專利名稱：一種mthfr與fgf5基因snp檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技木，具體的是涉及ー種MTHFR與 FGF5基因SNP檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
Ν5’1。-亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) 是葉酸代謝過程的關(guān)鍵酶，也是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)重新甲基化為蛋氨酸所需要的關(guān)鍵酶。主要生化功能是催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)介導(dǎo)的從5，10-亞甲基四氫葉酸到5-甲基四氫葉酸的還原反應(yīng)，生成體內(nèi)最主要的甲基供體， 5-甲基四氫葉酸是組織和血清葉酸的主要形式，參與體內(nèi)多種重要的生化反應(yīng)(如嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成等)。MTHFR定位于染色體1ρ36. 3，基因包括11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，外顯子的長度分別為99-252bp，內(nèi)含子的長度分別為192-98Ibp。MTHFR基因突變可直接影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和耐熱性，表現(xiàn)為不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐熱性降低，繼而導(dǎo)致同型半胱氨酸(Hcy)向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生障礙，使Hcy在血液中堆積，促進(jìn)氧自由基的生成，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。目前研究認(rèn)為，血漿高Hcy是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor, FGF)是ー組強(qiáng)大的促細(xì)胞分裂物，其靶細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，因此它對于血管壁細(xì)胞的作用是非特異的。FGFs通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞増殖等功能參與血管新生的過程。FGF5是FGF中的一員，位于人類基因組4q21。在基因治療方面，F(xiàn)GF5基因首先被應(yīng)用于心肌缺血治療的研究。Giordano等在豬慢性心肌缺血模型中予冠脈內(nèi)注射攜帯FGF5基因的重組腺病毒，在心肌內(nèi)成功地檢測到FGF5mRNA和蛋白的表達(dá)；組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)FGF5組心肌內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)多于對照組，缺血區(qū)心肌收縮功能改善更為明顯。當(dāng)FGF5基因出現(xiàn)突變則會改變心血管的正常狀態(tài)，引起心血管疾病的發(fā)生。本發(fā)明目標(biāo)檢測的MTHFR和FGF5基因突變位點(diǎn)，如表所示
權(quán)利要求
1.ー種MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片，其特征在于，主要包括有(A).針對每種SNP分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因SNP位點(diǎn)的特異性引物組成，所述野生型和突變型的特異性引物分別為針對MTHFR基因的G121A SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10、針對 A105G SNP位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12、針對GlllA SNP位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或針對 FGF5 基因的 T196ASNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ； 所述tag序列選自SEQ ID NO. 1-8 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 17 SEQ IDN0. 24中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；(C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片，其特征在干，所述擴(kuò)增引物為針對MTHFR基因的G121A SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO. 25及SEQ ID NO. 26、針對A105G SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28、針對 GlllA SNP 位點(diǎn)的 SEQID NO.四及 SEQ ID NO. 30、和 / 或針對 FGF5 基因的 T196A SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片，其特征在干，所述 ASPE引物為針對MTHFR基因的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9組成的序列及由SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 10組成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 12組成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 13組成的序列及由 SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 14組成的序列、和/或針對TOF5基因的由SEQ IDN0. 7和SEQ ID NO. 15組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 16組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片，其特征在干，(A).所述ASPE引物針對MTHFR基因的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 10組成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ IDN0. 11組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 12組成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 13組成的序列及由 SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 14組成的序列、和針對FGF5基因的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 15組成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 16組成的序列；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID N0. 17 SEQ IDN0. 24中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；(C).所述擴(kuò)增引物針對MTHFR基因的G121ASNP位點(diǎn)的SEQ ID N0. 25及SEQ IDN0. 26、針對 A105G SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0. 27 及 SEQ ID N0. 28、針對 GlllA SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0. 29 及 SEQ ID N0. 30、和針對 FGF5 基因的 T196A SNP 位點(diǎn)的 SEQ IDN0. 31 及 SEQ ID N0. 32。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片，其特征在干，所述間隔臂為5-10個(gè)T。
6.ー種MTHFR與FGF5基因SNP檢測特異性引物，其特征在于，包括有如下針對MTHFR 基因的 G121A SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0. 9 及 SEQ ID N0. 10、針對 A105GSNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID N0. 12、針對 GlllA SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID N0. 13 及 SEQ ID N0. 14、和 / 或針對 FGF5 基因的 T196A SNP 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 15 及 SEQID NO. 16。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MTHFR與FGF5基因SNP檢測特異性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物分別為針對MTHFR基因的G121A SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、針對A105G SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、針對G111A SNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或針對FGF5基因的T196ASNP位點(diǎn)的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；有anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的MTHFR與FGF5基因SNP檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％。
文檔編號C12Q1/68GK102533952SQ201010590999
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者劉志明, 秦會娟, 許嘉森, 郭婧 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司