專利名稱：抗h1n1豬流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株及抗原捕獲elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株及其抗原捕獲ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
豬流感(swine influenza，SI)是甲型(A型)流感病毒引起的豬或人的一種急 性、人畜共患呼吸道傳染性疾病。屬于正粘病毒科、A(甲)型流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA 病毒，基因組約為13. 6kb，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成。A型流感病毒包含有16種血 球凝集素蛋白(H1-H16)和9種神經(jīng)氨(糖)酸苷酶蛋白(m-N9)。目前最常見的亞型是 H1N1, H1N2和H3N2，全世界很多新的病毒變種和亞型還在不斷地被發(fā)現(xiàn)中。豬流感的臨床癥狀為體溫突然升高(40_45°C )。豬流感能造成急性上呼吸 道感染，典型特征是發(fā)熱、嗜睡、厭食、體重減輕、呼吸困難，以及流涕、噴嚏、結(jié)膜炎，后 期有咳嗽，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)。豬流感可繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染，.嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致呼吸 衰 竭(Wor1dOrganization for Animal Health
. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals[online]Paris ；0IE ；2008.Swineinfluenza. Availableat :http://www.oie. int/eng/normes/mmanual/2008/df/2. 08. 08_SWINE_ INFLUENZA, pdf. Accessed 7 Jm 2008)。某些毒株感染后，豬僅有輕微的或沒有臨床 癥狀，發(fā)病率很高但死亡率低于 -4% (Acha PN，Szyfres B(Pan American Health Organization[PAH0]). Zoonoses and communicable diseases common toman and animals. Volume 2. Chlamydiosis, rickettsioses and viroses. 3rd ed. Washington DC: PAH0 ；2003.Scientific and Technical Publication No. 580. Influenza ;p.155-72)。此 外，豬流感病毒也是豬免疫抑制的主要誘因之一，豬群感染豬流感病毒可引起豬繁殖能力 減退，育肥豬增重減慢等(Choi Y K，Goyal S M，Joo H S. Prevalence of swine influenza virus subtypeson swine farms in the united states[J]. Arch Virol,2002，147 1209-1220)。豬流感不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)人類健康造成威脅，因此研究快 速、敏感、準(zhǔn)確的豬流感診斷產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和公共衛(wèi)生意義。2009年一種新型Hmi流感病毒在人際間引起大規(guī)模流行，構(gòu)成人類健康威脅。 遺傳分析顯示，這個(gè)病毒含有豬流感的基因成分(Transmission and Reassortment of PandemicHlNl/2009 Influenza A Virus in Swine. D. Vijaykrishna, et al, SCIENCE VOL 32818JUNE 2010)。血清學(xué)調(diào)查和毒株監(jiān)測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，1999 2003年間我國(guó)東北、西北、華 中、華東、華南及西南地區(qū)等20個(gè)省、市豬群大范圍存在H3亞型流感病毒感染(李海燕，于 康震，辛?xí)怨?，?部分省市豬流感的血清學(xué)調(diào)查及豬流感病毒的分離與鑒定[J]動(dòng)物醫(yī)學(xué) 進(jìn)展，2003，24 (3) :67-72)，Sreta等研究了 Hmi和H3N2亞型(泰國(guó)分離株)對(duì)斷奶乳豬 仔豬的致病力，發(fā)現(xiàn)這2種亞型均可誘導(dǎo)流感樣癥狀和肺損傷，但Hmi亞型感染豬的肺損 傷程度比 H3N2 亞型感染豬嚴(yán)重(SRETA D, KEDK0V1D R, TUAMsANG S, et al. Pathogenesisof swineinfluenza rims (nlai isolates) in weanling pigs -.an experimental trial [J] Virol J. 2009.6(1) :34)，此病一旦暴發(fā)流行，很難將其控制和根除，因此及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè) 出SIV，對(duì)預(yù)防和控制豬流感暴發(fā)流行具有重大意義。豬流感病毒抗原檢測(cè)方法較多，到目前為止，國(guó)際上通用的豬流感抗原檢測(cè)方法 有雞胚分離、熒光RT-PCR、RT-PCR等。病毒分離耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)存在生物安全隱患；RT-PCR和 熒光RT-PCR方法對(duì)檢測(cè)設(shè)備和人員專業(yè)知識(shí)要求較高、成本大，難以在普通實(shí)驗(yàn)室和基層 開展，因此，研制一種直接檢測(cè)樣品中Him豬流感病毒的快速、便捷、適合現(xiàn)場(chǎng)使用的檢測(cè) 試劑盒具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)豬流感的防控具有重要意義。本發(fā)明制備了 Hmi豬流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，并以此單克隆抗體為 基礎(chǔ)，建立起具有高度敏感性和特異性、操作簡(jiǎn)單的ELISA檢測(cè)方法。該方法能快速、經(jīng)濟(jì)、 高通量檢測(cè)樣品中Hmi豬流感病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供特異性抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體及 分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4E7。本發(fā)明另一目的是提供體外檢測(cè)Hmi豬流感病毒 的抗原捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能對(duì)血液、組織和棉拭子等樣品中Hmi豬流感病 毒進(jìn)行特異性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性好。本發(fā)明所提供的抗Hmi豬流感血凝素蛋白單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株4E7 分泌產(chǎn)生的，該雜交瘤細(xì)胞株已于2010年12月1日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (ChinaCenter for Type Culture Collection，簡(jiǎn)稱 CCTCC)，保藏號(hào)為 CCTCC C2010121。一種檢測(cè)Hmi豬流感病毒的抗原捕獲ELISA試劑盒，包含有包被有單克隆抗 體的固相載體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體、酶的 底物反應(yīng)液、陽性和陰性對(duì)照、洗滌液和反應(yīng)終止液；所述的單克隆抗體是由保藏號(hào)為 CCTCCC2010121的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的。所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體的制備 過程如下用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組Hmi豬流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性 新西蘭兔lmg/只，皮下多點(diǎn)注射，分別在0，3，6周共免疫3次；取血清純化得抗Hmi豬流 感病毒血凝素蛋白多克隆抗體；再用辣根過氧化物酶標(biāo)記。所述的陽性對(duì)照為昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組Hmi豬流感表達(dá)血凝素蛋 白溶液，濃度為100 u g/mL,陰性對(duì)照為SPF雞胚尿囊液100倍稀釋液。一種病毒含有多種抗原，一種抗原又可能含有多個(gè)抗原表位。因此，針對(duì)一種抗原 可以獲得不止一個(gè)抗體，但這些抗體對(duì)抗原的結(jié)合特性可能是不同的。為了找到能與抗原 特異性結(jié)合的單克隆抗體，需要進(jìn)行大量的反復(fù)比較、篩選和鑒定工作。本發(fā)明通過大量的 工作，獲得了能分泌特異性結(jié)合Hmi豬流感病毒血凝素蛋白的雜交瘤細(xì)胞株4E7。并在此 基礎(chǔ)上首次制備出體外檢測(cè)Hmi豬流感病毒的抗原捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒特 異性和靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，可用于大規(guī)模Hmi豬流感病毒的臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，應(yīng)用前 景廣闊。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1、抗Hmi豬流感病毒特異性單克隆抗體的制備本發(fā)明中單克隆抗體是利用雜交瘤技術(shù)來制備的，具體如下a.動(dòng)物免疫將經(jīng)甲醛滅活的Hmi亞型豬流感病毒免疫Balb/c小鼠，進(jìn)行3次免疫。b.細(xì)胞融合分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株融合。c.陽性雜交瘤細(xì)胞株篩選加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株。d.有限稀釋法克隆化篩選利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌抗Hmi豬流感病毒 血凝素蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明得到了一株能穩(wěn)定分泌、特異性強(qiáng)的抗Him豬流感病毒血凝素蛋白的雜 交瘤細(xì)胞株，命名為4E7。e.單克隆抗體的生產(chǎn)和純化本發(fā)明采用了 2種方法進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)，一是接種小鼠腹腔的方法生產(chǎn)單 克隆抗體，用辛酸_飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，最后用ProteinG預(yù)裝層析柱純化。二是按照 常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。這2種方法均為單克隆抗體技術(shù)中常用的方法。實(shí)施例2、H1N1豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒研制一、H1N1豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒組成本發(fā)明所述Hmi豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒組成為已包被本 發(fā)明所述單克隆抗體的固相載體即酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Hmi豬流感病毒血 凝素蛋白多克隆抗體、酶的底物反應(yīng)液、陽性和陰性對(duì)照、洗滌液和反應(yīng)終止液。1) ELISA條板包被抗Hmi豬流感單克隆抗體用包被緩沖液(0.05!1101/1碳酸鹽緩沖液^11值9.6)將純化的本發(fā)明所述單克隆 抗體稀釋至濃度為10 u g/mL，包被96孔EIA/RIA高效結(jié)合酶標(biāo)板(美國(guó)Corning公司)， lOOiiL/孔，4°C過夜。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干。用PBST稀釋脫脂奶粉至 終濃度5%作為封閉液，每孔加入該封閉液100 u L，37°C封閉lh。取出后用PBST洗板3次， 每次3min，甩干，干燥后真空密封保存。25 X PBST 的配制NaCl 100. 0g, KC1 0. 2g, MCI2 6H20 2. 5g, KH2P04 5. Og, Na2HP04 28. 5g, tween-20 :12. 5mL，硫柳汞2. 5g，用蒸餾水定容至lOOOmL，加入0. 02%疊氮納作為防腐劑， 除菌過濾后分裝。2)抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體及標(biāo)記用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組Hmi豬流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性新 西蘭兔。lmg/只，皮下多點(diǎn)注射，分別在0，3，6周共免疫3次。取血清純化得抗Hmi豬流 感病毒血凝素蛋白多克隆抗體。采用“簡(jiǎn)易過碘酸鈉法”用辣根過氧化物酶標(biāo)記該多克隆 抗體。
1.稱取6mg HRP溶解于蒸餾水中。2.于上液中加入0. 2mL新鮮配制的0. lmol/L妝104溶液，室溫下避光攪拌20min。3.將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0. 00lmol/L,pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。4.加20 ii L 0. 2mol/L、pH9. 5碳酸鹽緩沖液，使溶液pH上升至9.0 9. 5，立即加 入lmL多抗(約5mg)溶液，室溫避光攪拌2h。5.加 0. lmL 新配的 4mg/mLNaBH4 液，混勻，置 4°C 2h。6.將上述液裝入透析袋中，對(duì)0. 15mol/mL pH7. 4PBS透析，4°C 2h。7.取出透析袋，置PEG8000干粉中濃縮袋內(nèi)液體至5m L，吸出，_20°C保存。3)底物采用3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(SIGMA公司)作為辣根過氧化物酶的底物。以0. 5% 過氧化脲為氧化劑。4)陽性和陰性對(duì)照陽性對(duì)照昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組Hmi豬流感病毒的血凝素蛋白，濃 度為 lOOil g/mL。陰性對(duì)照SPF雞胚尿囊液100倍稀釋液。5)洗滌液如前述PBST配制。6)反應(yīng)終止液用三蒸水配制2mol/L H2S04溶液。二、Hmi豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒的使用方法1)樣本處理組織樣本用PBS研磨，取上清備用。棉拭子樣本加入適量PBS后振蕩，離心取上清。2)加入對(duì)照和待測(cè)樣本取待測(cè)樣本100 u L加入相應(yīng)酶標(biāo)孔，陽性和陰性對(duì)照孔 分別加100 i! L陽性和陰性對(duì)照，敲擊已加樣板的一側(cè)，以確保樣品均勻覆蓋孔底。加樣后 的酶標(biāo)板置濕盒中37°C孵育lh，然后用PBST洗板3次，甩干。3)加酶標(biāo)多克隆抗體加入酶工作液(配制方法以PBST稀釋酶標(biāo)抗體，稀釋倍 數(shù)1 1000)，100 ilL/孔，濕盒中37°C孵育lh，取出后PBST洗板3次，甩干。4)加底物液顯色100 u L/孔，室溫避光5 15min。5)終止用2mol/LH2S04終止顯色反應(yīng)，50 ii L/孔。6)測(cè)450nm值酶標(biāo)板置酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm值。7)結(jié)果判定按上述方法，對(duì)42份陰性尿囊液進(jìn)行了檢測(cè)。按照公式臨界值=陰性0D平均值 +3X標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算得陰陽臨界值為0. 127。待檢樣本0D值大于0. 127的判為陽性，否則判 為陰性。實(shí)施例3Hmi豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒的特異性和敏感性測(cè) 定1)特異性測(cè)定(以下實(shí)驗(yàn)材料均經(jīng)56°C 30min滅活處理)為了驗(yàn)證本發(fā)明的Hmi豬流感病毒血凝素蛋白捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒的特異性， 按照實(shí)施例2對(duì)2株新城疫病毒樣本(1、2號(hào))、2株H3N2病毒樣本(3、4號(hào))、1株H5W病毒樣本(5號(hào))、1株H7m(6號(hào))和1株H9N2病毒樣本(7號(hào))進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，本 發(fā)明試劑盒對(duì)上述蛋白樣本的檢測(cè)0D值在0. 078 0. 116之間(表1)，顯示出良好的特異性。表1試劑盒的特異性檢測(cè)
權(quán)利要求
一種產(chǎn)生抗H1N1豬流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株保藏號(hào)為CCTCC C2010121。
2.一種抗mm豬流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體是 由保藏號(hào)為CCTCC C2010121的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的。
3.—種檢測(cè)Him豬流感病毒的抗原捕獲ELISA試劑盒，其特征在于，包含有包被有單 克隆抗體的固相載體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Hmi豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體、 酶的底物反應(yīng)液、陽性和陰性對(duì)照、洗滌液和反應(yīng)終止液；所述的單克隆抗體是由保藏號(hào)為 CCTCCC2010121的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Him 豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體的制備過程如下用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組 H1N1豬流感病毒的血凝素蛋白免疫雄性新西蘭兔lmg/只，皮下多點(diǎn)注射，分別在0，3，6周 共免疫3次；取血清純化得抗mm豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體；再用辣根過氧化物 酶標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對(duì)照為昆蟲桿狀病毒表達(dá) 系統(tǒng)表達(dá)的重組HIM豬流感表達(dá)血凝素蛋白溶液，濃度為100y g/mL，所述的陰性對(duì)照為 SPF雞胚尿囊液100倍稀釋液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗H1N1豬流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株及抗原捕獲ELISA試劑盒。該單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC C2010121的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，其效價(jià)和特異性高。研制成的抗原捕獲ELISA試劑盒包含有包被有單克隆抗體的固相載體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗H1N1豬流感病毒血凝素蛋白多克隆抗體、酶的底物反應(yīng)液、陽性和陰性對(duì)照、洗滌液和反應(yīng)終止液。該試劑盒特異性和靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，可用于大規(guī)模H1N1豬流感病毒的臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101988050SQ20101058190
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者候義宏, 唐連飛, 姜金林, 孟芳, 朱忠武, 歐陽振宇, 禹思宇, 肖家勇 申請(qǐng)人:湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心