專利名稱：枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)用微生物領(lǐng)域，具體地說涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制 備方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，抗菌肽是其中重要的一類，它們是一類具 有抗菌活性的小分子多肽(相對分子質(zhì)量通常在IXlO4D以下)，具有很強(qiáng)的抗菌活性，具 有廣譜的殺菌、抑菌活性，不僅作用于革蘭氏陽性細(xì)菌，而且也作用于真菌、昆蟲和某些病 毒和腫瘤。該類抗菌物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，對高溫、酸堿、蛋白酶均具有很好的耐受性，并且低毒、 低殘留。由于抗菌肽具有普通抗生素所不具有的一系列優(yōu)點如不易產(chǎn)生抗性突變等而成為 當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)術(shù)和應(yīng)用研究的一個熱點?？莶菅挎邨U菌目前也有作為微生物抗菌劑使用，其成份為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的 粗提物，由于雜質(zhì)較多，限制了其使用范圍，對其活性成分進(jìn)行分離提取，可以解決雜質(zhì)污 染帶來的問題，使其有效成分能更好的發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡單、快速高效分離純化枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中抗 菌肽的方法，其操作條件溫和、制備工藝合理簡單、對試劑和儀器設(shè)備要求低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。枯草芽孢桿菌能分泌對多種農(nóng)作物有害病原真菌具有抑制殺傷作用的抗菌肽。這 類抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，對蛋白酶水解的耐受力強(qiáng)，且不易產(chǎn)生耐藥性。根據(jù)以上的特 點，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的超濾濃縮將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液經(jīng)Millipore公司 的切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮，截留分子量在1000D以上的物質(zhì)。2、粗提液的制備將步驟1中所得濃縮液以6000-8000r/min離心lOmin，取上 清液并加入濃縮液2-3倍體積的乙醇，0-4°C沉淀12h ；然后再以10000-12000r/min離心 15-20min收集上清，所得上清液經(jīng)60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5_10mL，備用。3,Sephadex G-100柱層析將步驟2的濃縮液經(jīng)S印hadex G-100層析柱層析，用 去離子水進(jìn)行洗脫，流速為0. 15-0. 2mL/min，收集具有抗菌活性的洗脫峰，濃縮后備用。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明提供的方法可快速有效分離提取枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中肽類抗菌物質(zhì)，其 中膜過濾的方法自動化程度高，減少了人力成本，且不需要使用過濾劑進(jìn)行過濾，本發(fā)明的 制作方法成本低，制備工藝簡單快速，操作條件溫和，對試劑、儀器設(shè)備要求低，更適合于工 業(yè)化生產(chǎn)。分離提取得到的肽類抗菌物質(zhì)可用于煙草黑脛病、青枯病、赤星病等煙草真菌病 害的防治；同時，該肽類抗菌物質(zhì)也可做為飼料添加劑用于防治黃曲霉等真菌引起的霉變， 另外它們在抗病毒、抗腫瘤方面也具有潛在的應(yīng)用價值。


圖1是抗菌胞外產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑制作用；圖2是抗菌胞外產(chǎn)物濃縮液經(jīng)s印hadex-G 100柱層析具體實施方案枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基，在37°C，180r/ min搖床振蕩培養(yǎng)24h，得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。所述LB培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl 10g,7jC IOOOmL, ρΗ7· 2-7. 4。粗提液的制備取上述制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液經(jīng)Millipore公司的切向流超 濾系統(tǒng)超濾濃縮后(截留分子量為1000D)，以6000-8000r/min離心lOmin，取上清液并加 入濃縮液2-3倍體積的乙醇，0-4°C沉淀12h ；然后再以10000-12000r/min離心15-20min收 集上清，所得上清液經(jīng)60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5mL，備用。Sephadex G-100柱層析稱取S印hadex G-100凝膠20g，充分溶漲，常規(guī)裝柱，床 體積為200mL(9 1.6cmX100cm)，取0. 5mL濃縮液加至S印hadex G-100層析柱上，用去離 子水洗脫，流速為0. 2mL/min，用部分收集器每15min收集一管，收集30管，每管3mL。以金 黃色葡萄球菌作指示菌，采用牛津杯法檢測每管的抗菌活性(見圖1)。共獲得兩個峰(I、 II)(見圖2)，其中峰II具有抗菌活性，收集并濃縮具有抗菌的活性峰(15-19管)。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法，其特征是該抗菌胞外產(chǎn)物是通過以下 步驟制備的(1)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將枯草芽孢桿菌(Bacilliussubtilis)接種于LB培 養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；所述LB培養(yǎng)基配制方法是蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水lOOOmL，pH 7.2-7.4， 固體培養(yǎng)基需加瓊脂20g，121°C滅菌20min，備用；(2)粗提液的制備取上述制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液經(jīng)Millipore公司的切向流超 濾系統(tǒng)超濾濃縮后，以6000-8000r/min離心lOmin，取上清液并加入濃縮液2_3倍體積的 乙醇，0-4°C沉淀12h ；然后再以10000-12000r/min離心15-20min收集上清，所得上清液經(jīng) 60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5mL，備用；(3)Sephadex G-100柱層析稱取S印hadex G-100凝膠20g，充分溶漲，常規(guī)裝柱，床體 積為200mL，柱子規(guī)格1. 6cmX 100cm,取0. 5mL濃縮液加至S印hadex G-100層析柱上，用去 離子水洗脫，流速為0. 2mL/min,用部分收集器每15min收集一管，收集30管，每管3mL ；以 金黃色葡萄球菌作指示菌，采用牛津杯法檢測每管的抗菌活性，收集并濃縮具有抗菌的活 性峰。
2.如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法，其特征是步驟(1)中 所述的搖床振蕩培養(yǎng)的溫度是37°C。
3.如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法，其特征是步驟(1)中 所述的搖床振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速是180r/min。
4.如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法，其特征是步驟(1)中 所述搖床振蕩培養(yǎng)的時間是24h。
5.如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法，其特征是步驟(2)中 的切向流超濾系統(tǒng)的超濾膜孔徑為1000D。
全文摘要
本發(fā)明公開一種枯草芽孢桿菌抗菌胞外產(chǎn)物的制備方法。具體為將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液超濾濃縮，沉淀制備的粗提物經(jīng)Sephadex G-100柱層析，以金黃色葡萄球菌為指示菌檢測其抗菌活性，收集活性峰。本發(fā)明分離提純工藝具有簡單、快速、高效、操作條件溫和等特點。提取出的肽類抗菌物質(zhì)對多種煙草病原真菌具有很好的抑制效果，且具有對溫度、pH穩(wěn)定等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/125GK102102110SQ20101057773
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者夏亞穆, 宿烽, 張媛媛, 李俊峰, 李峰, 李紅芳 申請人:青島科技大學(xué)