(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al. , (1987)Publish、 John ffily&Sons Sectoin 6. 3-6. 4)等進(jìn)行雜交的DNA，所述序列為原有堿基序列的任意的至少20個(gè)、優(yōu)選25個(gè)、較優(yōu)選至少30個(gè)的連續(xù)序列。此處作為嚴(yán)格條件，為在50%甲酰胺存在下雜交溫度為37°C，作為較嚴(yán)格條件， 為雜交溫度約42°C。作為更嚴(yán)格條件，為在50%甲酰胺存在下雜交溫度約65°C。需要說明的是，氨基酸序列中的突變數(shù)，沒有限制，只要能夠維持原有的蛋白質(zhì)功能即可，但優(yōu)選為全部氨基酸的70 %以內(nèi)，較優(yōu)選為30 %以內(nèi)，更優(yōu)選為20 %以內(nèi)。另外，上述耐熱性DNA聚合酶基因同系物優(yōu)選為下述DNA，即，含有相對(duì)于原有的 DNA堿基序列的編碼區(qū)具有至少80%、優(yōu)選為90%以上同源性的堿基序列的DNA、或者由該堿基序列構(gòu)成的DNA。需要說明的是，DNA的堿基序列的同源性可以根據(jù)基因解析程序 BLAST等確定。需要說明的是，耐熱性DNA聚合酶基因也可以化學(xué)合成，也可以采用作為長(zhǎng)鏈DNA 合成方法已知的藤本等的方法(藤本英也、合成基因的制備法、植物細(xì)胞工程學(xué)系列7植物的PCR實(shí)驗(yàn)方案、1997、秀潤(rùn)社、p95-100)。另外，氨基酸序列中的改變，可以使用位點(diǎn)特異性誘變法(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al. , (1987)Publish. John Wily&Sons Sectoin 8. 1-8. 5)等，在想要改變的氨基酸序列中適當(dāng)導(dǎo)入取代、缺失、插入及/或添加突變而進(jìn)行。另外，所述改變不限于人工導(dǎo)入突變或合成突變，也包括基于人工突變處理、或不限于此通過自然界中的氨基酸的突變所引起的改變。作為本發(fā)明中能夠優(yōu)選利用的耐熱性DNA聚合酶基因，可以舉出由序列號(hào)1、81及 82表示的堿基序列構(gòu)成的基因(以下給出對(duì)應(yīng)的氨基酸序列)。序列號(hào)1
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2522
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2328
序列號(hào)82
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gacatcgagacgctctatcacgagggcgaggagttcgccgaagggcctatcctgatgata480agctacgccgacgaggaaggggcgcgcgttattacctggaagaatatcgaccttccctat540gtcgacgtcgtttccaccgagaaggagatgataaagcgcttcctcaaggtcgtcaaggaa600aaggatcccgacgtcctcataacctacaacggcgacaacttcgacttcgcctacctcaag660aagcgctccgagaagctcggagtcaagttcatcctcggaagggaagggagcgagccgaaa720atccagcgcatgggcgatcgCtttgCggtggaggtcaagggaaggattcacttcgacctc780taccccgtcattaggagaacgattaacctccccacttacacccttgaggcagtatatgaa840gccatctttggacagccgaaggagaaggtctacgctgaggagatagcgcaggcctgggaa900acgggcgagggattagaaagggtggcccgctactcgatggaggacgcaaaggtaacctat960gaactcggaaaagagttcttccctatggaagcccagctctcgcgcctcgtaggccagagc1020ctctgggatgtatctcgctcgagtaccggaaacctcgtcgagtggtttttgctgaggaag1080gcctacgagaggaatgaacttgcaccaaacaagccggacgagagggagctggcaagaaga1140agggagagctacgcgggtggatacgtcaaggagcccgaaaggggactgtgggagaacatc1200gtgtatctggacttccgctccctgtatccttcgataataa
tcacccataacgtctcccct1260
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ttctgcaaggacttccccggcttcatcccaagcctcctcg
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tacatcgtgctcaaaggctcgggaaggattggggacaggg
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gtggagaggattctgagggcctttggttaccgtaaagaag
atttaaggtatcagaaaacg2280
cggcaggttggcttgggggcgtggctaaaacctaagacat
ga
2322
與由序列號(hào)1的堿基序列構(gòu)成的基因相對(duì)應(yīng)的氨
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHAL KGLTTSRGEP
VQAVYGFAKSLLKALKEDGD60
AVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPE DFPRQLALIK
ELVDLLGLARLEVPGYEADD120
VLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLS DRIHVLHPEG
YLITPAffLffEKYGLRPDQffA180
DYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEE WGSLEALLKN
LDRLKPAIREKILAHMDDLK240
LSffDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLR AFLERLEFGS
LLHEFGLLESPKALEEAPffP300
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGG RVHRAPEPYK
ALRDLKEARGLLAKDLSVLA360
LREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGV ARRYGGEffTE
EAGERAALSERLFANLffGRL420
EGEERLLffLYREVERPLSAVLAHMEATGVR LDVAYLRALS
LEVAEEIARLEAEVFRLAGH480
PFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTG KRSTSAAVLE
ALREAHPIVEKILQYRELTK540
LKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATA TGRLSSSDPN
LQNIPVRTPLGQRIRRAFIA600
EEGffLLVALDYSQIELRVLAHLS⑶ENLIR VFQEGRDIHT
ETASWMFGVPREAVDPLMRR660
AAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQ AFIERYFQSF
PKVRAffIEKTLEEGRRRGYV720
ETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFN MPVQGTAADL
MKLAMVKLFPRLEEMGARML780
LQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGV YPLAVPLEVE
VGIGEDffLSA
KE832
與由序列號(hào)81的堿基序列構(gòu)成的基因相對(duì)應(yīng)的氨
MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEH DRTFRPYIYA
LLRDDSKIEEVKKITGERHG60
KIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVffKLYLEHP QDVPTIREKV
REHPAVVDIFEYDIPFAKRY120
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SYADENEAKVITffKNIDLPY180
VEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYN GDSFDFPYLA
KRAEKLGIKLTIGRDGSEPK240
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TRQVGLTSffLNIKKS
與由序列號(hào)82的堿基f
MILDTDYITEDGKPVIRIFK
LLKDDSAIEDVKKITAERHG
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KEHPAVVDIYEYDIPFAKRY
LIDKGLIPMEGDEELKMLAF
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TDGFFATIPGADAETVKKKA
GFYKRGFFVTKKKYAVIDEE
DKITTRGLEIVRRDffSEIAK
說明書
22/63頁
300
ELGKEFLPME IQLSRLVGQP 360
LRESYTGGFV KEPEKGLffEN 420
KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE 480
AKARffYCKEC AESVTAffGRK 540
ALEFVKYINS KLPGLLELEY 600
KETQARVLET ILKHGDVEEA 660
VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI 720
AVLRILEGFG YRKEDLRYQK 775
P列構(gòu)成的基因相對(duì)應(yīng)的參
KENGEFKIDY DRNFEPYIYA 60
EVffKLYFTHP QDVPAIRDKI 120
DIETLYHEGE EFAEGPILMI 180
KDPDVLITYN GDNFDFAYLK 240
YPVIRRTINL PTYTLEAVYE 300
ELGKEFFPME AQLSRLVGQS 360
RESYAGGYVK EPERGLffENI 420
FCKDFPGFIP SLL⑶LLEER 480
KARffYCKECA ESVTAffGRQY 540
KEFLDYINAK LPGLLELEYE 600
ETQARVLEAI LKHGDVEEAV
RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL660VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVISYIVLKGSGRI GDRAIPFDEF720DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKTRQVGLGAffLKPKT773對(duì)用于向宿主中導(dǎo)入上述耐熱性DNA聚合酶基因的DNA構(gòu)筑物進(jìn)行說明。使用本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶基因?qū)λ拗骷?xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使由該DNA編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，由此根據(jù)其DNA聚合酶活性在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生DNA聚合酶。轉(zhuǎn)化時(shí)，使用可以使由上述耐熱性DNA聚合酶基因構(gòu)成的DNA片段在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的DNA構(gòu)筑物。作為用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)筑物的方案，沒有特殊限制，可以根據(jù)外來基因的導(dǎo)入形態(tài)(染色體外或染色體內(nèi))或宿主細(xì)胞的種類選擇采用質(zhì)粒(DNA)、噬菌體 (DNA)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(DNA)、人工染色體(YAC、PAC、BAC、MAC等)。因此，該DNA構(gòu)筑物除了上述耐熱性DNA聚合酶基因之外，可以具有上述任一種方案的載體的構(gòu)成片段。優(yōu)選的原核細(xì)胞性載體、真核細(xì)胞性載體、動(dòng)物細(xì)胞性載體、植物細(xì)胞性載體在該領(lǐng)域是公知的。需要說明的是，作為質(zhì)粒DNA，例如可以舉出pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、 PAUR112或pAUR123等YCp型大腸桿菌-酵母穿梭載體、pYES32或YEpl3等YEp型大腸桿菌-酵母穿梭載體、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAURlOl 或 pAURl!35 等 YIp 型大腸桿菌-酵母穿梭載體等。作為噬菌體DNA，可以舉出λ噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、 EMBL4、Xgtl00、gtll、zap)、ΦX174、M13mpl8 或 M13mpl9 等。作為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，可以舉出Ty因子等。作為YAC，可以舉出pYACC2等。制備該DNA構(gòu)筑物時(shí)，用合適的限制酶切斷含有上述耐熱性DNA聚合酶基因的片段等，插入到使用的載體DNA的限制酶位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)等。該DNA構(gòu)筑物的第1方案具有啟動(dòng)子片段，所述啟動(dòng)子片段可表達(dá)地連接有由上述耐熱性DNA聚合酶基因構(gòu)成的DNA片段。即，通過啟動(dòng)子控制，在所述啟動(dòng)子的下游側(cè)連接上述耐熱性DNA聚合酶基因片段。上述耐熱性DNA聚合酶基因的表達(dá)中，如果使用酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子，則優(yōu)選使用例如gall啟動(dòng)子、gallO啟動(dòng)子、丙酮酸脫羧酶基因啟動(dòng)子、熱休克蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、MF α 1 啟動(dòng)子、ΡΗ05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子等。另外，作為該DNA構(gòu)筑物其他方案的第2DNA構(gòu)筑物，除了該DNA之外，還具有用于在宿主染色體中進(jìn)行同源重組的DNA片段。同源重組用DNA片段是與宿主染色體中將要導(dǎo)入上述耐熱性DNA聚合酶基因的靶位點(diǎn)附近的DNA序列相同的DNA序列。至少具有1個(gè)同源重組用DNA片段，優(yōu)選具有2個(gè)。例如，優(yōu)選使2個(gè)同源重組用DNA片段為與染色體上的靶位點(diǎn)上游側(cè)和下游側(cè)的DNA相同的DNA序列，并且在上述DNA片段間連接上述耐熱性DNA 聚合酶基因。通過同源重組在宿主染色體上導(dǎo)入上述耐熱性DNA聚合酶基因時(shí)，可以由宿主染色體上的啟動(dòng)子可控制地導(dǎo)入該DNA。此時(shí)，通過靶基因的導(dǎo)入，同時(shí)破壞本來應(yīng)該由該啟動(dòng)子控制的內(nèi)在性基因，可以使外來的上述耐熱性DNA聚合酶基因代替該內(nèi)在性基因進(jìn)行表達(dá)。該啟動(dòng)子為在宿主細(xì)胞中高度表達(dá)的啟動(dòng)子時(shí)特別有用。以下，對(duì)利用上述的DNA構(gòu)筑物進(jìn)行的宿主轉(zhuǎn)化進(jìn)行說明。一旦DNA構(gòu)筑物被構(gòu)筑，則可以使用下述各種適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ械娜我环N將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，所述方法為轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)染法、接合法、原生質(zhì)體融合、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、乙酸鋰法、基因槍法、磷酸鈣沉淀法、農(nóng)桿菌法、PEG法、直接顯微注射法等。導(dǎo)入DNA構(gòu)筑物后，其接收細(xì)胞在選擇培
養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過DNA構(gòu)筑物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體中，DNA構(gòu)筑物的構(gòu)成成分存在于染色體上或染色體外因子(包括人工染色體)上。確認(rèn)期望的啟動(dòng)子下是否導(dǎo)入了上述耐熱性DNA聚合酶基因，可以利用PCR法或 southern雜交法進(jìn)行。例如，由轉(zhuǎn)化體制備DNA，利用導(dǎo)入位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行PCR，通過在電泳中檢測(cè)所預(yù)期的條帶，可以對(duì)PCR產(chǎn)物確認(rèn)?；蛘咭部梢杂靡詿晒馍氐葮?biāo)記的引物進(jìn)行PCR來確認(rèn)。上述方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是公知的。酵母為宿主細(xì)胞時(shí)，可以使用破壞了酵母基因的菌株。例如，導(dǎo)入基因時(shí)，如果尿嘧啶合成酶基因存在于質(zhì)粒中，則可以使用尿嘧啶缺陷型株選拔導(dǎo)入了質(zhì)粒的酵母。另外， 可以使用蛋白酶缺失株抑制在酵母細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)的蛋白質(zhì)的分解。所述方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是公知的。以下，對(duì)使用上述轉(zhuǎn)化體制造耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行說明。對(duì)導(dǎo)入DNA構(gòu)筑物所得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，由此在培養(yǎng)物中生成作為外來基因的表達(dá)產(chǎn)物的耐熱性DNA 聚合酶。通過進(jìn)行從培養(yǎng)物中分離耐熱性DNA聚合酶的步驟，可以獲得耐熱性DNA聚合酶制品。需要說明的是，本發(fā)明中所謂培養(yǎng)物，包括培養(yǎng)細(xì)胞或菌體、細(xì)胞或菌體的破碎物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)中，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化體的種類選擇培養(yǎng)條件。所述培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是公知的。作為培養(yǎng)以酵母為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，只要為含有微生物可同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等、且能夠有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，沒有特殊限定，可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任一種，但樣品微生物為微量時(shí)，為了生產(chǎn)可適用的耐熱性DNA聚合酶制品，優(yōu)選使用合成培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化物、乙酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等醇。作為氮源，除了可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽或其他的含氮化合物之外，還可以使用胨、肉浸膏、玉米漿等。作為無機(jī)物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養(yǎng)通常在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下、在30°C下進(jìn)行M 72小時(shí)。培養(yǎng)期間，優(yōu)選pH保持在5.0 7.0。另外，pH的調(diào)節(jié)可以使用無機(jī)或有機(jī)酸、 堿溶液等進(jìn)行。作為培養(yǎng)以植物細(xì)胞作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，只要為含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、有機(jī)物等并能夠培養(yǎng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基即可，沒有特殊限定，作為例子，可以舉出通常使用的MS培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、Gamborg B5培養(yǎng)基、WP培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基等。作為碳源，可以舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物、乙酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等醇，其中，優(yōu)選蔗糖、葡萄糖。作為氮源，除了硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣等硝酸鹽、磷酸銨、硝酸銨、硫酸銨等銨鹽或有機(jī)酸的銨鹽或者其他的含氮化合物之外，還可以舉出胨、肉浸膏、玉米漿、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、 絲氨酸、鳥氨酸等氨基酸等。作為無機(jī)鹽類，可以舉出磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、 硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。作為有機(jī)物，作為維生素類，除了可以舉出鹽酸硫胺、 煙酸、鹽酸吡多辛、生物素、葉酸、對(duì)氨基苯甲酸等之外，還可以舉出肌醇、椰奶、酪蛋白水解產(chǎn)物等。另外，作為植物激素，可以舉出吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸等茁長(zhǎng)素類、玉米素、6-芐基腺嘌呤、激動(dòng)素等細(xì)胞分裂素類、脫落酸、赤霉酸等，但是只要能夠培養(yǎng)植物細(xì)胞即可，可以含有也可以不含有上述植物激素。培養(yǎng)通常在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下、在25°C下進(jìn)行5天 6周。作為培養(yǎng)以動(dòng)物細(xì)胞作為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用通常使用的 RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基或在上述培養(yǎng)基中添加有胎牛血清等得到的培養(yǎng)基。培養(yǎng)通常在5% CO2存在下、37°C下進(jìn)行1 30天。培養(yǎng)中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加卡那
霉素、青霉素等抗生素。培養(yǎng)結(jié)束后，能夠從培養(yǎng)液或培養(yǎng)菌體等培養(yǎng)物中以所期望的形態(tài)得到耐熱性 DNA聚合酶。例如為了得到含有耐熱性DNA聚合酶的制品，可以利用之前舉出的方法。進(jìn)而，也可以從利用之前舉出的提取物制備法得到的提取物(例如粗提取成分)中分離純化耐熱性DNA聚合酶，將其作為純化品。對(duì)上述提取物實(shí)施各種色譜法、電泳等可以得到純化酶樣品。例如通過適當(dāng)選擇下述方法或者將它們組合可以獲得經(jīng)純化的目的基因產(chǎn)物，所述方法為使用S印hadex、 UltraGel或Biogel等的凝膠過濾、離子交換色譜、使用聚丙烯酰胺凝膠等的電泳法、使用親合色譜、反相色譜等的分離法。需要說明的是，經(jīng)純化的基因產(chǎn)物具有的氨基酸序列可以根據(jù)公知的氨基酸分析法進(jìn)行分析。上述培養(yǎng)法、純化法只是一個(gè)例子，并不限定于此。特別是本發(fā)明中，培養(yǎng)產(chǎn)物中大部分耐熱性DNA聚合酶以不溶性的形式被生成， 通過對(duì)其加熱能夠具有活性、提高溶解度、純度。通過在直至得到耐熱性DNA聚合酶的所期望形態(tài)(例如制品或純化品)為止的適當(dāng)階段中進(jìn)行加熱處理，能夠使由宿主菌生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶增溶及活化。例如，在培養(yǎng)菌體破碎后進(jìn)行離心分離，分開上清液、沉淀，對(duì)沉淀部分、或者對(duì)在菌體內(nèi)生產(chǎn)蓄積耐熱性DNA聚合酶的菌體進(jìn)行加熱處理，由此可以同時(shí)達(dá)成耐熱性DNA聚合酶的增溶和活化。該加熱處理優(yōu)選在50°C 100°C、較優(yōu)選在70°C 80°C、更優(yōu)選在73°C 75°C下進(jìn)行1小時(shí)左右，較理想。另外，通過對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的上清液部分進(jìn)行加熱，也可以使來自宿主的蛋白質(zhì)不溶化，提高純度。對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的上清液部分的加熱優(yōu)選在50°C 100°C、較優(yōu)選在70V 80°C、更優(yōu)選在73°C 75°C下進(jìn)行1小時(shí)左右， 較理想。本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品的制造中，以真核細(xì)胞作為宿主導(dǎo)入對(duì)耐熱性 DNA聚合酶進(jìn)行編碼的基因、使其表達(dá)，由此可以獲得耐熱性DNA聚合酶制品，且該耐熱性 DNA聚合酶制品中來自細(xì)菌DNA的核酸等的混入完全不存在、或者極度降低。因此在得到純化品時(shí)，也能夠獲得下述效果，即，純化步驟所要求的與上述核酸等的混入相關(guān)的純化精度或步驟被減少，實(shí)現(xiàn)制造成本的降低。(2) PCR 法作為使用本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品的PCR法，只要為用于擴(kuò)增靶基因的PCR法即可，可以使用各種PCR法，所述靶基因用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行檢測(cè)。作為優(yōu)選的PCR法，可以舉出以下方法。(A)通常的PCR法，或PCR的變形方法，所謂變形方法是單獨(dú)使用以下的a、b、c或者組合使用A和B或A和C的PCR法。a. PCR法使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR法，包括以下步驟。(al)設(shè)計(jì)引物，使用作目標(biāo)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高于引物二聚體自身的值。(a2)將實(shí)時(shí)PCR的熒光檢測(cè)時(shí)的溫度設(shè)定在它們的中間。b. PCR法是用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列的半嵌套式擴(kuò)增的方法，包含以下階段。(bl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中混合上述試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及半嵌套式引物。(b2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段bl的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并使其延伸、 且半嵌套式引物不工作的溫度。(b3)為了提供半嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，將階段1^2的混合物在下述擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，即，在只有外側(cè)的PCR用引物的一個(gè)和半嵌套式引物退火的溫度下、或使其延伸的延伸時(shí)間下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。c. PCR法是用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列的嵌套式擴(kuò)增的方法，包括以下階段。(cl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中混合上述試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及嵌套式引物對(duì)。(c2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段(Cl)的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并使其延伸、且嵌套式弓I物對(duì)不工作的溫度。(c3)為了提供嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)階段(W)的混合物在下述擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，即，在只有嵌套式引物對(duì)進(jìn)行退火的溫度下、或使其延伸的延伸時(shí)間下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。(B) PCR法是作為涉及定量法的PCR變形方法的、使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR法，包括以下步驟。(al)設(shè)計(jì)引物，使用作目標(biāo)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高于引物二聚體自身的值。(a2)將實(shí)時(shí)PCR的熒光檢測(cè)時(shí)的溫度設(shè)定在它們的中間。(2-3)與本發(fā)明的檢測(cè)法及定量法相關(guān)的PCR變形方法，是用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列的半嵌套式擴(kuò)增的方法，是包括以下階段而成的PCR法。(bl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中混合上述試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及半嵌套式引物，(b2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段bl的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)進(jìn)行退火并使其延伸、且半嵌套式引物不工作的溫度。(b3)為了提供半嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)階段1^2的混合物在下述擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，即，在只有外側(cè)的PCR用引物的一個(gè)和半嵌套式引物退火的溫度下、或使其延伸的延伸時(shí)間下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。
(C)PCR法是作為用作檢測(cè)法及定量法的PCR變形方法的、用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列嵌套式擴(kuò)增的方法，包括以下階段。(Cl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中含有上述試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及嵌套式引物對(duì)。(c2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段Cl的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)進(jìn)行退火并使其延伸、且在干涉引物對(duì)的阻礙作用下嵌套式引物對(duì)不工作的溫度。(c3)為了提供嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，將階段c2的混合物在下述的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，即，在只有嵌套式引物對(duì)退火的溫度下、或使其延伸的延伸時(shí)間下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。與本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品組合時(shí)有用的PCR變形方法之一為掩蔽引物二聚體法(A法)。掩蔽引物二聚體法與現(xiàn)有的引物二聚體的形成抑制方法不同，是僅將引物二聚體不顯示的方法。該方法是考慮到“由于引物二聚體作為擴(kuò)增產(chǎn)物較小，所以存在其 Tm值較低的傾向”，以下述步驟進(jìn)行使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR的方法(al)設(shè)計(jì)引物，使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高于引物二聚體的Tm值，(a2)將實(shí)時(shí)PCR的熒光檢測(cè)時(shí)的溫度設(shè)定為它們的中間值。由于通過進(jìn)行以上步驟只有引物二聚體從雙鏈解離為單鏈，所以嵌入劑不能結(jié)合。其結(jié)果，引物二聚體不熒光發(fā)光，監(jiān)測(cè)器上僅引物二聚體不顯示，能夠正常地繪出目的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。A法中使用的引物的設(shè)計(jì)，只要使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高于引物二聚體自身的值即可，沒有特殊限制，具體而言，可以如下設(shè)計(jì)，即，使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值在引物二聚體自身Tm值的5°C以上，優(yōu)選在10°C以上。A法中，實(shí)時(shí)PCR的熒光檢測(cè)時(shí)的溫度只要設(shè)定為成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物二聚體的Tm值的中間值即可，但根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物與引物二聚體的Tm值的差的程度，可以使中間值具有中間值前后、例如前后1 4°C左右的幅度。但是，熒光檢測(cè)溫度優(yōu)選為上述范圍內(nèi)的盡可能低的溫度。使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR，可以使用裝置、方法等通常已知的實(shí)時(shí)PCR，例如，可以舉出利用STOR Green I等熒光色素作為嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR。與本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品組合時(shí)有用的PCR變形方法的另一方法為，應(yīng)用套匣擴(kuò)增法、或研究PCR延伸時(shí)間。通過應(yīng)用套匣擴(kuò)增法或研究PCR延伸時(shí)間，可以無需如通常的嵌套式PCR法那樣分2次PCR進(jìn)行，而僅以1次的PCR進(jìn)行嵌套式PCR ( —步嵌套式PCR)。該一步嵌套式PCR法，只要加入通過簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)得到的“嵌套式引物”便可以立刻施行，因此任何人都可以簡(jiǎn)單地實(shí)施。一步嵌套式PCR法是下述B法或C法的PCR變形方法。B法該P(yáng)CR變形方法是用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列的半嵌套式擴(kuò)增的方法，包括以下階段。(bl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中混合試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及半嵌套式引物，(b2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段bl的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并使其延伸、 且半嵌套式引物不退火的溫度。
(b3)為了提供半嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，將階段1^2的混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為外側(cè)的兩個(gè)PCR用引物和半嵌套式引物退火、但只有嵌套的內(nèi)側(cè)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性的溫度?；蛘咴谥挥星短椎膬?nèi)側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠延伸的延伸時(shí)間的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理。B法中，擴(kuò)增反應(yīng)混合物由3種引物構(gòu)成。S卩，第1弓丨物為外側(cè)的PCR用引物對(duì)中的一個(gè)，第2引物為半嵌套式引物，第3引物為外側(cè)PCR用引物對(duì)中的另一個(gè)，且與半嵌套式引物也能成對(duì)。B法中，階段1^2中，只使外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并使其延伸、且半嵌套式引物不退火的溫度是必要的。另外，階段b3中，提供用于外側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不變性、只使內(nèi)側(cè)的嵌套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性從而延伸的溫度是必要的?；蛘咴陔A段b3中，提供不使外側(cè)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物延伸、只使內(nèi)側(cè)的嵌套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物延伸的延伸時(shí)間是必要的。B法中，用于將半嵌套式引物對(duì)退火的溫度優(yōu)選比用于將外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火的合適溫度低5°C 20°C。B法的階段al中，優(yōu)選引物以一定的溫度存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。B法中，優(yōu)選第1弓丨物與第3弓丨物的Tm值相同。B法中，優(yōu)選第2引物被設(shè)定在內(nèi)側(cè)以使其與第1、3中的任一個(gè)引物成為半嵌套式，且第2引物的Tm值比第1、3引物的Tm值低5 20°C。B法中，優(yōu)選與嵌套的內(nèi)側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物相比，外側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物足夠(約300bp 以上)大。C法該P(yáng)CR變形方法為用于試樣中靶核酸內(nèi)的序列嵌套式擴(kuò)增的方法，包括以下階段。(Cl)在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中混合試樣，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物含有外側(cè)的PCR用引物對(duì)及嵌套式引物對(duì)。(c2)為了提供外側(cè)的擴(kuò)增序列，將階段Cl的擴(kuò)增反應(yīng)混合物在以下溫度的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理，所述溫度為在用作模板的DNA上將外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并使其延伸、 且嵌套式引物對(duì)不退火的溫度。(c3)為了提供嵌套式擴(kuò)增產(chǎn)物，將階段c2的混合物在僅有嵌套的內(nèi)側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性的溫度下的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理。或者在只有嵌套的內(nèi)側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠延伸的延伸時(shí)間下的擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行處理。C法中，擴(kuò)增反應(yīng)混合物由4種引物構(gòu)成。即，第4、第5引物為外側(cè)的PCR用引物對(duì)，第6、第7引物為嵌套式引物對(duì)。C法中，在階段c2中，只使外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火并延伸、使嵌套式引物對(duì)不工作的溫度是必要的。另外，階段c3中，提供外側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不變性、只使內(nèi)側(cè)的嵌套式PCR產(chǎn)物變性從而延伸的溫度是必要的?；蛘咴陔A段c3中，提供外側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能延伸、只有內(nèi)側(cè)的嵌套式PCR產(chǎn)物能夠延伸的延伸時(shí)間是必要的。C法中，用于使嵌套式引物對(duì)退火的溫度優(yōu)選比用于使外側(cè)的PCR用引物對(duì)退火的合適溫度低5°C 20°C。C法中，階段cl中，優(yōu)選第4 7引物以一定的溫度存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。C 法中，優(yōu)選第6、第7弓丨物的Tm值比第4、第5引物的低5°C 20°C。C法中，優(yōu)選第4、第5 兩個(gè)引物的Tm值相同。C法中，優(yōu)選第6、第7兩個(gè)引物的Tm值相同。C法中，優(yōu)選與嵌套的內(nèi)側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物相比，外側(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物足夠(約300bp以上)大?！囱诒我锒垠w法〉以下所示的通常的PCR條件設(shè)定中，熒光檢測(cè)點(diǎn)設(shè)定在延伸反應(yīng)(extension)后的 72 °C。 設(shè)定溫度94°C、55°C、72°C 恒溫時(shí)間10秒·溫度變化率20. 00 [ °C /s]·循環(huán)數(shù)60由此，如圖13所示的擴(kuò)增曲線所示，蒸餾水(distilled water :D. W.)中檢測(cè)到引物二聚體(Pd)。此時(shí)，觀察例如E. Coli檢測(cè)時(shí)的熔解曲線(melting curve)，引物二聚體的Tm值為76°C左右、目的(E. coli)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為91°C左右(圖14)。因此，有意地設(shè)計(jì)引物，使目的PCR產(chǎn)物的Tm值比引物二聚體的Tm值高10°C左右，將熒光檢測(cè)點(diǎn)(FDP)設(shè)定在其中間值前后(例如如以下條件，為86°C )(圖10 也可以為不在延伸后的其他處)。·設(shè)定溫度94°C、55°C、72°C、86°C·恒溫時(shí)間10 秒(94°C、55°C、72°C ) ；1 秒(86°C )·溫度變化率20. 00[°C /s]·循環(huán)數(shù)60由此，完全未檢測(cè)到引物二聚體。S卩，由于不顯示引物二聚體，所以如果與本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品組合，則如圖15(A)所示，能夠得到在蒸餾水(D.W.)中完全未擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線。通過上述的“不顯示法+本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品+細(xì)菌的通用引物”的組合，能夠測(cè)定細(xì)菌至檢測(cè)限(圖14)、進(jìn)而由于標(biāo)準(zhǔn)曲線至檢測(cè)限為止表現(xiàn)出直線性，所以表明至檢測(cè)限為止可以準(zhǔn)確地定量。也就是說，通過在本發(fā)明方法上結(jié)合掩蔽引物二聚體法，利用使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR法，首次能夠以高靈敏度準(zhǔn)確地定量測(cè)定細(xì)菌。< 一步嵌套式PCR法>設(shè)計(jì)下述引物(參見圖11(A))。(a)使外側(cè)的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物I )的正向及反向引物各自的Tm值相同或相近。(b)在內(nèi)側(cè)設(shè)定引物(引物II )，所述引物(引物II )與外側(cè)的PCR產(chǎn)物的任一方的引物成為半嵌套式。(c)設(shè)計(jì)半嵌套式引物，使其Tm值比外側(cè)的PCR產(chǎn)物的引物的Tm值低5 20°C。(d)設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物I為約400bp以上的引物，使外側(cè)的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物I )的 Tm值為89°C以上。(e)設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物II為約IOObp的引物，使半嵌套式PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物II )的 Tm 值為 86°C 87°C。進(jìn)行特異度更高的嵌套式PCR時(shí)，設(shè)計(jì)如下的新引物(參見圖11(B))。(a)使外側(cè)的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物I )的正向及反向引物各自的Tm值相同或相近。
(b)以成為嵌套式的2個(gè)引物(引物II )的Tm值與擴(kuò)增產(chǎn)物I的引物的Tm值相比足夠(5 20°C )的低的方式進(jìn)行設(shè)定。(c)設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物I為約500bp以上的引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物I的Tm值為89°C以上。(d)設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物II為約IOObp的引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物II的Tm值為86°C 87V。(e)設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物I、II、IV均為約300bp以上的引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物III、IV各自的Tm 值為89°C以上。(3)檢測(cè)對(duì)象生物的檢測(cè)方法(檢測(cè)方法)檢測(cè)本發(fā)明的樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的方法的特征在于，包括以下步驟(1)擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品配制的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)檢測(cè)步驟，檢測(cè)上述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物中的上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。上述檢測(cè)方法中，優(yōu)選在靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增被抑制的條件下進(jìn)行擴(kuò)增步驟。上述靶外基因的擴(kuò)增抑制中可以優(yōu)選利用使用了抗DNA聚合酶抗體的熱啟動(dòng)法。此時(shí)，優(yōu)選相對(duì)于IU耐熱性DNA聚合酶，使用過量的抗DNA聚合酶抗體。檢測(cè)步驟以下述方式進(jìn)行，S卩，可檢測(cè)出上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，不能檢測(cè)出靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。作為用于此的方法，優(yōu)選下述方法，即，以下述方式設(shè)定可檢測(cè)出靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物、不能檢測(cè)出靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的條件，由此只檢測(cè)出靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述方式為(1)設(shè)計(jì)上述引物，使靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmA)高于靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmB)，(2)在TmA和TmB之間的溫度下進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。進(jìn)而，可以使用下述方法，S卩，通過使用顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量的顯示裝置的實(shí)時(shí)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增步驟和檢測(cè)步驟，使靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在上述顯示裝置中不顯示的方法。在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中，可以使用具有檢測(cè)用標(biāo)記的嵌入劑。檢測(cè)步驟可以通過在凝膠上展開擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳展開并可視化。作為檢測(cè)對(duì)象生物，可以舉出選自細(xì)菌、真菌、病毒中的1種或2種以上。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中的感染癥病原菌的高靈敏度檢測(cè)。進(jìn)而， 本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠優(yōu)選適用于下述情況，即，為選自用于血液、腦脊髓液、羊水、尿、食品(也包括食品加工環(huán)境的污染檢查)、飲料、化妝品、水質(zhì)檢查、生物實(shí)驗(yàn)環(huán)境的污染檢查的樣品的應(yīng)該為無菌環(huán)境的樣品。作為用于水質(zhì)檢查的樣品，可以舉出自來水、來自蓄水或供水槽的水、空調(diào)循環(huán)水、加濕器水、溫泉水或池塘水。檢測(cè)步驟中，通過定量靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物、并利用其定量結(jié)果，能夠進(jìn)行樣品中檢測(cè)對(duì)象生物的定量、個(gè)體數(shù)的測(cè)定、存在量的掌握、定量鑒定等。以下，對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量方法進(jìn)行說明。(定量方法)本發(fā)明的定量樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的方法包括以下步驟(1)擴(kuò)增步驟，使用由樣品制備的DNA、用于擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(2)定量步驟，定量上述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所得的定量結(jié)果定量上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物。作為檢測(cè)對(duì)象生物，只要具有用于傳遞信息的核酸即可，例如可以舉出細(xì)菌(真細(xì)菌、古細(xì)菌)、真菌、病毒等。使用了本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品的本發(fā)明的定量方法特別適合細(xì)菌的定量。定量可以通過將擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果與使用標(biāo)準(zhǔn)的生物的結(jié)果相比較而進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的定量方法，能夠?qū)悠分械臋z測(cè)對(duì)象生物的個(gè)體數(shù)或整體質(zhì)量進(jìn)行定量。進(jìn)而，能夠通過選擇檢測(cè)對(duì)象生物的鑒定用基因作為靶基因，根據(jù)靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果，定量并鑒定樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物。作為來自樣品的核酸，可以利用從樣品中得到的DNA、以及基于從樣品中得到的 RNA制備的cDNA。另外，根據(jù)目的也可以以RNA作為直接擴(kuò)增對(duì)象。作為樣品，可以舉出應(yīng)該為無菌環(huán)境的樣品。作為所述應(yīng)該為無菌環(huán)境的樣品，可以舉出血液、腦脊髓液、羊水或尿等從人或家畜的生物體取樣所得的試樣。進(jìn)而，作為樣品， 可以利用用于水質(zhì)檢查的樣品。作為上述用于水質(zhì)檢查的樣品，可以舉出自來水、來自蓄水或供水槽的水、空調(diào)循環(huán)水、加濕器水、溫泉水或池塘水。進(jìn)而，作為樣品也可以利用食品、 飲料或化妝品、生物系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)液等含有有機(jī)物、且細(xì)菌或真菌的混入或增殖會(huì)導(dǎo)致質(zhì)量劣化的樣品。由樣品制備DNA，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，供應(yīng)至擴(kuò)增步驟時(shí)，根據(jù)需要可以除去除DNA之外的成分、或調(diào)整DNA濃度。擴(kuò)增步驟中，能夠適用PCR、其中優(yōu)選適用實(shí)時(shí)PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中，可以利用各種公知的方法。例如可以舉出使用具有標(biāo)記功能的嵌入劑的方法、或使用在對(duì)擴(kuò)增的DNA 序列特異性雜交的核苷酸上結(jié)合有熒光物質(zhì)的探針的方法等。作為嵌入劑，可以舉出溴化乙錠、STOR Green I等。優(yōu)選的嵌入劑為STOR Green I。需要說明的是，使用與全部的細(xì)菌DNA反應(yīng)的通用引物時(shí)，應(yīng)該使用的STOR Green I優(yōu)選使用將來自重組宿主的細(xì)菌DNA 的混入抑制為最小限度的高純度的STOR Green I。上述方法中的擴(kuò)增步驟優(yōu)選在靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增被抑制的條件下進(jìn)行。在所述靶外基因的擴(kuò)增抑制中，例如可以舉出熱啟動(dòng)法、使用修飾引物的方法、在樣品中添加與引物二聚體結(jié)合的物質(zhì)的方法、在含有耐熱性DNA聚合酶的基因擴(kuò)增溶液中添加化學(xué)物質(zhì)的方法等，其中，優(yōu)選熱啟動(dòng)法。作為熱啟動(dòng)法，可以舉出使用抗DNA聚合酶抗體的方法、直至蠟的熔解溫度為止分離酶和引物的蠟法等。進(jìn)行使用抗DNA聚合酶抗體的方法時(shí)，優(yōu)選使用耐熱性DNA聚合酶的酶活性被100%阻礙的量以上的過量的抗DNA聚合酶抗體。(不顯示法)進(jìn)而，利用不顯示法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的定量，由此可以簡(jiǎn)便且高靈敏度地定量。所述不顯示法是在使靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為可檢測(cè)到的狀態(tài)，靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為不可檢測(cè)到狀態(tài)的條件下進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)的方法。具體而言，通過如下方式設(shè)定靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物可檢測(cè)到、除靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物不可檢測(cè)到的條件(1)設(shè)計(jì)上述引物，使上述靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmA)高于上述靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmB)，(2)在TmA和TmB之間的溫度下進(jìn)行上述擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。該不顯示法可以優(yōu)選適用于實(shí)時(shí)PCR法，所述實(shí)時(shí)PCR法使用顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量的顯示裝置進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。使用該裝置時(shí)，在擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析時(shí)靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在顯示裝置上不顯示、可以排除靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)靈敏度造成的影響。作為靶外基因特別成為問題的是引物二聚體。由樣品制備的DNA的量為微量時(shí)， 在擴(kuò)增初期，相對(duì)于由樣品制備的DNA，引物過量地存在，如果形成引物二聚體，則以此為基礎(chǔ)形成擴(kuò)增產(chǎn)物，不能監(jiān)測(cè)本來應(yīng)該檢測(cè)到的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，或者不能定量。對(duì)于所述引物二聚體的產(chǎn)生，優(yōu)選利用熱啟動(dòng)法及/或不顯示法。完全阻礙引物二聚體(Primer Dimer)的形成是非常困難的，即使使用各種引物二聚體形成抑制方法，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，有時(shí)也可檢測(cè)到引物二聚體。其結(jié)果，成為利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行定量測(cè)定的靈敏度降低的主要原因。另外，即使在定性檢查中，采取每次測(cè)定檢查Tm值(熔解溫度melting temperature)，排除由引物二聚體產(chǎn)生的“假陽性”的方法有時(shí)也是必要的。不顯示法與現(xiàn)有的引物二聚體的形成抑制方法不同，為只使引物二聚體不顯示的方法(掩蔽引物二聚體)，是考慮到“由于引物二聚體作為擴(kuò)增產(chǎn)物較小，所以存在其Tm值較低的傾向”而得到的方法。利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行掩蔽引物二聚體法中，設(shè)定以下條件。(1)設(shè)計(jì)引物，使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為比引物二聚體的Tm值高的值。(2)將實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)的溫度設(shè)定為它們的中間值。通過以上的條件設(shè)定，在擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)時(shí)，只有引物二聚體從雙鏈解離為單鏈。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(雙鏈DNA)時(shí)，使用不檢測(cè)單鏈DNA、只檢測(cè)雙鏈DNA的標(biāo)記、例如嵌入劑，由此由于只有引物二聚體從雙鏈解離為單鏈，所以嵌入劑不能結(jié)合。其結(jié)果，不產(chǎn)生基于引物二聚體的檢測(cè)信號(hào)，顯示裝置(監(jiān)測(cè)器)上只有引物二聚體不顯示，能夠正常地繪制目的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。使用上述不顯示法時(shí)的引物的設(shè)計(jì)，只要使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值高于引物二聚體自身的值即可，沒有特殊限定，可以如下設(shè)計(jì)引物，即，使成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為引物二聚體自身的Tm值的5°C以上，優(yōu)選10°C以上。需要說明的是，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值根據(jù)測(cè)定系統(tǒng)而設(shè)定。具體而言，(1)利用現(xiàn)有的設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)難以生成引物二聚體的引物。(2)將引物自身的Tm值設(shè)計(jì)為60°C以下。(3)通過用最近鄰分析法計(jì)算，將成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值設(shè)計(jì)為約87V 或其以上。使用上述引物擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，只要為能夠設(shè)計(jì)成比引物二聚體自身的Tm 值高的大小即可，沒有特殊限定，利用實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增中優(yōu)選如下設(shè)計(jì)引物，S卩，使擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為理想的50bp lOOObp、優(yōu)選為50bp 500bp左右。
實(shí)時(shí)PCR的熒光檢測(cè)時(shí)的溫度，只要設(shè)定為成為目的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物二聚體的Tm值的中間值即可，但根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物與引物二聚體的Tm值差的程度，可以使中間值具有中間值前后、例如前后約1 4°C的幅度。但是，考慮到雙鏈DNA的穩(wěn)定性，優(yōu)選將熒光檢測(cè)時(shí)的溫度設(shè)定為盡可能低的溫度。使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR，可以使用裝置、方法等通常已知的實(shí)時(shí)PCR，例如，可以舉出利用SYBR Green (SYBR Green I )作為嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR。根據(jù)掩蔽引物二聚體法，引物二聚體的形成不會(huì)成為使用了嵌入劑的實(shí)時(shí)PCR法的阻礙要因，可以不降低靈敏度地進(jìn)行定量檢查，定性檢查中也沒有由引物二聚體引起的假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。并且，與使用了抗DNA聚合酶抗體的熱啟動(dòng)法等現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)。利用該不顯示法，可以進(jìn)行測(cè)定至檢測(cè)限為止，進(jìn)而標(biāo)準(zhǔn)曲線至檢測(cè)限為止顯示出直線性，所以利用實(shí)時(shí)PCR法，能夠以高靈敏度準(zhǔn)確地進(jìn)行定量測(cè)定。(來自擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì)象生物的PCR法定量)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量判定檢測(cè)對(duì)象生物的量(也包括不存在的情況)時(shí)，可以優(yōu)選利用基于標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行的方法，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)在進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的條件(方案)下的已知的檢測(cè)對(duì)象生物量求出的。例如，利用以某特定的方案繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果檢測(cè)限(靈敏度)為0. lCFU/ml，且為35次循環(huán)，則可以進(jìn)行35次循環(huán)的PCR反應(yīng)，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示的基準(zhǔn)算出檢測(cè)對(duì)象生物的量。需要說明的是，方案中如果加入樣品的濃縮步驟、或乙醇沉淀處理，則可以進(jìn)一步提高檢測(cè)限(靈敏度)(例如大概至60次循環(huán)為止)。由此，也可以將靈敏度設(shè)定為非常高，例如為0.000001CFU/ml。另外，能夠設(shè)定的檢測(cè)靈敏度可以預(yù)先算出。例如，利用“檢測(cè)對(duì)象的高靈敏度定量方法”的生活用水的定量中，細(xì)菌的通用引物的PCR檢測(cè)靈敏度為IOfg/μ 1，真菌的通用引物的PCR檢測(cè)靈敏度為lOpg/μΙ，所以如果使用換算為GFU/ml的換算式、進(jìn)而在最初追加將50ml樣品顆?；崛NA，則變?yōu)榧?xì)菌3.OX lO—CFU/ml真菌2.8CFU/ml。需要說明的是，通過改變方案，也能夠改變檢測(cè)靈敏度。(來自擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì)象生物的凝膠展開法定量)利用瓊脂糖凝膠等展開擴(kuò)增產(chǎn)物(也包括使用熱啟動(dòng)法的情況)，根據(jù)對(duì)其量進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)的熒光強(qiáng)度等，也可以簡(jiǎn)便地進(jìn)行檢測(cè)對(duì)象生物的定量。(判定細(xì)菌是否存在的方法)本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶可以優(yōu)選用于以下方法。( I )判定樣品中是否存在細(xì)菌的方法，其特征在于，在判定樣品中是否存在細(xì)菌的方法中，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用用于擴(kuò)增對(duì)上述細(xì)菌為特異性的靶基因的引物(B)、和以真核細(xì)胞作為宿主制造的含有耐熱性DNA聚合酶的制品，進(jìn)行核酸增殖反應(yīng)，和(2)將上述第一擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物可視化的步驟，其中，上述引物(B)為(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組、及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物。
作為將上述擴(kuò)增產(chǎn)物可視化的方法可以使用凝膠電泳。( II )掌握樣品中的細(xì)菌的存在量的方法，其特征在于，掌握樣品中的細(xì)菌的存在量的方法中包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用用于擴(kuò)增對(duì)上述細(xì)菌為特異性的靶基因的引物(B)、和以真核細(xì)胞作為宿主制造的含有耐熱性DNA聚合酶的制品，進(jìn)行核酸增殖反應(yīng)，和(2)將上述第一擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)值化的步驟，其中，上述引物(B)為，(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物。作為將上述擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)值化的方法，可以使用吸光度測(cè)定法或光密度測(cè)定法。(定量鑒定方法)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量方法可以優(yōu)選適用于以下進(jìn)行檢測(cè)對(duì)象生物的定量并鑒定的方法。(A)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的DNA、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(B)及(M)、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的DNA、和用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(4)第二定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定上述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟和上述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果，對(duì)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定，其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，(B)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(B)、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，
(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的DNA、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(4)第二定量鑒定步驟，基于對(duì)上述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)的組合，解析上述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定上述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟和上述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果對(duì)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定，(5)第三擴(kuò)增步驟，使用由上述樣品制備的DNA、用于擴(kuò)增對(duì)上述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物(M)、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(6)第三定量鑒定步驟，基于上述對(duì)靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm 值)解析上述第三擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)，對(duì)上述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定，其中，上述引物(B)、(F)及(M)如下所述(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，各引物可以從含有全部或1/3以上堿基序列的引物中選擇，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，各引物可以從含有全部或1/3以上堿基序列的引物中選擇，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，需要說明的是，本申請(qǐng)發(fā)明中作為含有構(gòu)成各引物組的引物的一部分的物質(zhì)，只要不破壞作為通用引物的功能(識(shí)別特定通用區(qū)域的功能)即可，例如可以舉出對(duì)作為通用引物設(shè)計(jì)的堿基序列削除或追加1 3個(gè)堿基所得的物質(zhì)。作為細(xì)菌的16SrRNA基因的擴(kuò)增區(qū)域，優(yōu)選設(shè)定3 10的擴(kuò)增區(qū)域。另外，作為真菌的ISSrRNA基因的擴(kuò)增區(qū)域，優(yōu)選設(shè)定3 10。進(jìn)而，通過增加下述步驟，能夠進(jìn)行更高精度的測(cè)定，所述步驟為使用“能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組、及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物組”中的任一種，每次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)Tm值，由此校正上述擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值的測(cè)定誤差。另外，可以加入下述步驟，S卩，作為用于鑒定檢測(cè)對(duì)象生物的算法，不僅利用上述 Tm值本身的組合，而且也可以利用各Tm值間的差的組合進(jìn)行鑒定，由此使測(cè)定誤差的影響為最小限度。另外，作為校正設(shè)備每次試行的測(cè)定誤差且不需要上述“每次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)Tm值”的方法，可以利用“算出Tm值的組合的平均值，各Tm值與該平均值的相對(duì)值的組合”。S卩，為以Tm值的組合的配置作為“形狀”進(jìn)行鑒定的方法。Tm值的組合的配置所呈的2維“形狀”不受測(cè)定誤差的影響。例如，使檢測(cè)對(duì)象生物的特異性Tm值的組合(η個(gè))為Tldb Tndb (db為database)、使與該平均值的相對(duì)值分別為dldb dndb (圖11 (C) :n為1 5 的例子)。同樣地使從樣品得到的未知的檢測(cè)對(duì)象生物的Tm值的組合(η個(gè))為Tlref Tnref (ref為reference)，使與該平均值的相對(duì)值分別為dlref dnref (圖11 (C))。接下來，與database比較，將“相對(duì)值的組合近似的情況=Tm值的組合的配置的“形狀”近似的情況”作為鑒定算法。因此，以下的計(jì)算式
Dist. = r (D1db—D1TOf)2+(D2db—D2ref)2+...+(D7db—D7ref)2}最接近0時(shí)，可以鑒定為所求的檢測(cè)對(duì)象生物。以上的算法可以以計(jì)算機(jī)上數(shù)據(jù)庫型鑒定軟件的形式利用。上述的方法(A)及(B)，是應(yīng)用對(duì)下述內(nèi)容進(jìn)行深入研究的結(jié)果(W02007/097323) 而最先完成的，所述內(nèi)容為在利用本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品所得的定量化技術(shù)上， 以最近鄰分析法的“熔解溫度(melting temperature :Tm值)由堿基序列決定”這一理論根據(jù)為基礎(chǔ)，將每個(gè)菌種的Tm值的差異應(yīng)用到檢測(cè)對(duì)象生物的鑒定上。以下，具體說明上述方法。(1)已知細(xì)菌的16SrRNA具有7 10處幾乎所有細(xì)菌共有的堿基序列區(qū)域QO 40個(gè)堿基)。通過在上述全部或部分處分別設(shè)定正向和反向的引物，制備3 10個(gè)基因擴(kuò)增區(qū)域。(2)基因擴(kuò)增區(qū)域約為150 200個(gè)堿基，除了設(shè)定引物的共有的保存區(qū)域之外， 各個(gè)細(xì)菌還具有固有的堿基序列。因此，Tm值也反應(yīng)堿基序列的不同，表示固有的值，可以推定每個(gè)細(xì)菌具有1 10 種特征Tm值。因此，研究與細(xì)菌種類相應(yīng)的1 10個(gè)Tm值，將其數(shù)據(jù)庫化。利用該數(shù)據(jù)庫能夠鑒定未知的細(xì)菌。(3)進(jìn)而，通過同時(shí)使用真菌固有的引物3 10個(gè)、和呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA 基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因的引物，能夠針對(duì)未知的起因菌鑒定細(xì)菌感染和其種類(包括耐抗生素基因的有無)、或者真菌感染和其種類。(4)產(chǎn)生非特異性的基因產(chǎn)物，顯示出與目的Tm值接近的值時(shí)，產(chǎn)生假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。上述情況，通過使基因擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物流過瓊脂糖凝膠，確認(rèn)條帶的大小，能夠?qū)Y(jié)果進(jìn)行雙重檢驗(yàn)。S卩，使用現(xiàn)有的利用基因擴(kuò)增的檢測(cè)法采用雙重檢驗(yàn)系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)提高檢查精度。另外，通過“掩蔽引物二聚體法等引物二聚體的解決法+本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品+細(xì)菌的通用引物”的組合，能夠基本完全避免由非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。(5)采用實(shí)時(shí)PCR作為基因擴(kuò)增方法時(shí)，利用其定量性、在治療前后對(duì)菌量進(jìn)行相對(duì)定量，由此可以實(shí)現(xiàn)治療效果的監(jiān)測(cè)的提高。(6)實(shí)時(shí)PCR儀中，有利用加熱模塊進(jìn)行溫度控制的模塊型、和通過空氣進(jìn)行溫度控制的空氣浴型2種，利用加熱模塊型在每次試行產(chǎn)生士0. 1 0. 3°C (根據(jù)廠家而不同) 的Tm值測(cè)定誤差(在相同試行次數(shù)中樣品間誤差為士0.2°C左右)。為了使該測(cè)定誤差不妨礙菌種鑒定，優(yōu)選采用在判定中利用相同試行次數(shù)的各Tm值間的差異圖案的方法。另一方面，利用空氣浴型的Rotor gene 6000 (QIAGEN公司)，管間的溫度均一性為士0.01°C，很難產(chǎn)生Tm值測(cè)定誤差，為優(yōu)選。(7)感染多個(gè)菌時(shí)，利用實(shí)時(shí)PCR建立擴(kuò)增曲線后，如果在達(dá)到穩(wěn)態(tài)(plateau)的時(shí)刻停止擴(kuò)增循環(huán)，繼續(xù)進(jìn)行Tm值的解析，則只能鑒定感染量最多(一般認(rèn)為有可能為主要的感染微生物)的微生物。引物如下所示?！唇M合組1>(1-1)從所有的細(xì)菌的16SrRNA基因共有的序列區(qū)域中選出5處，設(shè)定正向引物和反向引物(擴(kuò)增產(chǎn)物為4個(gè))。具體而言，為以下含有全部或1/3以上引物堿基序列的引物。(Bi)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. Coli)的16SrRNA基因的第809位到第905位相當(dāng)?shù)?7 個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物1 :Bac. 1)?！ば蛄刑?hào) 80. GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG(24mer)正向·序列號(hào) 2. CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT (2 Imer)反向(B2)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第927位到第1092位相當(dāng)?shù)?166個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物2 =Bac. 2)?！ば蛄刑?hào) 3. AAACTCAAAGGAATTGACGGG (2 Imer)正向·序列號(hào) 4. CGCTCGTTGCGGGAC (15mer)反向(B3)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第1108位到1218位相當(dāng)?shù)?11 個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物3 =Bac. 3)。·序列號(hào) 5. GTCCCGCAACGAGCG(15mer)正向·序列號(hào) 6. ATTGTAGCACGTGTGTAGCCC (2 Imer)反向(B4)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第1240位到1369位相當(dāng)?shù)?30 個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物4 =Bac. 4)?！ば蛄刑?hào) 7. GGGCTACACACGTGCTACAAT (2 Imer)正向·序列號(hào) 8. CCGGGAACGTATTCACC(17mer)反向。(1- 對(duì)所有的真菌的ISSrRNA基因共有的序列區(qū)域進(jìn)行選擇，設(shè)定1組來自其的正向引物和反向引物。具體而言，為以下含有全部或1/3以上引物堿基序列的引物。(Fl)真菌的ISSrRNA基因的引物組(真菌引物Fimgi)·序列號(hào) 9. GAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACG(28mer)正向·序列號(hào) 10. TAACTGCAACAACTTTAATATACGC(25mer)反向。(1-3)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因的引物，使用LightCycler Probe Design 2 軟件，選定得分最高的引物設(shè)計(jì)。具體而言，為以下引物。(Ml)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因的引物組(mecA引物mecA)·序列號(hào) 13. ATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTA(30mer)正向·序列號(hào) 14. CCAATAACTGCATCATCTTTATAGCC(26mer)反向。<組合組2>(2-1)從所有的細(xì)菌的16SrRNA基因共有的序列區(qū)域中選出10處，設(shè)定正向引物和反向引物。具體而言，為以下含有全部或1/3以上引物堿基序列的引物。
(B5)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第8位至345位相當(dāng)?shù)?38個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物5 =Bac. 5)?！ば蛄刑?hào) 15. AGAGTTTGATCATGGCTCAGOOmer)正向·序列號(hào) I6· CGTAGGAGTCTGGACCGT (18mer)反向(B6)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第336位到第534位相當(dāng)?shù)?99 個(gè)堿基的DNA的引物組(引物6 =Bac. 6)。·序列號(hào) 17. GACTCCTACGGGAGGCA(17mer)正向·序列號(hào) 18. TATTACCGCGGCTGCTG(17mer)反向(B7)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第519位至第805位相當(dāng)?shù)挠^7 個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物7 =Bac. 7)?！ば蛄刑?hào) I9· AGCAGCCGCGGTAATA (l6mer)正向·序列號(hào) 20. GGACTACCAGGGTATCTAATCCT (23mer)反向(B8)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第780到第960位相當(dāng)?shù)?81 個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物8 =Bac. 8)?！ば蛄刑?hào) 21. AACAGGATTAGATACCCTGGTAGOaner)正向
·序列號(hào) 22. AATTAAACCACATGCTCCACC (2 Imer)反向(B9)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第951位到第1070位相當(dāng)?shù)?120個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物9 =Bac. 9)?！ば蛄刑?hào) 23· TGGTTTAATTCGATGCAACGC (2 Imer)正向·序列號(hào) 24. GAGCTGACGACAGCCAT (17mer)反向(BlO)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第1084位到1192位相當(dāng)?shù)?109個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物10 =Bac. 10)。·序列號(hào) 25. TTGGGTTAAGTCCCGC(16mer)正向·序列號(hào) 26. CGTCATCCCCACCTTC(16mer)反向(B 11)擴(kuò)增與大腸桿菌(E. coli)的16SrRNA基因的第1220位到第1385位相當(dāng)?shù)?66個(gè)堿基的DNA的引物組(細(xì)菌引物11 =Bac. 11)?！ば蛄刑?hào) 27. GGCTACACACGTGCTACAAT (20mer)正向·序列號(hào) 28. CCGGGAACGTATTCACC(17mer)反向。(2-2)從真菌的ISSrRNA基因中共有的序列區(qū)域中選出7處，設(shè)定正向引物和反向引物。具體而言，為以下含有全部或1/3以上引物堿基序列的引物。(F2)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因(序列號(hào)16)的第149位到第 407位相當(dāng)?shù)?59個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物2 :Fungi2)·序列號(hào) 29. GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGC(26mer)正向·序列號(hào) 30. GGTAGCCGTTTCTCAGG (17mer)反向(F3)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因的第390位到第551位相當(dāng)?shù)?162個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物3 :Fungi3)·序列號(hào) 31. GCCTGAGAAACGGCTACCA(19mer)正向·序列號(hào) 32. CCTCCAATTGTTCCTCGTTAAG (22mer)反向
(F4)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因的第531位到第762位相當(dāng)?shù)?232個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物4 :Fungi4)·序列號(hào) 33. TTAACGAGGAACAATTGGAGGG (22mer)正向·序列號(hào) 34. GCCTGCTTTGAACACTCTAATTT (23mer)反向(F5)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因的第989位到第1134位相當(dāng)?shù)?146個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物5 =Fungi 5)·序列號(hào) 35.ATACCGTCGTAGTCTTAACCA Qlmer)正向·序列號(hào) 36. GTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCT (24mer)反向(F6)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因的第1260位到第1似8位相當(dāng)?shù)?69個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物6 :Fungi6)·序列號(hào) 37. CATGGCCGTTCTTAGTTGG(19mer)正向·序列號(hào) 38. GGGCATCACAGACCTGTT(18mer)反向(F7)擴(kuò)增與念珠菌(C. Albicans)的18SrRNA基因的第1414位到第1630位相當(dāng)?shù)?17個(gè)堿基的DNA的引物組(真菌引物7 :Fungi7)·序列號(hào) 39. AGGTCTGTGATGCCCTTAG(19mer)正向·序列號(hào) 40. CGGGCGGTGTGTACAAA(l7mer)反向(2-3)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因的引物，使用LightCycler Probe Design 2 軟件，選定得分最高的引物設(shè)計(jì)。具體而言，為以下引物。(M2)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因的引物組(mecA引物2 :mecA2)·序列號(hào) 43· CAAACTACGGTAACATTGATCGC (23mer)正向 序列號(hào) 44. ATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCQaner)反向本發(fā)明中，所謂Tm值，是PCR產(chǎn)物的50%與其互補(bǔ)鏈解離時(shí)的溫度。另外，以利用最近鄰分析法的Tm值計(jì)算式的“Tm值由堿基序列決定”的理論根據(jù)為基礎(chǔ)，能夠以各菌種的堿基序列的不同作為Tm值的組合的不同，應(yīng)用于鑒定起因菌。因此，“根據(jù)Tm值，排除測(cè)定誤差的影響”在準(zhǔn)確地鑒定上是最重要的。因此，采用以下方法排除測(cè)定誤差的影響。首先，由于Tm值在緩沖液的組成等不同的實(shí)驗(yàn)條件下變化，所以通過使用氯化鎂濃度固定的STOR Green I作為反應(yīng)用緩沖液，使得不產(chǎn)生因反應(yīng)液的組成引起的測(cè)定誤差。然后，由于實(shí)時(shí)PCR儀自身在每次試行時(shí)產(chǎn)生測(cè)定誤差，所以在設(shè)定作為對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)Tm 值的同時(shí)，將相同試行次數(shù)的各Tm值間的差異圖案用于判定?；蛘?，利用“‘與平均值的相對(duì)值’的組合近似的為檢測(cè)對(duì)象生物”的鑒定算法。本發(fā)明中，為了校正測(cè)定儀的試行間誤差，可以使用基準(zhǔn)Tm值。具體而言，使用一定濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的DNA作為模板，使用對(duì)細(xì)菌的16SrRNA基因的一個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的1個(gè)引物組，測(cè)定每次Tm值，校正每次試行的Tm值的偏移。即，如果為相同模板與相同引物的組合，則理論上每次的Tm值相同。但是，實(shí)際上所得的Tm測(cè)定值偏移時(shí)，由于其為試行間誤差，所以只進(jìn)行其偏移部分的校正即可。本發(fā)明的方法㈧及⑶的具體順序如下所示。⑴由樣品制備DNA。
(ii)使用之前舉出的細(xì)菌、耐抗生素基因、及真菌的引物組對(duì)所得的DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增后，同時(shí)測(cè)定各Tm值，得到細(xì)菌、耐抗生素基因、及真菌的Tm值的組合。(iii)判定是否為真菌。[上述(ii)的Tm值的組合中，首先通過使用能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的一個(gè)區(qū)域 多個(gè)區(qū)域的引物組對(duì)所得的真菌的特異性Tm值進(jìn)行解析，判定是否為真菌、或者判定真菌的種類。](iv)判定有無耐抗生素基因。[上述(ii)的Tm值的組合中，使用特異性地?cái)U(kuò)增呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等、隨著當(dāng)時(shí)的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因的引物組對(duì)所得的抗生素耐性菌固有的基因擴(kuò)增進(jìn)行解析，判定有無耐抗生素基因。](ν)鎖定為何種細(xì)菌。[上述(ii)的Tm值的組合中，使用能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組對(duì)所得的細(xì)菌特異性的Tm值的組合進(jìn)行解析，鑒定細(xì)菌的種屬。]細(xì)菌的鎖定，具體而言如下進(jìn)行關(guān)注細(xì)菌的一個(gè)Tm值(根據(jù)情況，首先用標(biāo)準(zhǔn) Tm值校正)，縮小范圍至與該Tm值為接近值的菌種，依次取Tm值的差進(jìn)行鎖定，或者直接取包括標(biāo)準(zhǔn)Tm值的各Tm值間的差，以上述差的組合作為指紋進(jìn)行鑒定。或者利用“ ‘與平均值的相對(duì)值”的組合近似的為檢測(cè)對(duì)象生物’，，的鑒定算法。另外，迅速、簡(jiǎn)便地鑒定檢測(cè)對(duì)象生物是否為細(xì)菌、真菌、或抗生素耐性的方法，存在下述方法，即，不利用Tm值，提取未知的微生物DNA，以其作為模板，使用下述物質(zhì)進(jìn)行 PCR,在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，確定目的尺寸的條帶，其中，所述物質(zhì)為[1]真菌的ISSrRNA基因的所有真菌共有的、且特異性地檢測(cè)真菌的1個(gè)引物、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品、[2]特異性地檢測(cè)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等、隨著當(dāng)時(shí)的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因的引物各1個(gè)、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品或以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品、和[3]細(xì)菌的16SrRNA基因的所有細(xì)菌共有的、且特異性地檢測(cè)細(xì)菌的1個(gè)引物、和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品。根據(jù)以上方法能夠得到以下效果。(1)以4 18個(gè)、優(yōu)選4 16個(gè)引物組為基礎(chǔ)實(shí)施實(shí)時(shí)PCR等基因擴(kuò)增，將所得的Tm值與數(shù)據(jù)庫對(duì)照，由此可以進(jìn)行在抗菌藥選擇上必要的起因菌菌種的鑒定、及確認(rèn)有無耐抗生素基因。(2)為血液樣品時(shí)，從DNA提取到Tm值的解析、以及鑒定所需要的時(shí)間約為2小時(shí)，能夠迅速診斷。(3)提取DNA的血液樣品的量為一定時(shí)，能夠定量菌量的相對(duì)量，能夠監(jiān)測(cè)給與抗菌藥后的治療效果。(4)通過分別使用以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品和本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，能夠基本完全避免非特異性擴(kuò)增等假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，真菌的鑒定中，優(yōu)選利用拓?fù)洚悩?gòu)酶II、線粒體DNA或26S核糖體RNA 的通用引物的組合得到Tm值的組合、并基于此進(jìn)行鑒定。
(定量或鑒定用組合)本發(fā)明能夠提供一種組合，所述組合至少使用下述物質(zhì)用于進(jìn)行樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定，所述物質(zhì)為用于擴(kuò)增由樣品制備的DNA的本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品、和用于擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)象生物的特異性的靶基因的引物。進(jìn)而，所述組合可以至少使用下述物質(zhì)構(gòu)成用于擴(kuò)增由樣品制備的DNA的本發(fā)明的耐熱性DNA聚合酶制品，用于擴(kuò)增由樣品制備的DNA的以細(xì)菌細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，禾口用于擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物。作為上述的組合的引物，可以利用之前舉出的引物(B)、(F)及(M)。(定量鑒定系統(tǒng))使用以下各裝置，能夠構(gòu)成用于利用上述方法的進(jìn)行樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物的定量或鑒定的系統(tǒng)。(1)擴(kuò)增裝置，用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，使用由樣品制備的DNA、用于擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和耐熱性DNA聚合酶制品。(2)定量裝置，用于對(duì)擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量。(3)計(jì)算裝置，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果計(jì)算樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的量。(4)數(shù)據(jù)庫，用于根據(jù)靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果計(jì)算樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的量。作為擴(kuò)增裝置及定量裝置，可以優(yōu)選利用PCR裝置、特別是其中的實(shí)時(shí)PCR裝置。 另外，作為計(jì)算裝置，可以利用基于下述程序進(jìn)行工作的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等，所述程序預(yù)先設(shè)定為利用上述數(shù)據(jù)庫、進(jìn)行檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定。以下給出用于進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定的系統(tǒng)的一個(gè)例子。 該系統(tǒng)可以具有以下的各要素(單位)。(I)PCR反應(yīng)裝置(2)用于進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及輸出數(shù)據(jù)處理后的結(jié)果的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(3)寫入數(shù)據(jù)處理所必要的程序的數(shù)據(jù)處理用軟件(4)數(shù)據(jù)處理中必要的數(shù)據(jù)庫(5)具有控制PCR反應(yīng)裝置的程序的控制機(jī)構(gòu)(6)顯示數(shù)據(jù)處理結(jié)果的顯示裝置上述裝置的關(guān)系的例子之一示于圖12。該系統(tǒng)具有PCR反應(yīng)裝置1、計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 2、數(shù)據(jù)處理部3、數(shù)據(jù)處理用程序(軟件)6、數(shù)據(jù)處理中必要的數(shù)據(jù)庫4、控制PCR反應(yīng)裝置的控制機(jī)構(gòu)5a及恥及顯示裝置7。需要說明的是，上述要素可以以其中2個(gè)以上一體化的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，各單位間的信息的傳送通過信號(hào)Sl S7進(jìn)行。定量裝置可以至少由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2構(gòu)成。利用PCR反應(yīng)裝置進(jìn)行用于定量及/或鑒定上述檢測(cè)對(duì)象生物的PCR反應(yīng)?？梢酝ㄟ^控制機(jī)構(gòu)5對(duì)其進(jìn)行控制。作為控制機(jī)構(gòu)5中的控制項(xiàng)目的例子之一可以舉出以下的項(xiàng)目。
A)擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)的條件設(shè)定B)用于擴(kuò)增所用的循環(huán)數(shù)和溫度控制的條件設(shè)定C)用于測(cè)定Tm值的條件設(shè)定D)用于結(jié)束反應(yīng)的條件設(shè)定E)用于在顯示裝置上不顯示靶外基因的擴(kuò)增的條件設(shè)定根據(jù)目的可以從上述的條件設(shè)定中選擇設(shè)定控制項(xiàng)目。條件設(shè)定和其實(shí)行可以根據(jù)預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行。該程序可以預(yù)先記錄在控制機(jī)構(gòu)如或恥中的介質(zhì)中。或者，該程序也可以預(yù)先儲(chǔ)存在另外準(zhǔn)備的可移動(dòng)(攜帶)的介質(zhì)中，或收載在介質(zhì)中使其可通過因特網(wǎng)散布，使用時(shí)連接到控制機(jī)構(gòu)5&或恥上進(jìn)行利用。利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2中設(shè)置的、或另外準(zhǔn)備的數(shù)據(jù)處理部3中的數(shù)據(jù)處理結(jié)果進(jìn)行PCR反應(yīng)裝置的控制時(shí)，來自數(shù)據(jù)處理部3 的數(shù)據(jù)處理的結(jié)果被送到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2中，基于其結(jié)果將來自控制機(jī)構(gòu)恥的用于控制PCR 反應(yīng)裝置的信號(hào)輸送到PCR反應(yīng)裝置內(nèi)的控制機(jī)構(gòu)fe中，實(shí)行控制。根據(jù)PCR反應(yīng)的目的， 僅PCR反應(yīng)裝置側(cè)的控制充分時(shí)，只利用控制機(jī)構(gòu)fe進(jìn)行PCR反應(yīng)的控制。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2以可根據(jù)目的對(duì)來自各單位的信號(hào)進(jìn)行處理的方式進(jìn)行程序化。數(shù)據(jù)處理部2中，例如可以進(jìn)行以下處理。i)PCR反應(yīng)裝置中得到的PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果(例如關(guān)于熒光強(qiáng)度的信號(hào))的處理ii)用于使用PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定的演算處理iii)用于控制PCR反應(yīng)裝置中的PCR反應(yīng)條件的信號(hào)輸出處理iv)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果(包括經(jīng)時(shí)監(jiān)測(cè))、檢測(cè)對(duì)象生物的定量及/或鑒定的結(jié)果在顯示裝置上顯示進(jìn)行指令的處理。上述處理基于根據(jù)目的數(shù)據(jù)處理而設(shè)定的數(shù)據(jù)處理用程序6實(shí)行。進(jìn)而，數(shù)據(jù)處理中必需數(shù)據(jù)庫時(shí)，利用數(shù)據(jù)庫4中收載的信息。例如，可以預(yù)先將下述數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)庫化進(jìn)行收載，所述數(shù)據(jù)為在處理通過利用PCR的擴(kuò)增反應(yīng)得到的信號(hào)對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定時(shí)使用用作基準(zhǔn)的已知的生物所得的數(shù)據(jù)、和如上所述在利用Tm值對(duì)測(cè)定對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定時(shí)從已知生物得到的Tm值(包括由多個(gè)Tm值進(jìn)行定量鑒定時(shí)的Tm值的組合)等。數(shù)據(jù)處理用程序6及數(shù)據(jù)庫4可以事先收載在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2內(nèi)的介質(zhì)中?；蛘?， 可以將它們中的至少1個(gè)事先儲(chǔ)存在另外準(zhǔn)備的可移動(dòng)(攜帶)的介質(zhì)中、或事先收載在介質(zhì)中使其在可利用因特網(wǎng)散布，使用時(shí)連接到數(shù)據(jù)處理部3上進(jìn)行利用。實(shí)施例以下，給出參考例、實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。另外，只要沒有特別記載，操作步驟基于產(chǎn)品試劑盒中附帶的說明書進(jìn)行。(實(shí)施例1-1)(I)DNA 的合成由GeMcript公司合成了來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的全DNA序列。 此時(shí)，將密碼子序列在酵母宿主、S. cerevisiae中進(jìn)行最適化。合成的DNA被插入到由 GenScript公司提供的質(zhì)粒pUC57中，得到載體pUC_TA01。編碼耐熱性DNA聚合酶的基因以5’末端序列中存在Hind III限制酶位點(diǎn)，3’末端序列中存在EcoR I限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。
(2)來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶表達(dá)用載體的構(gòu)筑將合成的編碼來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的基因插入到質(zhì)粒 pYES2(inVitr0gen公司)中，構(gòu)筑載體pYES-TAOl。編碼耐熱性DNA聚合酶的基因，用限制酶Hind III、EcoR I (TaKaRa Bio)消化pUC-TAOl，用瓊脂糖凝膠(Wako)進(jìn)行電泳， 用QIAquick凝膠提取試劑盒^jiagen)回收編碼耐熱性DNA聚合酶的基因。質(zhì)粒pYES2用 EcoR I ,HindIII (TaKaRa Bio)消化，用 DNA 連接試劑盒 Ver. 2. 1 (TaKaRa Bio)連接編碼耐熱性DNA聚合酶的基因和pYES2。(3) S. cerevisiae 的轉(zhuǎn)化將所得的載體pYES-TAOl導(dǎo)入到酵母(Saccharomyces cerevisiae X2180株)中。 宿主如果為尿嘧啶缺陷株，則也可以使用其他的酵母。轉(zhuǎn)化使用hstTrack -酵母轉(zhuǎn)化試齊Ll盒(Geno Technology 公司)。(4)利用S. cerevisiae生產(chǎn)來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶將得到的轉(zhuǎn)化體用IOOml SD培養(yǎng)基(0. 67%細(xì)菌用酵母氮源基礎(chǔ)，2%半乳糖、) 進(jìn)行^°C、72小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。將它們?cè)?000rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，將其懸濁在破碎用緩沖液(50mM Tris-HCl pH7. 5、50mM KCl)中，使用0. 5mm玻璃珠破碎菌體后， 在12000rpm下進(jìn)行30分鐘離心分離，得到酵母破碎液上清液及沉淀物，作為細(xì)胞提取物。(5)利用熱處理的耐熱性DNA聚合酶增溶條件的研究對(duì)細(xì)胞提取物，進(jìn)行耐熱性DNA聚合酶的利用熱處理的增溶條件的研究。圖2為對(duì)將酵母破碎沉淀物懸濁在等量的破碎用緩沖液中所得的懸濁液在450C、50°C、55°C、60°C、 65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、100°C下進(jìn)行熱處理，并在 12000rpm 下、4°C下離心分離30分鐘后，將所得的上清液進(jìn)行SDS-PAGE所得的圖。在50°C以上的熱處理中，檢測(cè)到作為目的蛋白質(zhì)的耐熱性DNA聚合酶的條帶，通過65°C到70°C下的熱處理，來自宿主的夾雜蛋白質(zhì)混入量減少。通過進(jìn)行50°C以上的熱處理，耐熱性DNA聚合酶被增溶，并且具有耐熱性DNA聚合酶活性。(6) DNA聚合酶活性(6-1) λ DNA內(nèi)區(qū)域的擴(kuò)增以λ DNA(NIPPON GENE)作為模板，進(jìn)行活性檢測(cè)。配制反應(yīng)液使其組成為IOmM Tris-HCl (ρΗ8. 3)、1· 5mM MgCl2、50mMKCl、200 μ M dNTPs，添加引物，使序列號(hào) 83、84 分別變?yōu)?0. 4 μ Μ。序列號(hào) 83 gatgagttcg tgtccgtaca act序列號(hào) 84 ggttatcgaa atcagccaca gcgcc配制耐熱性DNA聚合酶制品的稀釋系列，使上述離心分離上清液變?yōu)?/4、1/8、 1/16、1/32、1/64，然后添加1μ 1所得產(chǎn)物和0. 2 μ g λ DNA，用超純水將它們的總量調(diào)至 50 μ 1。以下述程序?qū)嵤㏄CR程序94°C 1分鐘、50°C 30秒、72°C 1分鐘，將其重復(fù)30次。 各PCR反應(yīng)溶液用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使擴(kuò)增產(chǎn)物可視化。(6-2)耐熱性DNA聚合酶活性的定義根據(jù) Procedures in nucleic acid reseach (Richardson, C. C. (1966) DNA polymerase from Escherichia coli, pp. 263-276 In G. L. Cantoni and D. R. Davies (ed.))的方法確定所得的耐熱性DNA聚合酶的單位。使用活化鮭精子DNA作為模板/引物，在活性測(cè)定用反應(yīng)液(含有25mM TAPS (pH9. 3)、50mM KCl、2mM MgCl2UmM β-巰基乙醇、各 200μΜ 的 dATP，dGTP, dTTPUOO μ Μ[ α -32P] · dCTP (0· 05-0· ICi/mmol)、 0. 25mg/ml活化鮭精子DNA，總量50 μ 1)中，在74°C下經(jīng)30分鐘將IOnmol的全核苷酸摻入酸不溶性沉淀物中的活性作為IU。(6-3) PCR 的檢測(cè)限圖3為以大腸桿菌DNA作為模板、求出PCR中的檢測(cè)限的圖。從IOOng到IOfg檢測(cè)到PCR擴(kuò)增條帶，從IOfg到Ifg之間未檢測(cè)到擴(kuò)增條帶。用DNA提取試劑盒!^stPure DNA Kit (TaKaRa公司制)從大腸桿菌JM109 (ToYoBo公司制)中提取、純化大腸桿菌DNA。 配制反應(yīng)液，使其組成為 IOmM Tris-HCl (pH8. 3)、1.5mM MgCl2,50mM KCl、200yM dNTPs，添加引物，使序列號(hào)85、86分別變?yōu)?. 4μΜ。序列號(hào)85 agcagccgcg gtaat序列號(hào)86 ggactaccag ggtatctaat cct添加模板，從IOOng到Ifg按照分別相差KT1制成大腸桿菌DNA稀釋系列。添加 IU耐熱性DNA聚合酶制品，用超純水調(diào)制，使其總量為20μ 1。以下述程序?qū)嵤㏄CR程序 940C 1分鐘、50°C 30秒、72°C 30分鐘，將其重復(fù)60次。將各PCR反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使擴(kuò)增產(chǎn)物可視化。(7)來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶表達(dá)用載體的構(gòu)筑將編碼來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的基因插入到質(zhì)粒pPIC ZA (invitrogen公司)中，構(gòu)筑載體pPIC-TAOl。使用pYES-TAOl作為模板，使用KOD Plus (ToYoBo)利用PCR進(jìn)行編碼耐熱性DNA聚合酶的基因的擴(kuò)增。PCR中使用的引物(序列號(hào)87、88)以5’末端序列存在EcoR I限制酶位點(diǎn)、3’末端序列中存在Not I限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。序列號(hào)87 cccgaattca tgagggggat gttgccattg序列號(hào) 88 aaagcggccg ctcattcctt tgcggataac以下述程序?qū)嵤㏄CR程序，94°C加熱2分鐘后，重復(fù)30次下述程序94°C 15秒、 560C 30秒、68°C 2分30秒。然后用1 %瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用QIAquick凝膠提取試劑盒 ^!iagen)回收 PCR 片段。PCR擴(kuò)增物、pPICZ A 都用 EcoR I ,Not I (TaKaRaBio) 進(jìn)行消化，用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1 (TaKaRa Bio)連接PCR擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pPICZ A。(8) Ε. COIi的轉(zhuǎn)化、載體提取將連接的載體導(dǎo)入到E. coli感受態(tài)細(xì)胞DH5 α (ToYoBo)中。為了使大腸桿菌轉(zhuǎn)化體具有博來霉素作為選擇性標(biāo)記，使其在SOC (ToYoBo)培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)后，接種到含有25 μ 1/ml博來霉素(Invitrogen)的Lenox(Difco)瓊脂培養(yǎng)基中，在37°C下靜置培養(yǎng) 16小時(shí)。由瓊脂板接種大腸桿菌菌落，進(jìn)行直接菌落PCR，解譯堿基序列，可確認(rèn)準(zhǔn)確地插入了耐熱性DNA聚合酶基因后，得到載體pPIC-TAO 1。(9)Ρ· pastoris 的轉(zhuǎn)化將載體pYES-TAOl 導(dǎo)入到酵母(Pichia pastoris GSl 15 株)中。使用 hstTrack -酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Geno Technology公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為了使酵母轉(zhuǎn)化體具有博來霉素作為選擇性標(biāo)記，在YPD培養(yǎng)基(Difco)中培養(yǎng)3小時(shí)使其恢復(fù)后，接種到含有 100 μ g/ml博來霉素的YPDS (Difco)瓊脂板上。然后，瓊脂板在下靜置培養(yǎng)3天。
(10)轉(zhuǎn)化體的選拔為了獲得耐熱性DNA聚合酶高生產(chǎn)株，由轉(zhuǎn)化的瓊脂板接種菌落，在博來霉素含有濃度以500μ g/ml 2000μ g/ml的順序上升的YPDS(Difco)瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)，選拔插入基因的多拷貝轉(zhuǎn)化體。瓊脂板在博來霉素濃度為500 μ g/ml、1000 μ g/ml、2000 μ g/ ml下分3階段進(jìn)行培養(yǎng)，均在下靜置培養(yǎng)3天。將博來霉素濃度為2000 μ g/ml的 YPDS (Difco)瓊脂板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體用于下述的耐熱性DNA聚合酶生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。(11)來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的生產(chǎn)將轉(zhuǎn)化體接種到100ml BMGY培養(yǎng)基中，在下振蕩培養(yǎng)1天，增加菌體量。然后為了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，添加0. 5%甲醇，在下培養(yǎng)3天。將它們?cè)?000rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，懸濁在破碎用緩沖液(50mM Tris-HCl pH7. 5、50mM KCl)中，使用 0. 5mm玻璃珠破碎菌體。然后在70°C下進(jìn)行60分鐘的熱處理，在12000rpm下離心分離30 分鐘，得到含有來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的上清液。(12)來自P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶表達(dá)用載體的構(gòu)筑將編碼來自P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶的基因插入到質(zhì)粒pYES2中，構(gòu)筑載體pYES-PFOl。以P. furiosus基因組DNA (ATCC43587D-5)作為模板利用PCR合成編碼耐熱性DNA聚合酶的基因。PCR中使用的引物(序列號(hào)89、90)以5’末端序列中存在Kpn I限制酶位點(diǎn)，3’末端序列中存在Not I限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用KOD Plus進(jìn)行PCR。序列號(hào) 89 gggggtacca tgattttaga tgtggattac序列號(hào) 90 cccgcggccg cctaggattt tttaatg按照下述程序?qū)嵤㏄CR程序，94°C加熱2分鐘后，重復(fù)30次下述程序94°C 15秒、 560C 30秒、68°C 2分30秒。然后用1 %瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，利用QIAquick凝膠提取試劑盒回收PCR片段。PCR擴(kuò)增物、pYES2都用Kpn I、Not I進(jìn)行消化，利用DNA 連接試劑盒Ver. 2. 1連接PCR擴(kuò)增片段和pYES2。將連接的載體導(dǎo)入到E. coli感受態(tài)細(xì)胞JM 109 (ToYoBo)中。將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種到含有50μ 1/ml氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基中，在37°C靜置培養(yǎng)16小時(shí)。由瓊脂板接種大腸桿菌菌落，進(jìn)行直接菌落PCR，解譯堿基序列，確認(rèn)準(zhǔn)確地插入耐熱性DNA聚合酶基因，得到載體PYES-PF01。(13)來自Τ. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶表達(dá)用載體的構(gòu)筑將編碼來自T. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶的基因插入到質(zhì)粒pYES2中，構(gòu)筑載體pYES-TGOl。以Τ. gorgonarius的基因組DNA (ATCC 700654D)作為模板利用PCR合成編碼耐熱性DNA聚合酶的基因。PCR中使用的引物(序列號(hào)91、92)以5’末端序列中存在 Kpn I限制酶位點(diǎn)，3’末端序列中存在Not I限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，使用KOD Plus 進(jìn)行PCR。序列號(hào)91 gggggtacca tgatcctcga tacagac序列號(hào) 92 cccgcggccg ctcatgtctt aggttttag按照以下的程序?qū)嵤㏄CR程序，94°C下加熱2分鐘后，重復(fù)30次下述程序94°C 15 秒、60°C 30秒、68°C 2分30秒。然后用1 %瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，利用QIAquick 凝膠提取試劑盒回收PCR片段。PCR擴(kuò)增物、pYES2質(zhì)粒都用Kpn KNot I進(jìn)行消化，利用DNA連接試劑盒Ver. 2. 1連接PCR擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pYES2。
將連接的載體轉(zhuǎn)化到E. coli感受態(tài)細(xì)胞JM 109中。將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種到含有50 μ/ml氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基中。然后，將瓊脂板在37°C下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。由瓊脂板接種大腸桿菌菌落，進(jìn)行直接菌落PCR，解譯堿基序列，確認(rèn)準(zhǔn)確地插入耐熱性DNA 聚合酶基因，得到載體pYES-TGOl。(14)酵母的轉(zhuǎn)化將上述得到的載體pYES-PFOl、pYES-TGOl導(dǎo)入到酵母(Saccharomyces CerevisiaeX2180株)中。使用i^astl^rack -酵母轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(15)來自 P. furiosus、T. gorgonarius 的耐熱性 DNA 聚合酶的生產(chǎn)將所得的轉(zhuǎn)化體用IOOml SD培養(yǎng)基(0. 67%細(xì)菌用酵母氮源基礎(chǔ)、2%半乳糖、) 在下振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。將它們?cè)?000rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，懸濁在破碎用緩沖液(50mM Tris-HCl pH7. 5、50mM KCl)中，使用0. 5mm玻璃珠破碎菌體后進(jìn)行離心分離，得到酵母破碎液沉淀。在該沉淀中添加為沉淀濕重量2倍量的破碎用緩沖液，懸濁，在 70°C下進(jìn)行60分鐘的熱處理，在12000rpm下離心分離30分鐘，得到含有耐熱性DNA聚合酶的上清液。(16)利用PCR檢查非特異性核酸混入圖4為瓊脂糖電泳的照片，表示使用上述得到的各耐熱性DNA聚合酶制品和 TaKaRa Taq(TaKaRa)、AmpliTaq Gold LD(ABI)調(diào)查是否混入非特異的核酸的實(shí)例。泳道 1、4、7、10、13、16為利用40循環(huán)、泳道2、5、8、11、14、17為利用60循環(huán)在不添加模板的情況下進(jìn)行PCR。另外，泳道3、6、9、12、15、18是以1 μ g大腸桿菌作為模板通過30循環(huán)進(jìn)行 PCR0引物使用可以使259bp的大腸桿菌16SrRNA基因擴(kuò)增的序列號(hào)85、86，溫度條件、PCR 溶液組成利用與(6-3)同樣的操作進(jìn)行。由此，盡管未添加模板，但TaKaRa Taq通過40循環(huán)、AmpliI1aq Gold LD通過60循環(huán)檢測(cè)到來自細(xì)菌16SrRNA的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，利用本專利的制造方法生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶盡管利用40、60循環(huán)的PCR也未檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，確認(rèn)了即使未進(jìn)行復(fù)雜的純化步驟也未發(fā)現(xiàn)混入非特異性核酸，可以實(shí)施PCR。(17)利用實(shí)時(shí)PCR解析擴(kuò)增曲線、熔解曲線(非特異性核酸混入的調(diào)查)為了調(diào)查上述得到的耐熱性DNA聚合酶制品的非特異性核酸混入，使用實(shí)時(shí)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增曲線、熔解曲線的解析。圖5㈧及圖5(B)為表示解析擴(kuò)增曲線的圖，圖6(A)及圖6(B)為表示解析熔解曲線的圖。另外，圖5(A)及圖6(A)為使用AmpliTaq Gold LD實(shí)施解析的圖，圖5(B)及圖6(B)為使用以S. cerevisiae為宿主生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品實(shí)施解析的圖。實(shí)線為添加大腸桿菌作為模板，虛線為未添加模板。作為實(shí)時(shí)PCR試劑， 相對(duì)于 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche 公司)的 Ib 管，加入 10μ1的超純水，成為XlOBuffer。該管內(nèi)除了含有最適合于Taq DNA聚合酶的緩沖試劑之外，還含有dNTPs和SYBR Green I。除此之外，添加1. 5mM MgCl2、各0. 4μ M引物(序列號(hào)85、86)、1 μ g大腸桿菌作為模板、1單位耐熱性DNA聚合酶制品，用超純水調(diào)至總量為 20μ 1，利用熱啟動(dòng)法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(60循環(huán))。AmpliTaqGold LD中在32循環(huán)左右擴(kuò)增曲線開始上升，熔解曲線中在添加、未添加模板的情況下均在相同程度的位置出峰，能夠確認(rèn)混入非特異性核酸。相對(duì)于此，利用本專利的制造方法制造的耐熱性DNA聚合酶，在未添加模板時(shí)擴(kuò)增曲線、熔解曲線均未見。使用真核細(xì)胞作為宿主生產(chǎn)的耐熱性DNA聚合酶制品中未確認(rèn)到存在由非特異的核酸混入產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用細(xì)菌作為宿主生產(chǎn)的、且為了使細(xì)菌DNA的污染被抑制到最小而進(jìn)行了純化的耐熱性DNA聚合酶制品，確認(rèn)到由非特異性核酸的混入產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)該結(jié)果可以認(rèn)為在具有大氣和水環(huán)境中存在的細(xì)菌的混入等多種非特異性核酸的混入的可能性中，其主要要因是耐熱性DNA聚合酶的生產(chǎn)過程中來自宿主的DNA對(duì)耐熱性DNA聚合酶制品的混入。(18)載體 pYES-PFOl 的誘變對(duì)編碼來自P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶的3’ -5’核酸外切酶的基因進(jìn)行誘變。即，對(duì)DNA聚合酶的3，-5，核酸外切酶進(jìn)行改變，調(diào)節(jié)活性(Kong等(1993)、journal of biological chemistry、vol.沈8、1965-1975)。具體而言，使用誘變中使用的引物(序列號(hào)61、62)、作為模板的載體pYES2-PF01、K0D Plus進(jìn)行PCR。序列號(hào)61 GATTCTTGCCTTCGCGATCGCAACCCTCTATCACGAAGG序列號(hào)62 CCTTCGTGATAGAGGGTTGCGATCGCGAAGGCAAGAATC按照以下程序?qū)嵤㏄CR程序，94°C加熱2分鐘后，重復(fù)15次下述程序94°C 15秒、 560C 30秒、68°C 7秒。反應(yīng)后，利用限制酶Dpnl消化PCR溶液中的模板，導(dǎo)入到E. coli感受態(tài)細(xì)胞JM109中。將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種到含有50 μ 1/ml氨芐西林的LB瓊脂培養(yǎng)基中， 在37°C下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。由瓊脂板接種大腸桿菌菌落，解譯堿基序列，確認(rèn)在目的位置進(jìn)行了誘變，得到載體PYES-PF-M01。另外，與實(shí)施例(14)、(15)同樣地進(jìn)行轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)，得到來自P. furiosus的突變耐熱性DNA聚合酶制品。(19)載體 pYES-TGOl 的誘變對(duì)編碼來自T. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶的3’ -5’核酸外切酶的基因進(jìn)行誘變。利用與(18)同樣的方法使用誘變中使用的引物(序列號(hào)63、64)、使用載體 PYES2-TG01作為模板進(jìn)行誘變。序列號(hào)63 GATGCTCGCCTTCGCGATCGCAACGCTCTATCACGAGGGCG序列號(hào)64 CGCCCTCGTGATAGAGCGTTGCGATCGCGAAGGCGAGCATC解譯堿基序列，確認(rèn)在目的位置進(jìn)行了誘變，得到載體pYES-TG-MOl。另外，與實(shí)施例(14)、(15)同樣地進(jìn)行轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)，得到來自T. gorgonarius的突變耐熱性DNA聚合酶制
P
BFI ο(20)使用宿主Tobacco_BY2的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶的生產(chǎn)(20-1)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入用載體的構(gòu)筑作為用于將轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入到宿主細(xì)胞(T0kiCC0BY2細(xì)胞)中的載體(以下稱作轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入用載體)，使用Ti質(zhì)粒pER8 (-Stu) (Dohi, K. ， Nishikiori, M. ， Tamai, A. ， Ishikawa, M. ， Meshi, T. ， Mori, Τ. (2006)Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured cells. Archives of Virologyl51，1075-1084)。pER8 (-Stu)如下構(gòu)筑在通常的啟動(dòng)子 PG10-90 的下游連接對(duì)含有雌激素受體的融合轉(zhuǎn)錄因子LexA-VP16-hER進(jìn)行編碼的基因、終止子 TE9，進(jìn)而插入作為耐藥性標(biāo)記物的耐潮霉素基因(Hygr)。(20-2)蛋白質(zhì)表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入用載體的構(gòu)筑使用ToMV突變體，該ToMV突變體是以編碼來自T. aquaticus的DNA聚合酶的基因(序列號(hào)65)取代編碼ToMV的外被蛋白質(zhì)的基因得到的。序列號(hào)65
ATGAGGGGGATGTTGCCATTGTTTGAACCTAAAGGGAGGGTTTTACTCGTGGATGGCCATCACCTTGCTTATCGTACTTTCCACGCTCTCAAAGGTTTAACAACCTCTAGGGGAGAGCCAGTTCAAGCTGTGTACGGGTTTGCAAAGTCACTCCTTAAAGCCTTGAAGGAGGACGGTGATGCCGTTATCGTGGTATTCGATGCTAAAGCACCAAGTTTTAGACACGAGGCTTACGGAGGCTATAAGGCTGGACGTGCACCAACTCCCGAGGATTTCCCAAGACAACTCGCCCTGATAAAGGAGTTGGTTGACCTACTTGGATTGGCTAGGTTAGAAGTTCCCGGTTACGAAGCTGACGACGTTTTGGCCTCACTTGCTAAGAAAGCAGAAAAGGAGGGCTACGAAGTTCGTATACTCACAGCCGATAAAGACTTGTATCAACTGTTATCTGATAGGATTCATGTGCTTCACCCCGAAGGGTACCTTATCACCCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGGCTCAGACCTGACCAGTGGGCTGATTACCGTGCACTCACCGGTGACGAGAGTGACAATCTTCCTGGCGTGAAAGGAATAGGTGAAAAGACAGCTAGAAAATTGCTAGAAGAGTGGGGGTCCCTCGAGGCACTTTTGAAGAACCTTGATAGGTTAAAACCAGCTATTAGAGAAAAGATACTGGCCCATATGGATGACTTGAAACTATCATGGGACTTAGCTAAAGTCAGAACCGATTTACCTTTGGAAGTGGATTTTGCTAAGAGAAGGGAACCAGATAGAGAGAGGCTTAGAGCATTCTTGGAGCGTCTGGAATTTGGATCTTTACTCCACGAGTTCGGTTTGCTTGAGTCTCCCAAGGCACTGGAAGAGGCACCATGGCCTCCACCTGAAGGCGCTTTTGTTGGGTTCGTTCTCAGTAGGAAGGAACCTATGTGGGCAGACTTGCTCGCCCTAGCAGCTGCAAGAGGGGGAAGAGTGCATAGGGCTCCCGAACCTTATAAGGCACTCAGAGATCTTAAGGAGGCTAGGGGCCTCTTGGCAAAGGACCTATCCGTGCTTGCACTCAGGGAAGGATTGGGACTCCCACCCGGTGATGACCCTATGTTATTGGCTTACTTGCTTGACCCATCCAATACCACACCCGAGGGAGTTGCCCGTAGGTATGGGGGCGAGTGGACTGAGGAAGCTGGTGAGAGGGCCGCATTGAGTGAGAGGCTATTTGCCAACTTATGGGGGAGGTTGGAGGGGGAGGAACGTCTGCTATGGCTTTACAGAGAGGTGGAGCGTCCCTTGAGTGCTGTATTAGCTCACATGGAAGCTACAGGCGTCCGTCTAGATGTTGCTTACTTAAGGGCTCTAAGTTTGGAAGTTGCAGAAGAGATCGCCAGATTAGAAGCTGAAGTTTTCAGGTTAGCAGGACACCCTTTTAATCTCAATAGTAGGGACCAACTCGAACGTGTGTTATTTGATGAACTGGGCCTCCCCGCTATAGGGAAAACCGAGAAAACAGGGAAAAGGTCCACATCTGCAGCTGTATTGGAAGCCCTTAGAGAAGCACATCCTATTGTGGAGAAAATACTACAGTACAGGGAGCTAACCAAATTAAAGAGTACCTACATAGATCCATTGCCTGATCTTATTCACCCAAGGACCGGAAGGCTTCACACCCGTTTCAATCAAACCGCAACAGCTACTGGGAGGTTATCATCTTCCGACCCTAACTTGCAAAATATACCTGTTCGTACCCCACTCGGACAGAGAATACGTAGAGCTTTCATTGCCGAAGAGGGATGGCTCTTGGTTGCTTTGGATTATAGTCAGATTGAACTTAGAGTTCTAGCACACCTTAGTGGCGACGAAAACCTCATCAGGGTGTTTCAGGAGGGGAGAGATATACACACCGAAACTGCTTCATGGATGTTTGGGGTGCCCAGGGAAGCCGTAGACCCCCTCATGAGAAGGGCTGCTAAAACAATTAATTTCGGCGTGTTGTACGGAATGTCCGCTCACAGGCTATCACAAGAGTTGGCAATCCCCTATGAAGAGGCTCAAGCCTTCATTGAGAGGTATTTTCAGTCCTTTCCAAAGGTGCGTGCTTGGATAGAGAAAACTTTAGAGGAAGGTAGAAGGAGAGGGTATGTGGAAACTCTATTTGGCAGACGTAGGTACGTTCCTGACCTCGAAGCTAGAGTTAAGTCCGTCAGAGAGGCAGCTGAACGTATGGCATTCAATATGCCTGTTCAAGGAACAGCTGCAGACTTAATGAAATTAGCTATGGTGAAGTTGTTCCCAAGGTTAGAGGAAATGGGTGCAAGAATGCTCCTACAGGTCCATGATGAGCTAGTGTTGGAAGCACCTAAAGAGAGGGCAGAGGCAGTAGCCAGGTTGGCAAAGGAGGTTATGGAAGGGGTGTATCCACTTGCTGTCCCCTTGGAGGTGGAAGTCGGGATCGGTGAGGACTGGTTATCCGCAAAGGAATGAGCTCACTAGT由GeMcript公司合成了來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的全基因序列。 此時(shí)，將密碼子序列在Tobacco BY2細(xì)胞中最優(yōu)化。作為轉(zhuǎn)化用載體，使用具有可用雌激素進(jìn)行轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的啟動(dòng)子0 εχΑ-46的Ti質(zhì)粒，在0 εχΑ-46的下游連接ToMV突變體的cDNA，進(jìn)而構(gòu)筑用于將在其3’末端插入了煙草環(huán)斑衛(wèi)星病毒的核酶序列S-Rz、35S終止子(35ST) 的蛋白質(zhì)表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入到宿主細(xì)胞(Tobacco BY2細(xì)胞)中的載體pBICER8_ToMV/ Taq-SRz。(20-3)第一轉(zhuǎn)化步驟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用DNA片段向宿主細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入利用農(nóng)桿菌法將轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)用DNA片段導(dǎo)入用載體pER8 (Itu)導(dǎo)入到TcAacco BY2細(xì)胞中。首先利用電穿孔法將pER8 (-Stu)導(dǎo)入到Agrobacterium tumefacince LBA4404系統(tǒng)中。使其在含有壯觀霉素(50mg/l)的AB蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。然后與 Tobacco BY2細(xì)胞混合，移到培養(yǎng)皿中，在下在暗處靜置42 48小時(shí)，轉(zhuǎn)化TcAacco BY2細(xì)胞。用TcAacco BY2細(xì)胞用培養(yǎng)基清洗后，擴(kuò)散到含有羧芐西林(100mg/l)及潮霉素 (20mg/l)的TcAaccoBY2細(xì)胞用固體培養(yǎng)基中，使轉(zhuǎn)化Tobacco BY2細(xì)胞增殖。(20-4)選拔步驟轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)轉(zhuǎn)化體的選拔在轉(zhuǎn)化TcAacco BY2細(xì)胞中，根據(jù)Northern雜交法的結(jié)果，選拔轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量高的細(xì)胞線。此處所謂“細(xì)胞線”，是指通過使轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖而形成的各個(gè)菌落。(20-5)第二轉(zhuǎn)化步驟蛋白質(zhì)表達(dá)用DNA片段的導(dǎo)入利用農(nóng)桿菌法在上述得到的轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)Tobacco BY2細(xì)胞線中導(dǎo)入病毒載體 (pBICER8-ToMV/Taq-SRz)，得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。(20-6)Tobacco BY2細(xì)胞的培養(yǎng)、蛋白質(zhì)表達(dá)、提取將上述得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞保持在15ml液體培養(yǎng)基中，每7天以1/200的量傳代。另外，添加以1/50量傳代、且傳代培養(yǎng)后經(jīng)2天預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，使雌激素的終濃度為0. OlmM, 再培養(yǎng)2天。將其在5000rpm下離心分離10分鐘，回收轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用液氮冷凍后，使用乳缽破碎細(xì)胞。在其中加入等量的緩沖液(50mM Tris-HCl pH7. 5、50mM KCl)懸濁，在70°C下進(jìn)行60分鐘的熱處理，在12000rpm下離心分離30分鐘，得到含有來自T. aquatics的耐熱性 DNA聚合酶的上清液。(21)使用宿主A. oryzae的來自T. aqaticus的耐熱性DNA聚合酶的表達(dá)(21-1) DNA 的合成由GeMcript公司合成了來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶的全DNA序列。 (序列號(hào)41)此時(shí)，密碼子序列與A. oryzae最適化。編碼耐熱性DNA聚合酶的基因以5’末端序列存在Riie I限制酶位點(diǎn)、3’末端序列存在Xmal限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。序列號(hào)41ATGAGAGGCATGCTGCCACTGTTCGAGCCAAAGGGAAGGGTGCTGCTGGTGGACGGACACCATCTGGCCTACAGAACTTTTCACGCTCTGAAGGGACTGACCACATCACGGGGGGAGCCAGTGCAGGCTGTGTATGGATTCGCTAAAAGCCTGCTGAAGGCCCTGAAAGAGGACGGAGATGCTGTGATCGTGGTGTTCGATGCTAAGGCCCCTAGCTTTAGACATGAGGCCTACGGCGGATATAAAGCCGGACGCGCTCCAACCCCCGAGGACTTTCCAAGGCAGCTGGCCCTGATTAAGGAACTGGTGGATCTGCTGGGACTGGCTAGGCTGGAGGTGCCCGGCTACGAAGCTGACGATGTGCTGGCCTCCCTGGCTAAGAAAGCCGAGAAGGAAGGCTACGAGGTGCGCATCCTGACAGCCGACAAAGATCTGTATCAGCTGCTGTCTGACAGGATCCACGTGCTGCATCCCGAGGGGTATCTGATTACTCCTGCCTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGAGACCAGACCAGTGGGCTGATTATCGGGCCCTGACTGGCGACGAGTCAGATAACCTGCCCGGAGTGAAAGGCATCGGAGAAAAAACCGCCAGGAAGCTG
CTGGAGGAATGGGGCAGCCTGGAGGCTCTGCTGAAAAATCTGGATAGACTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAAATTCTGGCTCACATGGACGATCTGAAGCTGTCTTGGGACCTGGCCAAAGTGAGAACCGACCTGCCTCTGGAGGTGGATTTCGCCAAGAGGAGAGAGCCAGATCGGGAACGCCTGAGGGCTTTCCTGGAGCGGCTGGAATTTGGGTCACTGCTGCATGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCAAAGGCTCTGGAGGAAGCTCCATGGCCACCTCCAGAGGGAGCCTTCGTGGGATTTGTGCTGTCCAGGAAAGAACCAATGTGGGCTGACCTGCTGGCTCTGGCTGCTGCCAGAGGGGGACGGGTGCACCGCGCCCCTGAGCCATACAAGGCTCTGCGCGACCTGAAAGAAGCCAGGGGGCTGCTGGCTAAGGATCTGTCAGTGCTGGCTCTGAGGGAGGGACTGGGACTGCCCCCTGGCGACGATCCAATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGATCCAAGCAACACTACCCCAGAGGGAGTGGCTAGGAGATATGGAGGGGAATGGACCGAGGAAGCTGGGGAGAGAGCTGCCCTGTCCGAACGGCTGTTCGCTAATCTGTGGGGAAGGCTGGAGGGAGAGGAAAGGCTGCTGTGGCTGTACCGGGAGGTGGAACGCCCTCTGTCCGCTGTGCTGGCTCACATGGAGGCTACAGGCGTGCGCCTGGACGTGGCTTATCTGAGGGCCCTGTCTCTGGAGGTGGCTGAGGAAATCGCCAGACTGGAGGCTGAAGTGTTCCGGCTGGCCGGACATCCCTTTAACCTGAATAGCAGGGACCAGCTGGAGAGAGTGCTGTTCGATGAACTGGGGCTGCCTGCCATTGGCAAGACCGAGAAAACAGGGAAGCGCTCAACAAGCGCTGCTGTGCTGGAGGCTCTGAGGGAAGCTCACCCCATCGTGGAGAAGATTCTGCAGTACAGAGAACTGACTAAGCTGAAATCCACCTATATCGACCCCCTGCCTGATCTGATTCACCCTAGGACAGGCAGACTGCATACTCGCTTCAACCAGACAGCTACTGCCACCGGAAGGCTGAGCTCCTCTGACCCAAACCTGCAGAATATCCCTGTGAGAACCCCACTGGGACAGCGGATCAGGAGAGCTTTTATTGCTGAGGAAGGATGGCTGCTGGTGGCTCTGGATTACTCCCAGATTGAGCTGAGGGTGCTGGCTCACCTGTCTGGGGACGAAAACCTGATCCGCGTGTTCCAGGAGGGCAGGGATATTCATACAGAAACTGCCAGCTGGATGTTTGGAGTGCCTCGCGAGGCTGTGGACCCACTGATGAGGAGGGCTGCCAAGACAATCAATTTCGGAGTGCTGTATGGGATGTCCGCCCACAGGCTGTCTCAGGAGCTGGCTATCCCCTACGAGGAAGCTCAGGCCTTCATCGAAAGATACTTCCAGTCTTTCCCTAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAAACCCTGGAGGAAGGCAGGAGACGGGGATACGTGGAAACACTGTTCGGCCGCAGGAGATATGTGCCTGACCTGGAGGCCAGGGTGAAGTCAGTGCGCGAGGCTGCCGAAAGGATGGCTTTCAATATGCCTGTGCAGGGAACCGCTGCCGACCTGATGAAACTGGCCATGGTGAAGCTGTTTCCACGCCTGGAGGAAATGGGGGCTAGGATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAGCTGGTGCTGGAAGCCCCAAAGGAGAGAGCTGAAGCCGTGGCTCGGCTGGCCAAAGAAGTGATGGAAGGCGTGTACCCCCTGGCTGTGCCTCTGGAGGTGGAAGTGGGAATCGGGGAGGACTGGCTGTCCGCCAAGGAATGA(21-2)來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶表達(dá)用載體的構(gòu)筑在自主復(fù)制型穿梭載體(pPTR II =TaKaRa Bio)的HindIILKpn I限制酶位點(diǎn)插 入TEF啟動(dòng)子(序列號(hào)66)和SD終止子(序列號(hào)67)，得到載體pPTR-TEF-SDt。序列號(hào)66GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAAGGATGGTTCAGATACAAATTAGCAACAGGCCAGGCTAGACGCGCGACTATCCACTGCGGCAAATGGTGAGCTGCAAGCAACGGTAAGATGTGACAGGACGAGCGGTGTGCCGGGAAAAAAATTGGAGGAGCGCAAAGCGGCGGCTGTCCCTCAGTGGTGCCCAAACGTTATCGATAGTACACCAAGCATGGGCAGTGAGCGGCTATACAGAGGGAATAATAGGCATATCGGCACGACTAGATTCGGTAGAAAGCATC[1020]GAAGAGCAATTCATTGAGCATATTATCACGTGGAATGCGATAGCTGTGGCCAGGTTGAGACACCGCAAGTGAAAGATACACACATAGATTCTCGATTCGAGCGGTTTGCCTCCGCCACCGCAGTGCATAGCAAGCAAAGAAACGACAGTTGGCTCATCATCCGTTACATCATTTTTTCTACTGGCTCCGCTCGGTGGGCTCCCAACGAAGCAGCAAAAAAGTGAGAGAAAAAAACTAGCTTGGCGGGGCAACAGAAGCTAGACCCTTTGGCTCGCTTAGTCAGTGCGCCCACTCACTCACACTCAAAAAGGCCACCCCTCCCGCACCCTCTTCTCATCACCGTCTTCATACCACGGTTCGTCAAGCAATCGTATCTGGTAAGCTTTGACCTCCTCGAGCGGGCTCCACTTTGCTATTTCTTGGATCTGCTCTTTCTTTTCTCTCTACCTCTTTTTCTAACCTCTCTTCAGAAAGTTCAACCGTACTTCACTCCATCTTCCTACGTCACTCTAGA序列號(hào)67TAAAGCGGCGTGCTCTGCACATAACACGTGTCGTGTTTGGGTTCGGTATGGGTAATGGCGAATGGGGACATGCATTTATGGGATAGGGGGCTGGGTTGGTGTAATCAAATGTGCATACAGACCAGCTGATACGAATACTACAACTTACCCCGACACACGCATTCATGTGACGCCCAACACCTCGTCTAACTCATCGGGGCAACTCACCTCAATCCGATTCAGCCTCCCGGTEF 啟動(dòng)子來自 Aureobasidium pulluans, SD 終止子來自 Colletotrichum orbiculare,以共同提取的基因組DNA作為模板利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。以(序列號(hào)68、69、70、 71)TEF啟動(dòng)子和SD終止子之間存在Riie I ,Xma I限制酶位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。序列號(hào)68 GCGGCCGCGGGTGCAAACGGTGGTCAAA序列號(hào)69 ATATCTAGAGTGACGTAGGAAGATGGAG序列號(hào)70 GTTAAACAGATCTCCCGGGTAAAGCGGCGTGCTCTGCAC序列號(hào)71 TATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT然后，在pPTR-TEF-SDt的Pme I、Xma I限制酶位點(diǎn)插入編碼來自T. aquatics 的耐熱性DNA聚合酶的基因，得到載體pPTR-TEF-Taq。另外，為了添加FLAG標(biāo)記，以載體 pPTR-TEF-Taq為模板，使用以5’末端序列中存在Riie I限制酶位點(diǎn)、3’末端序列中存在 Xma I限制酶位點(diǎn)的方式設(shè)計(jì)的引物(序列號(hào)72、73)進(jìn)行擴(kuò)增，插入到pPTR-TEF-SDt的 Pme I、Xma I限制酶位點(diǎn)，得到載體pPTR-TEF-FLTaq。序列號(hào)72ATAGTTTAAACATGGATTATAAGGATGAC GATGACAAGATGAGAGGCATGCTGCCAC序列號(hào)73ATGGTACCGGGAGGCTGAATCGGAT(21-3)A. oryzae 的轉(zhuǎn)化將載體pPTR-TEF-FLTaq導(dǎo)入到絲狀菌(Aspergillus oryzae)中。使用原生質(zhì)體-PEG法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用CD固體培養(yǎng)基(每IL =NaNO3 6. 0g、KCl 0. 52g、KH2PO4 1. 52g、 IM MgSO4 · 7H20 2ml、葡萄糖 10. 0g、FeSO4 · 7H20 1. Omg, ZnSO4 · 7H20 8. 8mg, CuSO4 · 5H20 0. 4mg,Na2B4O7 'IOH2O 0. Img、(NH4)6Mo7O24 ·4Η20 0. 05mg、Agar 20. Og，用 IN KOH調(diào)至pH6. 5) 在30°C下培養(yǎng)A. oryzae，將其懸濁在IOml的0. 1% Tween80,0. 8% NaCl中，用玻璃過濾器 (3G2)過濾，收集濾液。在3，OOOrpm下離心5分鐘，使分生孢子沉淀，除去上清液。用IOml 的0. TweenSO清洗分生孢子2次后，使其懸濁在適量的滅菌水中，得到孢子懸濁液。在IOOml的CD液體培養(yǎng)基中植入A. oryzae的孢子懸濁液，在30°C下振蕩培養(yǎng)20 小時(shí)。用玻璃過濾器(3G 1)過濾，收集菌絲，用滅菌水清洗后，用刮勺等按壓，從菌絲中充分?jǐn)D出水分。將適當(dāng)量的菌絲加入到50ml聚丙烯制離心管中的原生質(zhì)體化溶液中進(jìn)行懸濁，在30°C下平穩(wěn)地振蕩2小時(shí)，進(jìn)行了原生質(zhì)體化。用玻璃過濾器(3G》對(duì)其過濾，將濾液在2，OOOrpm下離心5分鐘，收集原生質(zhì)體，用0. 8M NaCl清洗2次。在溶液1 (0. 8M NaClUOmM CaCl2UOmM Tris-HCl (pH8. 0))中懸濁，使原生質(zhì)體為 2 X 108/ml，加入 0. 2 容量的溶液 2(40% (w/v)PEG4000、50mM CaCl2、50mM Trls-HCl (pH8. 0))平穩(wěn)地懸濁。在 0. 2ml 的原生質(zhì)體懸濁液中加入20 μ g的pPTR-TEF-FLTaq，在冰中靜置30分鐘。加入Iml的溶液2，平穩(wěn)地懸濁，在室溫下靜置15分鐘。加入8. 5ml的溶液1，平穩(wěn)地懸濁。然后，離心， 收集原生質(zhì)體，除去上清液，將原生質(zhì)體懸濁在0. 2ml的溶液1中。將原生質(zhì)體懸濁液懸濁在5ml的⑶軟瓊脂選擇培養(yǎng)基(使⑶培養(yǎng)基的瓊脂為0. 5%，添加0. 8M NaCUO. 1 μ g/ml 吡啶硫胺(TaKaRa Bio)，在50°C下保溫所得的培養(yǎng)基)中，以原生質(zhì)體均勻分散的形式接種到⑶選擇培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)7天。(21-4) A. oryzae的培養(yǎng)、來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶的生產(chǎn)將轉(zhuǎn)化體接種到600ml⑶培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)4天。將它們?cè)?000rpm下離心分離10分鐘，收集菌體，懸濁在破碎用緩沖液(50mM Tris-HCl ρΗ7· 5、50mM KCl)中，使用0. 5mm玻璃珠破碎菌體后，在70°C下進(jìn)行60分鐘的熱處理，在12000rpm下離心分離30 分鐘，得到含有耐熱性DNA聚合酶的上清液。使用FLAG標(biāo)記蛋白質(zhì)沉淀試劑盒(Sigma)對(duì)其進(jìn)行純化，得到來自T. aquatics的耐熱性DNA聚合酶制品。(21-5)利用PCR檢查非特異性核酸的混入圖7為瓊脂糖電泳的照片，表示使用上述得到的耐熱性DNA聚合酶調(diào)查是否混入非特異性核酸的實(shí)例。泳道1為標(biāo)記、泳道2為未添加模板、泳道3為以大腸桿菌DNA作為模板進(jìn)行PCR。引物使用序列號(hào)85、86，PCR溫度條件、PCR溶液組成與(6_3)同樣地進(jìn)行， 通過45循環(huán)進(jìn)行PCR。由此，以大腸桿菌作為模板的情況檢測(cè)到來自細(xì)菌16SrRNA的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，不加模板的情況未檢測(cè)到來自細(xì)菌16SrRNA的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。(22)使用不顯示法(掩蔽引物二聚體法)利用各種耐熱性DNA聚合酶的實(shí)時(shí)PCR使用上述得到的耐熱性DNA聚合酶制品，使用不顯示法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR 中分別使用以S. cerevisiae作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品(圖8、A、圖9、A)、來自突變P. furiosus的耐熱性DNA聚合酶制品(圖8、B、圖9、B)、來自突變T. gorgonarius的耐熱性DNA聚合酶制品(圖8、C、圖9、C)、以P. pastor is作為宿主生產(chǎn)的來自T. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品(圖8、D、圖9、D)、以Tobacco BY-2 作為宿主生產(chǎn)的來自Τ. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶制品(圖8、E、圖9、E)。另外圖8、A、B、C、D及E為表示擴(kuò)增曲線的圖，圖9、A、B、C、D及E為表示熔解曲線的圖。實(shí)線為添加模板的情況，虛線為未添加模板的情況。實(shí)時(shí)PCR試劑與(17)相同。實(shí)時(shí)PCR的程序?yàn)?940C 1分鐘、50°C 30秒、72°C 1分鐘、84°C 2秒后，檢測(cè)熒光值，將其重復(fù)60次。根據(jù)實(shí)時(shí) PCR結(jié)果，進(jìn)行解析，即，通過使用不顯示法，未檢測(cè)到妨礙實(shí)時(shí)PCR中的定量性的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和細(xì)菌DNA的擴(kuò)增曲線的信號(hào)。(實(shí)施例2利用不顯示法的定量鑒定A)以下，將利用宿主S. cerevisiae生產(chǎn)的來自Τ. aquaticus的耐熱性DNA聚合酶記作 e-DNAP。使用上述得到的e-DNAP利用不顯示法嘗試進(jìn)行樣品的定量鑒定。實(shí)時(shí)PCR儀為 LightCycler 1. 5 (Roche Diagnostics 公司)及 RotorGene6000 (QIAGEN 公司)，實(shí)時(shí) PCR 用試劑為下述構(gòu)成，使用以下記載的細(xì)菌檢測(cè)用通用引物，以總量20 μ L的系統(tǒng)進(jìn)行。正向引物CTCCTACGGGAGGCAG(序列號(hào)43)反向引物ACTACCAGGGTATCTAATCCTG(序列號(hào) 44)e-DNAP (5units/ μ L) 1 μ LΕ. Coli 基因組 DNA模板或水PCR級(jí)2 μ L，SYBR Green I (TAKARA) 300 倍稀釋液 2 μ L，PCR 引物(10μΜ)0. 8μ L each,10XBuffer(500mM KCl，IOOmM Tris-HCl)2y L25mM MgCl2 1 μ L,2mM dNTP mix 2 μ L，水PCR 級(jí) 8. 4μ L另外，實(shí)時(shí)PCR的程序按照表1記載的條件進(jìn)行。[表1]
權(quán)利要求
1.一種耐熱性DNA聚合酶制品，是耐熱性DNA聚合酶的制品，其特征在于(1)1單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.一種耐熱性DNA聚合酶制品的制造方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將編碼耐熱性DNA聚合酶的基因轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞中，得到耐熱性DNA聚合酶基因表達(dá)轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的步驟，(2)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的步驟，(3)從經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中取得含有耐熱性DNA聚合酶的提取物，將所述提取物進(jìn)行熱處理的步驟；或者將經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞進(jìn)行熱處理后，從經(jīng)熱處理的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中取得含有耐熱性DNA聚合酶的提取物的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其特征在于，所述熱處理的溫度為50°C以上。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制造方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化中使用的編碼耐熱性DNA聚合酶的基因來自嗜熱菌或超嗜熱菌。
5.如權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，編碼耐熱性DNA聚合酶的基因是由序列號(hào)1的堿基序列構(gòu)成的DNA。
6.如權(quán)利要求2 5中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，真核細(xì)胞為菌類、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞中的任一種。
7.如權(quán)利要求2 6中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述制品為(1)1單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.一種耐熱性DNA聚合酶制品，其特征在于，含有利用權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的制造方法得到的提取物或其純化制品。
9.樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的檢測(cè)方法，其特征在于，在對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行檢測(cè)的方法中，包括以下步驟(1)擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，和(2)檢測(cè)步驟，檢測(cè)所述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物中的所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中，所述耐熱性DNA聚合酶制品為下述(A)及(B)耐熱性DNA聚合酶制品中的任一種，(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其中，所述擴(kuò)增步驟是在抑制除所述靶基因之外的靶外基因的擴(kuò)增的條件下進(jìn)行的。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測(cè)方法，其中，利用熱啟動(dòng)法抑制所述靶外基因的擴(kuò)增。
12.如權(quán)利要求11所述的檢測(cè)方法，其中，相對(duì)于1單位所述耐熱性DNA聚合酶，使用過量的抗DNA聚合酶抗體。
13.如權(quán)利要求9 12中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，以能夠檢測(cè)到所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物、不能檢測(cè)到其之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方式進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的檢測(cè)方法，其中，通過下述方式設(shè)定能夠檢測(cè)到所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物、不能檢測(cè)到除其之外的靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的條件，并使用只檢測(cè)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法進(jìn)行檢測(cè)，所述方式為(1)設(shè)計(jì)所述引物，使所述靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmA)高于所述靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(TmB)，(2)在TmA和TmB之間的溫度下進(jìn)行所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。
15.如權(quán)利要求14所述的檢測(cè)方法，其中，利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行所述擴(kuò)增步驟和所述檢測(cè)步驟，所述實(shí)時(shí)PCR使用顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量的顯示裝置，所述靶外基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在所述顯示裝置中無顯示。
16.如權(quán)利要求9 15中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，利用具有檢測(cè)用標(biāo)記的嵌入劑進(jìn)行所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。
17.如權(quán)利要求9 12中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)步驟通過在凝膠上展開擴(kuò)增產(chǎn)物來進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求9 17中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，所述耐熱性DNA聚合酶制品為以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，所述真核細(xì)胞為菌類、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及動(dòng)物細(xì)胞中的任一種。
19.如權(quán)利要求9 18中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)對(duì)象生物為選自細(xì)菌、真菌、病毒中的1種或2種以上。
20.如權(quán)利要求19所述的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)對(duì)象生物為細(xì)菌，所述引物為能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組。
21.如權(quán)利要求9 20中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)對(duì)象生物為感染癥病原菌。
22.如權(quán)利要求9 21中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，所述樣品為應(yīng)為無菌環(huán)境的樣品。
23.如權(quán)利要求22所述的檢測(cè)方法，其中，所述應(yīng)為無菌環(huán)境的樣品選自血液、腦脊髓液、羊水、尿、食品、飲料、化妝品、供水質(zhì)檢查的樣品。
24.如權(quán)利要求9 23中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中，在所述檢測(cè)步驟中，定量所述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所得的定量結(jié)果定量所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物。
25.如權(quán)利要求M所述的檢測(cè)方法，其中，在所述檢測(cè)步驟中，將所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量或數(shù)值化，根據(jù)其結(jié)果求出所述樣品中含有的檢測(cè)對(duì)象生物的個(gè)體數(shù)。
26.如權(quán)利要求25所述的檢測(cè)方法，其中，作為將所述擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)值化的方法，使用吸光度測(cè)定法或光密度測(cè)定法。
27.如權(quán)利要求M所述的檢測(cè)方法，其中，所述靶基因?yàn)樗鰴z測(cè)對(duì)象生物的鑒定用基因，根據(jù)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的分析結(jié)果，對(duì)所述樣品中含有的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定。
28.樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，是對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、引物(B)及(M)和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物(B)及(M)用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm值)的組合，解析所述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物(F)用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因，和(4)第二定量鑒定步驟，基于對(duì)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm值)的組合，解析所述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定所述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟和所述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果進(jìn)行所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，其中，所述引物(B)、(F)及(M)如下(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，第一擴(kuò)增步驟中的耐熱性DNA聚合酶制品為下述(A)及(B)中的任一種，(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
29.樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定方法，是對(duì)樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)第一擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、引物(B)、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物(B)用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因，(2)第一定量鑒定步驟，基于對(duì)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm值)的組合，解析所述第一擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，進(jìn)行所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(3)第二擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、引物(F)、和以細(xì)菌作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物(F)用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因，(4)第二定量鑒定步驟，基于對(duì)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm值)的組合，解析所述第二擴(kuò)增步驟中的多個(gè)(3 10)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)的組合，對(duì)定量鑒定所述檢測(cè)對(duì)象生物的第一定量鑒定步驟及所述第二擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)所得的定量結(jié)果進(jìn)行所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，(5)第三擴(kuò)增步驟，使用由所述樣品制備的核酸、引物(M)、和耐熱性DNA聚合酶制品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物(M)用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因，和(6)第三定量鑒定步驟，基于對(duì)所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的熔解溫度(Tm值)， 解析所述第三擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)，進(jìn)行所述樣品中的檢測(cè)對(duì)象生物的定量鑒定，其中，所述引物(B)、(F)及(M)如下所述(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組，第一及第三擴(kuò)增步驟中的耐熱性DNA聚合酶制品為(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，及(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
30.如權(quán)利要求觀或四所述的定量鑒定方法，其中，所述細(xì)菌的16SrRNA基因的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)? 10處。
31.如權(quán)利要求觀或四所述的定量鑒定方法，其中，所述真菌的ISSrRNA基因的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)? 10處。
32.如權(quán)利要求28 31中任一項(xiàng)所述的定量鑒定方法，其中，增加下述步驟作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，將一定濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA作為模板，使用能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組及含有全部或一部分各引物堿基序列的引物組中的任一種，通過每次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)Tm值，來校正所述擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值的測(cè)定誤差。
33.如權(quán)利要求觀 32中任一項(xiàng)所述的定量鑒定方法，其中，基于對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的熔解溫度的組合(Tmsi Tmsn :n為3 10)，解析基于各擴(kuò)增區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度的組合(TmM1 Tmw :N為3 10)，對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量鑒定。
34.如權(quán)利要求33所述的定量鑒定方法，其中，增加下述步驟作為用于鑒定所述檢測(cè)對(duì)象生物的算法，不僅利用Tm值自身的組合，而且利用各Tm值間的差的組合進(jìn)行鑒定，由此使測(cè)定誤差的影響為最小限度。
35.一種定量或鑒定用組合，用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定， 其特征在于，具有用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的耐熱性DNA聚合酶制品和用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物，其中，所述耐熱性DNA聚合酶制品為(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，及(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
36.一種定量及/或鑒定用組合，用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定，其特征在于，具有用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的、為下述(A)及(B)中的任一種的耐熱性DNA聚合酶制品 用于擴(kuò)增由樣品制備的核酸的、以細(xì)菌細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，和用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物， 其中，所述㈧及⑶為(A)以真核細(xì)胞作為宿主制造的耐熱性DNA聚合酶制品，(B)具有下述特征的耐熱性DNA聚合酶制品，(B-I)I單位的耐熱性DNA聚合酶中，除編碼所述耐熱性DNA聚合酶的基因之外，來自細(xì)菌的核酸的混入量為IOfg以下，(B-2)使用僅能夠使除編碼耐熱性DNA聚合酶的基因之外的來自細(xì)菌的核酸擴(kuò)增的引物，在不加入模板的條件下，即使對(duì)所述制品進(jìn)行32個(gè)循環(huán)以上的基因擴(kuò)增反應(yīng)，也未檢測(cè)到來自細(xì)菌的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。
37.如權(quán)利要求36所述的組合，其中，所述引物為下述引物(B)、(F)及(M)(B)能夠擴(kuò)增所有細(xì)菌的16SrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部1/3以上各引物堿基序列的引物，(F)能夠擴(kuò)增所有真菌的ISSrRNA基因的多個(gè)區(qū)域的引物組，及含有全部或1/3以上各引物堿基序列的引物，(M)對(duì)呈現(xiàn)甲氧西林耐性的mecA基因等隨著各時(shí)期的流行而產(chǎn)生的抗生素耐性基因進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增的引物組。
38. 一種定量及/或鑒定系統(tǒng)，用于對(duì)樣品中所含的檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量及/或鑒定，其特征在于，具有(1)擴(kuò)增裝置，用于使用由所述樣品制備的核酸、用于擴(kuò)增對(duì)所述檢測(cè)對(duì)象生物為特異性的靶基因的引物、耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，(2)定量裝置，用于對(duì)所述擴(kuò)增步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，(3)計(jì)算裝置，根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果計(jì)算所述樣品中檢測(cè)對(duì)象生物的量，和(4)數(shù)據(jù)庫，用于由所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的定量結(jié)果計(jì)算所述樣品中檢測(cè)對(duì)象生物的量，所述系統(tǒng)用于進(jìn)行權(quán)利要求9 34中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法或定量鑒定方法。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明能夠提供一種耐熱性DNA聚合酶制品，所述制品在利用基因擴(kuò)增反應(yīng)的樣品微生物的檢測(cè)中無限地降低假陽性的風(fēng)險(xiǎn)，因此即使在樣品微生物的量較少、從其中提取的DNA也為微量的情況下也能夠?qū)τ糜跇悠肺⑸餀z測(cè)的DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并且可以降低制造成本。進(jìn)而，能夠提供一種使用本發(fā)明的制品迅速簡(jiǎn)便地以高靈敏度對(duì)檢測(cè)對(duì)象生物進(jìn)行定量或定量鑒定的方法。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102282257SQ201080004647
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者上野智浩, 仁井見英樹, 北島勛, 南洋, 多葉田譽(yù), 林史朗, 森正之 申請(qǐng)人:北海道三井化學(xué)株式會(huì)社, 國立大學(xué)法人富山大學(xué)