專利名稱：一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌kras基因突變的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基因突變的方法和試劑盒，具體涉及一種檢測(cè)KRAS基因12、 13密碼子突變的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
基因是人體腫瘤中常見的致癌基因。RAS基因家族由KRAS、HRAS和NRAS組成， 基因家族的各成員相互間同源性可達(dá)85%。RAS基因編碼的蛋白質(zhì)是P21蛋白，分子量為 21KD，由188-189個(gè)氨基酸組成，也稱之為P21高度相關(guān)蛋白。P21蛋白位于細(xì)胞膜的內(nèi)表 面，具有GTP酶活性，參于傳導(dǎo)細(xì)胞增生信號(hào)的調(diào)控系統(tǒng)。其激活狀態(tài)為GTP結(jié)合狀態(tài)，失 活狀態(tài)為GDP結(jié)合狀態(tài)，其轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)性致癌基因的主要部位是第12、13和61密碼子的 突變，其中以第12密碼子點(diǎn)突變最常見。該基因的體細(xì)胞突變常見于多種惡性腫瘤，在肺 癌患者中的突變率為15-30%，在結(jié)直腸癌患者中為20-50%。美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN) 2010年版的臨床指南4中明確指出KRAS基因是 人體腫瘤中常見的致癌基因。該基因的突變常見于多種惡性腫瘤，在肺癌患者中的突變率 為15-30%，在結(jié)直腸癌患者中為20-50%。NCCN指出KRAS基因突變會(huì)使肺癌患者對(duì)EGFR酪 氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥；使結(jié)直腸癌患者對(duì)抗EGFR抗體類藥物(西妥西單抗、帕尼單抗) 產(chǎn)生耐藥。所以NCCN提出腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進(jìn)行KRAS基因突變 檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定是否使用EGFR靶向藥物作為臨床治療措施。歐盟也明確規(guī)定，帕 尼單抗的適應(yīng)癥為KRAS野生型的結(jié)直腸癌患者。因此KRAS基因突變檢測(cè)能提高腫瘤臨床 治療的針對(duì)性，降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的治療時(shí)間。但是，盡管KRAS基因突變的意義已得到公認(rèn)，但是目前全球范圍內(nèi)仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化 的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的直接測(cè)序方法一直是公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是這種方法的靈敏度低，要求突 變率達(dá)到20%-30%時(shí)才能檢出，因此需要顯微切割或選擇性組織抽提來富集突變細(xì)胞。且 費(fèi)用高、通量低、檢測(cè)周期長，臨床應(yīng)用局限性大。限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)雖然具有較高的靈敏度，但所檢測(cè)的突變位點(diǎn)必須 具有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，實(shí)際設(shè)計(jì)和操作復(fù)雜。高效變性液相(dHPLC)的靈敏度在5%_10%之間，但只能區(qū)分雜合型樣本，當(dāng)檢測(cè) 純合型樣本時(shí)，需要摻入野生型樣本混合成雜合型來檢測(cè)，帶來額外的檢測(cè)費(fèi)用、延長了檢 測(cè)周期。上面的幾種檢測(cè)方法由于自身的缺陷，在臨床應(yīng)用方面局限性較大，至今仍然只 是作為一種檢測(cè)方法，而非成品試劑盒。而目前歐洲比較流行的檢測(cè)KRAS的分子信標(biāo)-擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(molecular beacon-ARMS)的技術(shù)，已做成試劑盒，也是全世界唯一的一個(gè)成熟的KRAS檢測(cè)試劑盒，靈 敏度可達(dá)1%左右，但一個(gè)樣品就要檢測(cè)8管反應(yīng)，還需要分子信標(biāo)探針，單個(gè)樣品的操作繁 瑣、且成本很高。
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高分辨率熔解(High-resolution melting，簡(jiǎn)稱HRM)分析是一門新興的技術(shù)。它 僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測(cè)PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃 描、序列配對(duì)和基因分型等多個(gè)方面。HRM既可以對(duì)未知突變進(jìn)行篩查、掃描，也可以對(duì)已 知突變進(jìn)行分析。相對(duì)于傳統(tǒng)的突變分析而言，操作步驟大大簡(jiǎn)化，時(shí)間和成本也降低了不 少。而且樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM分析，無需轉(zhuǎn)移，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，降低了污 染的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用高分辨率熔解分析KRAS基因突變的報(bào)道有
1、陳志紅等人報(bào)道了一種HRM法檢測(cè)大腸癌患者腫瘤組織KRAS基因突變的方法，應(yīng)用 HRM法檢測(cè)60份大腸癌患者新鮮腫瘤組織KRAS基因密碼子12和13的突變狀況，并與直 接測(cè)序法的結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果HRM法只需在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可獲 得檢測(cè)結(jié)果。HRM法可檢出系列混合樣本中突變型質(zhì)粒比例為10%的突變，其檢測(cè)靈敏度 達(dá)10% ；HRM法從60份大腸癌患者組織標(biāo)本中，檢出17份KRAS基因密碼子12或13突變 (28. 3%)；直接測(cè)序法檢出15份(25. 0%)突變，2份未檢出KRAS基因突變，HRM法檢測(cè)的敏 感度為100% (15/15)，特異度為96% (43/45)，可見HRM法在篩選大腸癌標(biāo)本的KRAS基因突 變類型時(shí)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏，單管避免污染等優(yōu)點(diǎn)(參見陳志紅.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 雜志· 2010 33(3))。、蘇州為真生物醫(yī)藥有限公司銷售一種K-RAS基因突變?cè)噭┖?，采用新型?變研究技術(shù)——高分辨率熔點(diǎn)曲線分析，應(yīng)用配有HRM模塊的熒光定量PCR儀器(如 LightCylcer480等)分析，即可完成對(duì)樣品基因型的判斷，具有以下特點(diǎn)高通量1次可檢 測(cè)10-300個(gè)樣本。高敏度HRM檢測(cè)靈敏度能達(dá)到-0. 1%，是傳統(tǒng)“PCR +測(cè)序”方法 的25-250倍。特異性好PCR產(chǎn)物無需后續(xù)處理，特異性達(dá)100% ；重復(fù)性好實(shí)驗(yàn)閉管進(jìn) 行，避免交叉污染。精確度高精確獲得K-RAS基因多個(gè)位點(diǎn)狀況，包括已知的7個(gè)熱點(diǎn)突 變(第12編碼子核苷酸突變，第13編碼子核苷酸突變和第61編碼子核苷酸突變)，也可同 時(shí)偵測(cè)未知突變。適用范圍廣可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微 量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。而傳統(tǒng)“PCR +測(cè)序”方法 對(duì)大部分不能手術(shù)的患者難以檢測(cè)。現(xiàn)有試劑盒對(duì)HRM技術(shù)作了較大的改進(jìn)，可一次檢測(cè)7個(gè)熱點(diǎn)突變，包括了密碼子 12、13和61，同時(shí)可以篩查未知突變。但是，現(xiàn)有技術(shù)仍然沒有解決HRM檢測(cè)無法進(jìn)行基因 分型的致命缺陷，雖可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)7種的熱點(diǎn)突變，卻無法區(qū)分這些突變的具體位點(diǎn)，在 科研和臨床工作中，往往需要后續(xù)的PCR富集和測(cè)序來對(duì)檢出的突變進(jìn)行基因分型，將與 結(jié)直腸癌的預(yù)后和靶向治療療效密切相關(guān)的密碼子12、13突變與其他突變有效的區(qū)分開 來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的方法和試劑盒，通過對(duì) 引物、檢測(cè)試劑以及檢測(cè)條件的優(yōu)化，使該試劑盒的操作簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)結(jié)果更為穩(wěn)定、檢 測(cè)成本也更低。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變 的方法，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA；
2)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn) 行變復(fù)性；
3)對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，和野生型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所 產(chǎn)生的熔解曲線相比，突變型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線先下降；
其中，步驟2)中，PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物對(duì)B或引物對(duì)C; 其中，引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向 引物SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No:5和反向 引物 SEQ ID NO 6 ；
每20 μ 1的PCR擴(kuò)增體系包括基因組DNA溶液、2 μ 1 PCR緩沖液(10 X )、0. 6-1. 0 μ 1 氯化鎂溶液、1.6μ1 dNTP、0. 1-0. 3μ 1 HotStarTaq DNA 聚合酶、100_200ηΜ 正向引物和 100-200ηΜ反向引物、2-5μ 1 SYTO 9熒光染料，其余為水；
PCR擴(kuò)增的過程為95°C 15 分鐘，95°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 20-25 個(gè)循環(huán)，81°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，15 個(gè)循環(huán)，72°C 2 分鐘; 反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，95°C 30秒，50°C 1分鐘。上述技術(shù)方案中，步驟2)中加入的基因組DNA溶液的體積根據(jù)提取液中DNA濃度 而調(diào)整，使加入的DNA量達(dá)到10ng。上述技術(shù)方案中，步驟3)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本在LightCycler 480儀中進(jìn)行熔 解曲線分析。儀器以0. 2°C /s的速度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的試劑盒，該試劑盒包 括PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、特異性引物對(duì)、熒光染料、水和野生型對(duì)照，其中，DNA聚 合酶為HotStarTaq DNA聚合酶，熒光染料為SYTO 9熒光染料，特異性引物對(duì)選自引物對(duì) A、引物對(duì)B或引物對(duì)C ；其中，引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向引物SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正 向引物SEQ ID No :5和反向引物SEQ ID NO :6。上述技術(shù)方案中，所述DNA聚合酶具有熱啟動(dòng)特征，活力為5個(gè)單位每微升；所述 DNA熒光染料為飽和熒光染料SYTO 9，濃度為50 μ Μ。上述技術(shù)方案中，IOX的PCR緩沖液(數(shù)字10表示使用時(shí)稀釋的倍數(shù))，由 Tris · Cl, KCl, (NH4)2SO4,15mM MgCl2 組成，pH 8. 7。上述技術(shù)方案中，所述的mM和μ M是摩爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含溶 質(zhì)的摩爾數(shù)。上述技術(shù)方案中，所述的SYTO 9是高靈敏度的DNA熒光染料，可與雙鏈DNA結(jié)合， 在高濃度的情況下對(duì)PCR反應(yīng)仍沒有抑制作用。上述試劑盒可以測(cè)定人源的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(包括血液、腹水)、 組織細(xì)胞(腫瘤組織)等，通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。上述技術(shù)方案中，從基因組DNA中，可擴(kuò)增含KRAS 12、13密碼子的DNA片段，以獲 得用于測(cè)定熔解曲線，本發(fā)明中，設(shè)計(jì)的引物位于人KRAS基因外顯子2中，具體序列為SEQ ID Νο:8。這種通過擴(kuò)增含KRAS 12、13密碼子的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測(cè)定 材料。例如，可按PCR方法，使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，此引物經(jīng)合理設(shè)計(jì)以便僅擴(kuò)增含KRAS 12、13密碼子的部分。本發(fā)明特異性引物為本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)之一，該引物本領(lǐng)域技術(shù)人員可經(jīng) 常規(guī)制備引物的方法制備。待擴(kuò)增區(qū)的堿基長度不受限制，但推薦小于150個(gè)堿基的片段。 當(dāng)按本發(fā)明所述制備引物時(shí)，可獲得適宜的測(cè)定樣品，其作為擴(kuò)增的DNA片段，并具有特異 性長度。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有特異性探針的檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變 的試劑盒，彌補(bǔ)HRM檢測(cè)只能進(jìn)行突變篩查的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因分型。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因分型 的方法，包括以下步驟
1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA；
2)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn) 行變性熔解；
3)對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，和野生型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所 產(chǎn)生的熔解曲線相比，突變型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線先下降；在通 過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線確定突變后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物在探針區(qū)的熔解曲線也先下降，則 說明突變發(fā)生在密碼子12、13的位置，而不是PCR擴(kuò)增片段的其他區(qū)域；
步驟2)中，PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物對(duì)B或引物對(duì)C;其中， 引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向引物 SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No :5和反向引物 SEQ ID NO 6 ；特異性探針 SEQ ID No 7 ；
每20 μ 1的PCR擴(kuò)增體系包括基因組DNA溶液，使加入的DNA量達(dá)到10ng、2 μ 1 PCR 緩沖液(10Χ )、0. 6-1. 0μ 1 氯化鎂溶液、1. 6μ 1 dNTP、0. 1-0. 3μ 1 HotStarTaq DNA 聚合 酶、100-200ηΜ正向引物和20-40ηΜ反向引物、2-5μ 1 SYTO 9熒光染料，100_200ηΜ特異性 探針其余為水；
PCR擴(kuò)增的過程為95°C 15 分鐘，95°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 20-25 個(gè)循環(huán)，81°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 15 個(gè)循環(huán)；72°C 2 分 鐘；
反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，90V 30秒，50°C 1分鐘。上述技術(shù)方案中，步驟2)中加入的基因組DNA溶液的體積根據(jù)提取液中DNA濃度 而調(diào)整，使加入的DNA量達(dá)到10ng。上述技術(shù)方案中，步驟3)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本在LightCycler 480儀中進(jìn)行熔 解曲線分析。儀器以0. 2°C /s的速度從55°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種含有特異性探針的檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的試 劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、特異性引物對(duì)、熒光染料、水，野生基因 對(duì)照，該試劑盒還包括特異性探針；其中，DNA聚合酶為HotStarTaq DNA聚合酶，熒光染料 為SYTO 9熒光染料，特異性探針的DNA序列為SEQ ID No :7 ；特異性引物對(duì)選自引物對(duì) A、引物對(duì)B或引物對(duì)C ；其中，引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向引物SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正 向引物SEQ ID No 5和反向引物SEQ ID NO 6 ；特異性探針SEQ ID No :7。本發(fā)明的主要原理是1)采用HRM技術(shù)在PCR反應(yīng)前加入飽和熒光染料，在一定溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，使DNA雙鏈逐漸解鏈，此時(shí)熒光染料分子逐漸從DNA 雙鏈上脫落，熒光信號(hào)下降。KRAS密碼子12、13發(fā)生突變后，經(jīng)過特異性引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物的熔解溫度(Tm值)降低，在溫度逐漸升高的時(shí)候會(huì)首先發(fā)生解鏈，其熒光信號(hào)首先下 降，而此時(shí)的野生型PCR產(chǎn)物由于解鏈溫度較高，熒光信號(hào)需要在更高的溫度下才會(huì)開始 下降，LightCycler 480通過光學(xué)檢測(cè)熒光信號(hào)并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野 生型和突變型。)C0LD-PCR是一項(xiàng)新的低豐度突變富集技術(shù)，它與常規(guī)PCR的最大區(qū)別是在PCR過 程中采用了關(guān)鍵變性溫度(Tc)，這個(gè)Tc比標(biāo)準(zhǔn)的變性溫度低，因此在Tc溫度的情況下，只 有異源雙鏈會(huì)變性解鏈并隨后與引物配對(duì)擴(kuò)增，而變性溫度較高的同源雙鏈則不會(huì)解鏈， 從而也不能擴(kuò)增。數(shù)個(gè)循環(huán)后，突變型基因組得到了優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增，在總基因組中所占比例增 加，得到了突變富集的目的。由于起始的模板量較少，我們選擇采用了常規(guī)PCR與COLD-PCR 結(jié)合的技術(shù)路線，先使用的標(biāo)準(zhǔn)變性溫度，進(jìn)行20-25個(gè)循環(huán)的常規(guī)PCR ；緊接著，采用的關(guān) 鍵變性溫度，進(jìn)行10-15個(gè)循環(huán)的C0LD-PCR。)特異性探針結(jié)合HRM技術(shù)，在突變篩查基礎(chǔ)上可以進(jìn)行基因分型。特異性探針 包含了 KRAS 12、13密碼子，且與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)。在PCR體系中，我們調(diào)整了反向引物的濃 度，其濃度為正向引物的五分之一，這樣的不對(duì)稱PCR可以大量擴(kuò)增出正向引物的PCR產(chǎn) 物，而只擴(kuò)增少量反向引物產(chǎn)物。在熔解初期，特異性探針與大量單鏈正向引物產(chǎn)物互補(bǔ)配 對(duì)，由此在熔解過程中，隨著溫度的升高會(huì)先后出現(xiàn)兩段熒熔解曲線，一段是由特異性探針 引起的，另一段則是常規(guī)的雙鏈PCR產(chǎn)物引起的。當(dāng)常規(guī)的雙鏈PCR產(chǎn)物的熔解曲線顯示 為突變型時(shí)，我們可以通過特異性探針的熔解曲線來確定突變是否發(fā)生在密碼子12、13位 置，或是發(fā)生在其他位置的新突變。因此，本發(fā)明通過上述優(yōu)化的引物，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增所需DNA片段。光學(xué)檢測(cè)熒 光信號(hào)變化產(chǎn)生溫度熔解曲線證實(shí)，它們顯示不同的熔解曲線。根據(jù)在上述方法中獲得的 熔解曲線，可測(cè)定KRAS 12、13密碼子突變情況。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明提供的KRAS 12、13密碼子突變檢測(cè)試劑盒，采用的是一種生物學(xué)的檢測(cè)方 法，與現(xiàn)有檢測(cè)試劑盒相比，具有顯著的進(jìn)步，如本發(fā)明試劑盒對(duì)于樣本沒有特殊的限制， 無論是體液還是細(xì)胞均可作為本發(fā)明的檢測(cè)樣本，使得檢測(cè)方便快捷。、本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)待擴(kuò)增區(qū)的堿基長度無嚴(yán)格要求，通過本發(fā)明特異 性引物可獲得本發(fā)明所述的PCR產(chǎn)物并進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。、本發(fā)明在PCR反應(yīng)體系中添加了特異性的探針，通過不對(duì)稱PCR反應(yīng)，可將已知 的與結(jié)直腸癌最為密切相關(guān)的密碼子12、13突變與擴(kuò)增片段內(nèi)的其他突變位點(diǎn)有效區(qū)分， 基因分型更為精確。、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比引入了COLD-PCR富集技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低廉，且 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高達(dá)0. 1%-0. 05%，具有很好的臨場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。


圖1實(shí)施例二中野生型、純合突變以及雜合突變?nèi)N基因型的熔解曲線； 圖2實(shí)施例三中敏感性實(shí)驗(yàn)熔解曲線；圖3實(shí)施例四中全血基因組和石蠟固定組織基因組的熔解曲線； 圖4實(shí)施例四中全血基因組和石蠟固定組織基因組的熔解峰。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一樣本的選擇和基因組DNA的提取
收集的基因組DNA分別來源于全血、細(xì)胞、新鮮組織以及石蠟固定組織，提取方法參照 試劑盒提供的操作手冊(cè)，同時(shí)做了部分優(yōu)化。健康人全血基因組DNA作為實(shí)驗(yàn)的野生型對(duì)照，使用康為世紀(jì)的BloodGen Mini Kit提??；
來源于A549細(xì)胞株的基因組DNA作為實(shí)驗(yàn)的純合突變型(G34A)對(duì)照， 來源于HCT116細(xì)胞株的基因組DNA作為實(shí)驗(yàn)的雜合突變型(G38A)對(duì)照，使用康為世 紀(jì)的 DNA FlexGen DNA Kit 提取；
而新鮮組織和石蠟組織均來源小鼠，用于評(píng)估HRM方法對(duì)固定組織的適應(yīng)性，使用康 為世紀(jì)的 DNA TissueGen DNA Kit 提?。?br> 細(xì)胞株組織來源突變情況基因型氨基酸A549肺癌組織34G>A純合子G12SHCT116結(jié)直腸癌38G>A雜合子G13D
*12、13密碼子突變是KRAS最常見的突變基因型
基因組DNA全部符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求0D260/280介于1. 8-2. O ；電泳結(jié)果顯示，除石 蠟固定組織外，其余基因組DNA片段都是IOkb以上的大片段，而石蠟固定組織的基因組DNA 存在部分降解，片段大小分布在1000-23kb之間。溶液濃度調(diào)整至IOng每微升，-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例二 突變位點(diǎn)的識(shí)別
采用HRM技術(shù)對(duì)已知KRAS 12、13密碼子基因型的樣本進(jìn)行檢測(cè)。.特異性引物和探針如下
SEQ ID No :1，正向引物 1 :5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3， SEQ ID No :2，反向引物 1 :5，-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3， SEQ ID No :7，特異性探針5，-CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT-3，。.通過PCR擴(kuò)增12/13密碼子附近部分片段；制備混合液加入之前制備的基因組 DNA溶液 1μ1、2μ1 PCR緩沖液(10Χ )、1. 6μ 1 dNTP、0. 1 μ 1 HotStarTaq DNA聚合酶、正 向引物0.4μ 1和反向引物各0.08 μ 1、SYTO 9熒光染料2 μ 1，加PCR級(jí)別的純水使反應(yīng) 體積為20μ1。反應(yīng)在95°C 15分鐘，95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)， 81°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，72°C 2分鐘；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物 再進(jìn)行變復(fù)性，95°C 30秒，50°C 1分鐘。.通過將樣本在LightCycler480儀中進(jìn)行熔解曲線分析。儀器以0. 2V /s的速 度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線，如圖1所示，圖1為KRAS 12/13密碼子分型 數(shù)據(jù)圖；根據(jù)樣品的熔解曲線，區(qū)分基因型。上述實(shí)施例結(jié)果驗(yàn)證
由于KRAS密碼子12、13發(fā)生突變，使得純合突變PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度降低，隨著
9溫度的升高，純合突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物首先開始解鏈，熒光信號(hào)隨之開始下降；而野生型PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由于熔解溫度較高，只有溫度繼續(xù)升高時(shí)，才會(huì)開始解鏈，熒光信號(hào)才會(huì)開始下 降；而雜合突變的PCR產(chǎn)物兼有純合突變和野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特點(diǎn)，有一部分突變的擴(kuò) 增產(chǎn)物和純合突變型擴(kuò)增產(chǎn)物一同開始解鏈，熒光值同時(shí)下降，另一部分未突變的擴(kuò)增產(chǎn) 物與野生型擴(kuò)增片段一同開始解鏈，熒光值同時(shí)下降并一同結(jié)束。根據(jù)上述特點(diǎn)，可將突變 型(包括純合、雜合突變)與野生型基因組有效區(qū)分。實(shí)施例三試劑盒敏感性驗(yàn)證
將A549純合突變型基因組與全血中提取的野生型基因組按一定比例混合，使A549基 因組占總DNA量的0. 05%。上述混合基因組DNA與野生型基因組DNA濃度調(diào)整為IOng每微 升。.特異性引物如下
SEQ ID No :1，正向引物 1 :5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3， SEQ ID No :2，反向引物 1 :5，-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3， SEQ ID No :7，特異性探針5，-CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT-3，。.通過PCR擴(kuò)增12/13密碼子附近部分片段；制備混合液加入之前制備的基因組 DNA溶液 1μ1、2μ1 PCR緩沖液(10Χ )、1· 6μ 1 2. 5mM dNTP、0. 1 μ 1 HotStarTaq DNA聚合 酶、正向引物0.4111和反向引物各0.08111、5￥110 9熒光染料2 μ 1，特異性探針200ηΜ，加 PCR級(jí)別的純水使反應(yīng)體積為20 μ 1。反應(yīng)在95°C 15分鐘，95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，81°C 15秒，15秒，15秒，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，72°C 2分鐘；反應(yīng)完成 后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，95°C 30秒，50°C 1分鐘。.通過將樣本在LightCycler480儀中進(jìn)行熔解曲線分析。儀器以0. 2V /s的速 度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線，如圖2所示，圖2為KRAS 12/13密碼子分型 數(shù)據(jù)圖；根據(jù)樣品的熔解曲線，區(qū)分基因型。上述實(shí)施例結(jié)果分析
按實(shí)施例2中提到的分型方法，我們可以明確區(qū)分檢測(cè)的0. 05%樣品和純合突變以及 野生型對(duì)照。具體基因?qū)W如圖中所示，本實(shí)施例說明傳統(tǒng)的PCR-HRM技術(shù)在引入COLD-PCR 之后，敏感性大為提高，最高可達(dá)0. 05%。實(shí)施例四試劑盒的通用性驗(yàn)證
臨床檢測(cè)中，固定組織標(biāo)本是很多的，從中提取的基因組DNA大多會(huì)發(fā)生降解、斷裂， 會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生一定的影響，所以必須確認(rèn)本發(fā)明試劑盒是否適合用于固定組織提取的基因 組DNA的突變檢測(cè)。取全血提取基因組；另外取石蠟包埋的小鼠組織，提取基因組，定量并稀釋至 IOng每微升。.特異性引物如下
SEQ ID No :1，正向引物 1 :5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3， SEQ ID No :2，反向引物 1 :5，-TATCGTCAAGGCACTCTTGC-3，。.通過PCR擴(kuò)增12/13密碼子附近部分片段；制備混合液加入之前制備的基因組 DNA溶液 1μ1、2μ1 PCR緩沖液(10Χ )、1. 6μ 1 dNTP、0. 1 μ 1 HotStarTaq DNA聚合酶、正 向引物0.4μ 1和反向引物各0.08 μ 1、SYTO 9熒光染料2 μ 1，加PCR級(jí)別的純水使反應(yīng)體積為20μ1。反應(yīng)在95°C 15分鐘，95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)， 81°C 15秒，60°C 15秒，72°C 15秒，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，72°C 2分鐘；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物 再進(jìn)行變復(fù)性，95°C 30秒，50°C 1分鐘。.通過將樣本在LightCycler480儀中進(jìn)行熔解曲線分析。儀器以0. 2V /s的速 度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線，如圖2所示，圖3為KRAS 12/13密碼子分型 數(shù)據(jù)圖；根據(jù)樣品的熔解曲線，區(qū)分基因型。上述實(shí)施例結(jié)果分析
以全血基因組DNA為對(duì)照，觀察固定組織基因組DNA的熔解曲線。結(jié)果如圖3、4。未調(diào) 整前的熔解曲線如圖3顯所，固定組織基因組DNA的熔解曲線形狀與全血基因組DNA的完 全一致，幾乎在一條曲線上，是典型的純合型熔解曲線；熔解峰型圖如圖4所示，雖然固定 組織基因組DNA的熒光信號(hào)較弱，但是峰型和熔解溫度值(Tm)是與野生型對(duì)照一致的，熒 光信號(hào)弱是因?yàn)镻CR效率低導(dǎo)致的，但這并不影響區(qū)分樣本的基因型。實(shí)施例五檢測(cè)試劑盒
本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成，來源如下，本發(fā)明試劑盒供10人份檢測(cè)應(yīng)用，-20°c保
存
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA；2)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn) 行變復(fù)性；3)對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，和野生型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所 產(chǎn)生的熔解曲線相比，突變型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線先下降；步驟2)中，PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物對(duì)B或引物對(duì)C;其中， 引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向引物 SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No :5和反向引物 SEQ ID NO 6 ；每20 μ 1的PCR擴(kuò)增體系包括基因組DNA溶液、2 μ 1 PCR緩沖液(10 X )、0. 6-1. 0 μ 1 氯化鎂溶液、1.6μ1 dNTP、0. 1-0. 3μ 1 HotStarTaq DNA 聚合酶、100_200ηΜ 正向引物和 100-200ηΜ反向引物、2-5μ 1 SYTO 9熒光染料，其余為水；PCR擴(kuò)增的過程為95°C 15 分鐘，95°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 20-25 個(gè)循環(huán)，81°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 15 個(gè)循環(huán)；72°C 2 分 鐘；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，90°C 30秒，50°C 1分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中加入的DNA提取液的體積根據(jù) 提取液中DNA濃度而調(diào)整，使加入的DNA量達(dá)到10ng。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本進(jìn)行熔解 曲線分析時(shí)，以0. 2V /s的速度從72°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線。
4.一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、 dNTP、DNA聚合酶、特異性引物對(duì)、熒光染料、水和野生型對(duì)照，其特征在于，DNA聚合酶為 HotStarTaq DNA聚合酶，熒光染料為SYTO 9熒光染料，特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物 對(duì)B或引物對(duì)C;其中，引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID N0:2，引 物對(duì)B包括正向引物SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No :5 和反向引物 SEQ ID NO :6。
5.一種檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因分型的方法，其特征在于，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA；2)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn) 行變性熔解；3)對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，和野生型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所 產(chǎn)生的熔解曲線相比，突變型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線先下降；在通 過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線確定突變后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物在探針區(qū)的熔解曲線也先下降，則 說明突變發(fā)生在密碼子12、13的位置，而不是PCR擴(kuò)增片段的其他區(qū)域；步驟2)中，PCR擴(kuò)增使用的特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物對(duì)B或引物對(duì)C;其中， 引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID NO :2，引物對(duì)B包括正向引物 SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No :5和反向引物 SEQ ID NO 6 ；特異性探針 SEQ ID No 7 ；每20 μ 1的PCR擴(kuò)增體系包括基因組DNA溶液、2 μ 1 PCR緩沖液(10 X )、0. 6-1. 0 μ 1 氯化鎂溶液、1.6μ1 dNTP、0. 1-0. 3μ 1 HotStarTaq DNA 聚合酶、100_200ηΜ 正向引物和 20-40ηΜ反向引物、2-5μ 1 SYTO 9熒光染料，100_200ηΜ特異性探針其余為水；PCR擴(kuò)增的過程為95°C 15 分鐘，95°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 20-25 個(gè)循環(huán)，81°C 10-15 秒，60°C 10-15 秒，72°C 10-15 秒，進(jìn)行 15 個(gè)循環(huán)；72°C 2 分 鐘；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性，90°C 30秒，50°C 1分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中加入的DNA提取液的體積根據(jù) 提取液中DNA濃度而調(diào)整，使加入的DNA量達(dá)到10ng。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣本在進(jìn)行熔 解曲線分析時(shí)，儀器以0. 2V /s的速度從55°C升溫到95°C，獲得樣品的熔解曲線。
8.一種含有特異性探針的檢測(cè)人結(jié)直腸癌KRAS基因突變的試劑盒，該試劑盒包括 PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、特異性引物對(duì)、熒光染料、水和野生型對(duì)照，其特征在于，該 試劑盒還包括特異性探針；其中，DNA聚合酶為HotStarTaq DNA聚合酶，熒光染料為SYTO 9 熒光染料，特異性探針的DNA序列為SEQ ID No :7 ；特異性引物對(duì)選自引物對(duì)A、引物對(duì)B 或引物對(duì)C;其中，引物對(duì)A包括正向引物SEQ ID No :1和反向引物SEQ ID N0:2，引物對(duì) B包括正向引物SEQ ID No :3和反向引物SEQ ID NO :4，引物對(duì)C包括正向引物SEQ ID No 5和反向引物SEQ ID NO 6 ；特異性探針SEQ ID No :7。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基因突變的方法和試劑盒，具體涉及一種檢測(cè)KRAS基因12、13密碼子突變的方法和試劑盒。該試劑盒包括PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶、特異性引物對(duì)、熒光染料、水，特異性探針、野生型對(duì)照，其特征在于，DNA聚合酶為HotStarTaqDNA聚合酶，熒光染料為SYTO9熒光染料，1)按照常規(guī)方法采集待分析的基因組DNA；2)對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行變復(fù)性；3)對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，和野生型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線相比，突變型的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的熔解曲線先下降。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102115792SQ20101059677
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者侯青, 姬云, 張泓 申請(qǐng)人:蘇州科貝生物技術(shù)有限公司