專利名稱：豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用激流-灌注式生物反應(yīng)器與紙片載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫 苗的方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)豬呼吸與繁殖綜合征疫苗，替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗生產(chǎn)主要依靠細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)。該 傳統(tǒng)工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；不同生產(chǎn)批次間或 同一生產(chǎn)批次不同瓶間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；容易出現(xiàn)被細(xì)菌或其它病毒污染而致的 疫苗質(zhì)量隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法技術(shù)存在的不足之處，提供一種應(yīng)用 激流_灌注式生物反應(yīng)器紙片載體細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗的方法。該 方法可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境 污染少且易于處理，自動(dòng)化程度高，用人少，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定?？娠@著提高疫苗產(chǎn)量 和質(zhì)量。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案一種豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取長(zhǎng)滿單層Marc-145生產(chǎn)用細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度為35 38°C ；形成細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于激流_灌注式生物反應(yīng)器 中進(jìn)行紙片載體灌注培養(yǎng)。(2)種毒的繁殖用細(xì)胞維持液將豬呼吸與繁殖綜合征病毒種毒按體積百分比0. 1 比例接種 到步驟(1)的細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞80 90%病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為 種毒，在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID5(I檢驗(yàn)和無 菌檢驗(yàn)，傳至病毒TCID5(1穩(wěn)定且達(dá)到107_°TCID5(1/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)種毒。(3)Marc-145細(xì)胞在激流-灌注式生物反應(yīng)器中的紙片載體灌注培養(yǎng)準(zhǔn)備好激流-灌注式生物反應(yīng)器，按激流_灌注式生物反應(yīng)器總體積的70%加入 細(xì)胞生長(zhǎng)液，啟動(dòng)激流-灌注式生物反應(yīng)器，打開蠕動(dòng)泵，開始循環(huán)；取步驟(1)長(zhǎng)滿單層 的Marc-145細(xì)胞，經(jīng)胰酶液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1 X 106個(gè)/mL 3 X 106個(gè) /ml的密度接種到反應(yīng)器中，設(shè)定溫度、pH、循環(huán)速度、搖床轉(zhuǎn)速、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行激 流_灌注式生物反應(yīng)器的自動(dòng)控制培養(yǎng)。(4)制苗用毒液的繁殖間隔固定時(shí)間無菌抽取步驟(3)的細(xì)胞生長(zhǎng)液樣品，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)液中的殘?zhí)菨?度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的耗糖速率，根據(jù)細(xì)胞的耗糖速率來計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，計(jì)算細(xì)
4胞數(shù)目，當(dāng)細(xì)胞數(shù)計(jì)算結(jié)果達(dá)到3 X IO6個(gè)/mL 5 X IO6個(gè)/mL時(shí)進(jìn)行接毒操作，按0. 1 比例接入步驟(2)制備好的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒生產(chǎn)種毒，設(shè)定好溫度、pH、 循環(huán)速度、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)；接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中細(xì) 胞維持液，測(cè)定殘?zhí)?，?jì)算耗糖速率，并檢測(cè)樣品的TCID5tl ；待計(jì)算殘?zhí)橇窟_(dá)到或低于限定 值，且耗糖速率基本穩(wěn)定不變時(shí)，開始收獲病毒，收獲上清液和含有紙片載體的灌注袋。(5)收獲病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經(jīng)2 3次凍融后與收獲病毒上清混合，_20°C冷凍保存?zhèn)?用。上述技術(shù)方案中，激流_灌注式生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧、攪拌 速度等參數(shù)，適用于紙片載體灌注培養(yǎng)的激流_灌注式生物反應(yīng)器，容積為5L 2000L。上述技術(shù)方案中，紙片載體為聚酯酰胺紙片載體，紙片載體在使用前需預(yù)處理，方 法如下1)用無菌PBS (磷酸鹽緩沖液)浸泡紙片載體過夜；2)用無菌PBS (磷酸鹽緩沖液) 循環(huán)清洗紙片載體3遍；3)用細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)液浸泡紙片載體2小時(shí)。上述技術(shù)方案中，所述的胰酶消化液配方為質(zhì)量份數(shù)為0. 25%的胰酶溶液(規(guī) 格為1 250)；細(xì)胞生長(zhǎng)液配方為體積百分含量為90% 92% DMEM液、8% 10%牛血 清、1 %的雙抗(青霉素和鏈霉素混合溶液)，1 %的谷氨酰胺，pH為7. 2 7. 6。上述技術(shù)方案中，種毒接種量為體積百分比0. 1 1%，用于病毒培養(yǎng)的細(xì)胞維持 液配方為含體積百分含量1 4%血清的DMEM液、加的雙抗(青霉素和鏈霉素混合溶 液)，PH調(diào)整為7. 2 7. 8。培養(yǎng)溫度為35 38°C。上述技術(shù)方案中，激流-灌注式生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度33 38°C、 pH7. 0 7. 8、溶氧30% 80%、循環(huán)速度為50 150rpm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)用“激流-灌注式生物反應(yīng)器紙片載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)”代替“轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技 術(shù)”制造豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低 的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改變，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。(2)本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5 6天， 相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法的6 7天以上明顯縮短。(3)應(yīng)用激流_灌注式生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動(dòng)化程度高，用人少，生 產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定。易操作、產(chǎn)量大占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。(4)應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，產(chǎn)品病毒效價(jià)比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法提高10 20倍， 成本降低3 4倍。產(chǎn)品質(zhì)量均一，易于規(guī)?；a(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)工藝過程不涉及傳統(tǒng)生產(chǎn)方 法所具有的其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。(5)該生物反應(yīng)器應(yīng)用新型一次性培養(yǎng)用耗材，減少了罐體式生物反應(yīng)器的清洗、 滅菌等復(fù)雜的工藝環(huán)節(jié)和工藝配套設(shè)施的安裝，具有節(jié)約能耗，減少污染、占地空間小、對(duì) 配套設(shè)施要求低等優(yōu)點(diǎn)。(6)應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，所采用的紙片載體具有無污染，生物安全性高，細(xì)胞生 長(zhǎng)密度大，使用后處理方便，無環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)。


圖1為本發(fā)明的制備流程圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說明書附圖及具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。(1)選擇激流-灌注式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)的手段IOL激流-灌注式生物反應(yīng)
ο(2)選擇紙片載體作為細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的載體聚酯酰胺紙片載體。(3)紙片載體的預(yù)處理方法1)用無菌PBS浸泡紙片載體過夜；2)用無菌PBS循 環(huán)清洗紙片載體3遍；3)用細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)液浸泡紙片載體2小時(shí)以上。(4)選擇Marc-145細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞。(5)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)。上述細(xì)胞經(jīng)胰酶消化液消化傳代，以含10%牛血清、雙抗(青霉素和鏈霉素混 合溶液)，PH調(diào)整為7. 2的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。形成良好單層時(shí)，用于 繼續(xù)傳代或接種于激流_灌注式生物反應(yīng)器中進(jìn)行紙片載體灌注培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)液的組成(或配方)為含體積百分比10%牛血清、雙抗(青霉素和 鏈霉素混合溶液)的DMEM，pH調(diào)整為7. 2。(6)細(xì)胞種毒的繁殖用細(xì)胞維持液，將豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒種毒按比例接種生長(zhǎng)良好的 上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C。至細(xì)胞80%以上病變時(shí)收獲病毒液；測(cè)定病毒 的TCID5tl，待病毒效價(jià)穩(wěn)定且達(dá)到107_°TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，將該病毒作為生產(chǎn)用種細(xì)胞維持液的組成(或配方)為含體積百分比2%牛血清、雙抗(青霉素和 鏈霉素混合溶液)的DMEM，pH調(diào)整為7. 2。(7)Marc-145細(xì)胞在激流-灌注式生物反應(yīng)器中的紙片載體灌注培養(yǎng)取轉(zhuǎn)瓶上生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞，經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì) 胞計(jì)數(shù)后按3 X IO6個(gè)/mL的密度接種反應(yīng)器中。激流-灌注式生物反應(yīng)器設(shè)定如下參數(shù) 溫度37°C、pH 7. 2、溶氧含量50%、循環(huán)速度150rpm進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。(8)制苗毒液的繁殖培養(yǎng)后第二日取樣測(cè)糖，計(jì)算耗糖速率。當(dāng)耗糖速率不再增加，且糖耗速率不再變 化時(shí)可行接毒操作。設(shè)定溫度37°C、pH7. 6、循環(huán)速度120rpm、溶氧含量50%等培養(yǎng)參數(shù)， 進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)。接毒后每隔4小時(shí)取反應(yīng)器中細(xì)胞維持液，測(cè)定糖耗，計(jì)算糖耗 速率。當(dāng)耗糖速率不再增加，且細(xì)胞維持液中殘?zhí)橇拷抵?.0g/L以下時(shí)收獲。分別收獲上 清液和紙片載體。(9)收獲病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經(jīng)3次凍融后與收獲病毒上清混合，-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于以激流_灌注式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)工具；以聚酯酰胺紙片載體作為細(xì)胞貼附的生長(zhǎng) 載體；以Marc-145細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞；包括如下步驟(1)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)取長(zhǎng)滿單層Marc-145生產(chǎn)用細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化液消化傳代，以細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度為35 38°C ；形成細(xì)胞單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種于激流_灌注式生物反應(yīng)器中進(jìn) 行紙片載體灌注培養(yǎng)；(2)種毒的繁殖用細(xì)胞維持液將豬呼吸與繁殖綜合征病毒種毒按體積百分比0. 1 比例接種到步 驟(1)的細(xì)胞單層繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞80 90%病變時(shí)收獲病毒液；再將此病毒液作為種 毒，在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)傳代復(fù)壯，每次傳代產(chǎn)物進(jìn)行病毒TCID5(I檢驗(yàn)和無菌 檢驗(yàn)，傳至病毒TCID5(I穩(wěn)定且達(dá)到107_°TCID5(l/mL以上時(shí)停止復(fù)壯，作為生產(chǎn)種毒；(3)Marc-145細(xì)胞在激流-灌注式生物反應(yīng)器中的紙片載體灌注培養(yǎng)準(zhǔn)備好激流_灌注式生物反應(yīng)器，按激流_灌注式生物反應(yīng)器總體積的70 %加入細(xì) 胞生長(zhǎng)液，啟動(dòng)激流-灌注式生物反應(yīng)器，打開蠕動(dòng)泵，開始循環(huán)；取步驟(1)長(zhǎng)滿單層的 Marc-145細(xì)胞，經(jīng)胰酶液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1 X 106個(gè)/mL 3X 106個(gè) /ml的密度接種到反應(yīng)器中，設(shè)定溫度、pH、循環(huán)速度、搖床轉(zhuǎn)速、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行激 流_灌注式生物反應(yīng)器的自動(dòng)控制培養(yǎng)；(4)制苗用毒液的繁殖間隔固定時(shí)間無菌抽取步驟(3)的細(xì)胞生長(zhǎng)液樣品，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)液中的殘?zhí)菨舛龋?計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的耗糖速率，根據(jù)細(xì)胞的耗糖速率來計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，計(jì)算細(xì)胞 數(shù)目，當(dāng)細(xì)胞數(shù)計(jì)算結(jié)果達(dá)到3 X 106個(gè)/mL 5 X 106個(gè)/mL時(shí)進(jìn)行接毒操作，按0. 1 1 % 比例接入步驟(2)制備好的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒生產(chǎn)種毒，設(shè)定好溫度、pH、循環(huán) 速度、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)，進(jìn)行反應(yīng)器自動(dòng)控制培養(yǎng)；接毒后每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中細(xì)胞維 持液，測(cè)定殘?zhí)?，?jì)算耗糖速率，并檢測(cè)樣品的TCID5(i ；待計(jì)算殘?zhí)橇窟_(dá)到或低于限定值，且 耗糖速率基本穩(wěn)定不變時(shí)，開始收獲病毒，收獲上清液和含有紙片載體的灌注袋；(5)收獲病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經(jīng)2 3次凍融后與收獲病毒上清混合，-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于采 用的激流-灌注式生物反應(yīng)器為能夠自動(dòng)控制溫度、pH、溶氧等參數(shù)，適用于紙片載體灌注 培養(yǎng)的激流_灌注式生物反應(yīng)器，容積為5L 2000L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于紙 片載體為聚酯酰胺紙片載體，紙片載體在使用前需預(yù)處理，方法如下1)用無菌PBS浸泡紙 片載體過夜；2)用無菌PBS循環(huán)清洗紙片載體3遍；3)用細(xì)胞生長(zhǎng)液浸泡紙片載體2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所 述的胰酶消化液配方為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰酶溶液；細(xì)胞生長(zhǎng)液配方為體積百分 含量90 % 92 %的DMEM液、8 % 10 %的牛血清、1 %的雙抗，1 %的谷氨酰胺，pH為7. 2 7. 6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所 述的生產(chǎn)種毒接種量為體積百分比0. 1 1%，用于病毒培養(yǎng)的細(xì)胞維持液配方為為含血 清體積百分含量1 4%的DMEM液、加入占細(xì)胞維持液體積的雙抗，pH調(diào)整為7. 2 7. 8;培養(yǎng)溫度為35 38°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所 述的激流-灌注式生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)為培養(yǎng)溫度33 38°C、pH7. 0 7. 8、溶氧30% 80%、循環(huán)速度為50 150rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用激流-灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞生產(chǎn)豬呼吸與繁殖障礙綜合征(豬藍(lán)耳病)病毒的生產(chǎn)工藝，包括如下技術(shù)步驟1)選擇Marc-145細(xì)胞作為制苗用細(xì)胞；2)Marc-145細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)；3)生產(chǎn)毒種的繁殖；4)Marc-145細(xì)胞在激流-灌注式生物反應(yīng)器中紙片載體上的灌注培養(yǎng)；5)豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒在激流-灌注式生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)；6)收獲病毒抗原液的處理。本發(fā)明可大幅降低生產(chǎn)成本，提高投入產(chǎn)出比10倍以上。且生產(chǎn)準(zhǔn)備周期短，占用場(chǎng)地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動(dòng)化程度高，用人少，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102002482SQ20101057737
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者丁光星, 徐宏軍 申請(qǐng)人:成都天邦生物制品有限公司