專利名稱：裂谷熱病毒熒光定量pcr檢測新方法及裂谷熱病毒檢測pcr體系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及裂谷熱病毒的快速定性和定量檢測方法及裂 谷熱病毒檢測PCR體系，提供一對特異性引物和探針。
背景技術：
裂谷熱(Rift Valley fever, RVF)又名綿羊和牛傳染性地方流行性肝炎，是非洲 流行的一種致命的傳染病，通過蚊子叮咬傳染人類和牲畜，主要癥狀是急性腹瀉和高燒，進 而嚴重損害人和牲畜的肝、腎，部分病人還會因血管破裂而死亡。國際獸疫局(OIE)將其列 為A類疫病。本病對綿羊、山羊、牛的危害較為嚴重，可引起懷孕動物流產和新生畜高比例 死亡，大齡非懷孕動物也較易感，但臨床抗病性較強。直到2000年，RVF只限定在非洲流行 循環(huán)，但是最近在阿拉伯半島暴發(fā)了致死性的RVF，引人注目地表明急需要快速診斷、有效 處理和預防這一疾病。RVF病原即為裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)，屬于 布尼病毒禾斗(Bunyaviridae)白齡病毒屬(Phlebovirus)。目前用于裂谷熱病毒的檢測方法已經有病毒分離、瓊脂糖免疫擴散、免疫熒光染 色、ELISA法、病毒中和試驗、血凝抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等等很多種檢測方法，但熒 光定量PCR核酸檢測的方法仍為公認的一種更直觀、更快速的一種適合早期診斷的檢測方 法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法及裂谷熱病毒 檢測PCR體系，該方法能夠快速定性和定量檢測裂谷熱病毒，包括一對特異性更高、靈敏度 高、重復性好的引物和探針。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法中設計采用的引物 探針為
權利要求
1.裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法中設計采用的引物探針為NameSequencePositionTm°CModificationFPCATGGATTCTATATTATCAAMCAGC18-4357. 3RPAATGTTGGAAGTGCCAGAGTTAG100-12258. 2ProbeTGGTTTTGTTAGAGTGCCAATCAAGCA57-8368. 2HEX/BHQ-1
2.如權利要求1所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，該方法具體為1)設計引物探針；2)根據(jù)儀器選擇熒光素；3)合成引物和探針；4)制備陽性質粒標準品；5)運行PCR；6)數(shù)據(jù)分析；7)提取病毒RNA進行體系驗證。
3.如權利要求2所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 2)中熒光素的供選擇的熒光發(fā)射基團有6-FAM、TET、HEX、J0E、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red, 熒光淬滅基團有 BHQ-I、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ, Lowa BlackTMFQ、Dabcyl。
4.如權利要求2所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步 驟4)中采取基因合成方式制作陽性質粒CBG234-3作為陽性樣品將引物設計過程中篩 選出的高保守區(qū)域bpl8-bpl22前后分別延長10 50bp進行基因合成，然后將其克隆至 PMD19-T載體中，即為所述陽性質粒樣品，編號CBG234-3。
5.如權利要求2所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 5)中熒光定量PCR反應適用于所有熒光定量PCR反應儀。
6.如權利要求5所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述熒光定 量 PCR 儀包括 SmartCyclerII、ABI 實時 PCR 系統(tǒng)、BioRad 實時 PCR 檢測系統(tǒng)、Stratagene 定量多聚酶鏈反應儀。
7.如權利要求1所述的裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法，其特征在于，所述步驟 5)中最佳擴增條件為95°C 60s950C 5s 56°C 30s } 45 循環(huán)。
8.一種裂谷熱病毒檢測PCR體系，其特征在于，該體系包括引物或者其他能與裂谷熱 全長序列特異性結合并擴增的等同引物，其相似同源性不能超過90%，引物序列如下引物 1 (5,-3,) CATGGATTCTATATTATCAAAACAGC_引物 2(5，-3’):_AATGTTGGAAGTGCCAGAGTTAG_
9. 一種裂谷熱病毒檢測PCR體系，其特征在于，該體系包括引物及能與裂谷熱全長序 列特異性探針，探針序列如下探針(5'-30 TGGTTTTGTTAGAGTGCCAATCAAGCA_能與裂谷熱全長序列特異性結合并擴增的等同探針，其位點區(qū)域的覆蓋率不能超過 50 %，其同源性不能超過70 %。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種裂谷熱病毒熒光定量PCR檢測新方法及裂谷熱病毒檢測PCR體系，由引物和探針、Premix Ex Taq反應液、滅菌Tris水組成，該引物和探針檢測特異性好，靈敏度高，非常適用于裂谷熱病毒，與登革熱病毒無交叉反應。
文檔編號C12Q1/68GK102140528SQ201010605460
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2010年12月24日
發(fā)明者孫肖紅, 楊宇, 王靜, 白琳, 胡孔新, 馬雪征 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院