專利名稱：埃博拉病毒熒光定量pcr檢測(cè)新方法及埃博拉病毒檢測(cè)pcr體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及埃博拉病毒的快速定性和定量檢測(cè)方法，提 供一對(duì)特異性引物和探針。
背景技術(shù)：
埃博拉病毒(Ebola virus, EB0V)能夠引起一種人畜共患傳染病，即埃博拉出血 熱(Ebola hemorrhagil fever，EBHF)，1976年在蘇丹南部和扎伊爾即現(xiàn)在的剛果(金)的 埃博拉河地區(qū)首次爆發(fā)，患者死亡率高達(dá)90%，引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，埃博拉病毒由此得 名。埃博拉病毒感染性極強(qiáng)，可通過(guò)直接接觸感染者的體液或其他感染組織、皮膚潰破傷口 和飛沫等多種途徑傳播。感染者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的出血現(xiàn)象并導(dǎo)致休克綜合征。世界衛(wèi)生組織 已經(jīng)將EBOV列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，即第4級(jí)病毒，與其相關(guān)的試驗(yàn)操作必須 在P4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。目前用于埃博拉病毒的檢測(cè)方法已經(jīng)有免疫組織化學(xué)檢查、血清學(xué)檢測(cè)、電鏡檢 查、病毒分離、RT-PCR核酸檢測(cè)、real-time RT-PCR核酸檢測(cè)，每種方法都有各自優(yōu)勢(shì)與缺 陷，但熒光定量PCR核酸檢測(cè)的方法不失為公認(rèn)的一種更直觀、更快速的一種適合早期診 斷的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法及埃博拉病毒 檢測(cè)PCR體系，該方法能夠快速定性和定量檢測(cè)埃博拉病毒，包括一對(duì)特異性更高、靈敏度 高、重復(fù)性好的引物和探針。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法中設(shè)計(jì)采用的引物
探針為
權(quán)利要求
1.埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，該方法中設(shè)計(jì)采用的引物探針為NameSequencePosition Tm°C Modification引物 1 CAAGGACTGATACAATATCCAACAG1025-1049 58引物 2 GAATTTGMATCACAGCATCGT1164-1185 5 7 探針TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG1052-1078 69 Texas Red/BHQ-2
2.如權(quán)利要求1所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，該方法具體為1)設(shè)計(jì)引物探針；2)根據(jù)儀器選擇熒光素；3)合成引物和探針；4)制備陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；5)運(yùn)行PCR；6)數(shù)據(jù)分析；7)提取病毒RNA進(jìn)行體系驗(yàn)證。
3.如權(quán)利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，所述步驟 2)中熒光素的供選擇的熒光發(fā)射基團(tuán)有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 熒光淬滅基團(tuán)有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa Black RQ、Lowa Black FQ、Dabcyl。
4.如權(quán)利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，所述步驟4)中采取基因合成方式制作陽(yáng)性質(zhì)粒CBG233-4作為陽(yáng)性樣品將引物設(shè)計(jì)過(guò)程中篩選出 的高保守區(qū)域bpl025-bpll85前后分別延長(zhǎng)30 50bp進(jìn)行基因合成，然后將其克隆至 PMD19-T載體中，即為所述陽(yáng)性質(zhì)粒樣品，編號(hào)CBG233-4。
5.如權(quán)利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，所述步驟5)中Real-TimePCR反應(yīng)適用于所有熒光定量PCR反應(yīng)儀。
6.權(quán)利要求5中所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，所述熒 光定量PCR反應(yīng)儀包括SmartCyclerll，ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)、 Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀。
7.如權(quán)利要求2所述的埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法，其特征在于，所述步驟 5)中最佳擴(kuò)增條件為
8.一種埃博拉病毒檢測(cè)PCR體系，其特征在于，其中包括引物或者其他能與埃博拉全 長(zhǎng)序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增的等同引物，其相似同源性不能超過(guò)90%，引物序列如下引物 1 (5,-3,):_CAAGGACTGATACAATATCCAACAG_引物 2 (5'-3') GAATTTGAAATCACAGCATCGT_-r --- ■ ■——---
9. 一種埃博拉病毒檢測(cè)PCR體系，其特征在于，其中包括引物及能與埃博拉全長(zhǎng)序列 特異性探針，探針序列如下探針(5’-3,):_TGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTG""-‘■1 ‘“................................丨丨·.…. niniiiii-n—............. "'(“…...…”..............................1 丨丨丨丨丨丨-..............." """""能與埃博拉全長(zhǎng)序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增的等同探針，其位點(diǎn)區(qū)域的覆蓋率不能超過(guò) 50 %，其同源性不能超過(guò)70 %。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種埃博拉病毒熒光定量PCR檢測(cè)新方法及埃博拉病毒檢測(cè)PCR體系，由引物和探針、Premix Ex Taq反應(yīng)液、滅菌Tris水組成，該引物和探針檢測(cè)特異性好，靈敏度高，非常適用于埃博拉病毒，與馬爾堡病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102140532SQ20101060551
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者孫肖紅, 徐寶梁, 楊宇, 王靜, 白琳, 胡孔新 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院