專利名稱：一種具有防腐功能的紫紅曲菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種紫紅曲菌。
背景技術(shù)：
在肉制品加工領(lǐng)域，亞硝酸鈉是應(yīng)用最為廣泛的食品添加劑，其具有防腐劑及增 色劑的作用，廣泛用于熟肉類、灌腸類及罐頭等動(dòng)物性食品。但是亞硝酸鈉具有毒性，它能 將血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使其失去運(yùn)輸氧的能力而引起組織缺氧性 損害，人體攝入0. 2 0. 5g即可引起食物中毒，3g即可致死。并且，亞硝酸鈉在一定條件下 會(huì)生成亞硝酸胺，而亞硝酸胺則是致癌物質(zhì)。因此，食品加工過程中亞硝酸鈉的用量及殘留 量受到嚴(yán)格控制。為了提高肉制品的品質(zhì)，人們還會(huì)添加一些輔料及其它添加劑，這些都可 能影響產(chǎn)品的顏色。隨著人們健康意識(shí)的不斷提高，人們尋求天然、安全與高效的防腐劑及 增色劑的愿望也越來越強(qiáng)烈，同時(shí)這也是食品添加劑領(lǐng)域所面臨的十分重要和急待解決的 問題。紫紅曲菌(Monascus purpureas)早在《本草綱目》中對(duì)其藥用保健作用就有記 載。在現(xiàn)代食品加工領(lǐng)域中，國內(nèi)外對(duì)紅曲菌的研究與應(yīng)用大多集中在傳統(tǒng)的釀酒、制醋與 著色劑領(lǐng)域。紅曲菌是目前世界上唯一生產(chǎn)食用色素的微生物，紅曲色素即是紅曲菌在生 長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的紅色天然色素。利用紫紅曲菌(Monascus purpureas)經(jīng)液態(tài)深層發(fā) 酵提取精致而成的紅曲是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑，紅曲中含 有糖化酶、蛋白酶，最常用于生產(chǎn)紅豆腐乳、含有少量降膽固醇的紅曲米粉及其他保健食品 等。目前，將紫紅曲菌用于食品著色已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可，也是其主要應(yīng)用方向。但其抑菌 防腐作用卻少有報(bào)道，這主要是因?yàn)樽霞t曲菌雖有抑菌功能，但抑菌效果較弱。由此可見， 如果能夠獲得一株抑菌效果好的紫紅曲菌，應(yīng)用到傳統(tǒng)肉制品等相關(guān)食品加工中，進(jìn)而在 減少亞硝酸鈉的用量的同時(shí)，起到著色劑和防腐劑雙重作用，將成為食品添加劑領(lǐng)域的一 項(xiàng)重大突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫紅曲菌菌株，其在保持了原有著色功能的同時(shí)，具有 良好的抑菌防腐功能，對(duì)食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制效果，同 時(shí)具有純天然、安全性高、對(duì)人體沒有危害的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為生物防腐劑在食品防腐領(lǐng)域中 的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)， 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4174。本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)屬于子囊菌門(Ascomycota) 真子囊菌綱(Euascomecetes)散子囊菌目(Eurotiales)紅曲菌科(Monascaceae)紅曲菌 屬(Monascus)，通過對(duì)食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，結(jié) 果表明紫紅曲菌W5S7對(duì)上述幾種菌均有明顯的抑制作用。
本發(fā)明紫紅曲菌W5S7是從克東腐乳中分離、純化后，經(jīng)微波輻照誘變技術(shù)進(jìn)行誘 變篩選得到。本發(fā)明紫紅曲菌W5S7在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上菌落生長(zhǎng)較慢，25°C紫外 照射黑暗培養(yǎng)7天菌落直徑18 20mm，黃褐色，有皺褶，表面叢卷毛狀，氣生菌絲少量菌 落背面黃褐色，無水溶性色素。菌絲光滑，多分枝，具分隔，寬2. 5 5.0 μ m，有脂滴。無性 孢子大量生產(chǎn)，近球形，基部平截，壁光滑或略粗糙，5. 5 9. 0 μ m，生于非特化的側(cè)生小梗 或菌絲頂端。閉囊殼大量形成，白色至黃褐色，單生于類似菌絲的短柄上，直徑22 50 μ m, 子囊早期消解，子囊孢子卵圓形、近球形，壁光滑，4. 4-5. 8X4. 2-4. 7 μ m。本發(fā)明紫紅曲菌 W5S7可在PDA培養(yǎng)基和查氏合成培養(yǎng)基上可以很好的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，其中最適培養(yǎng)基為 PDA培養(yǎng)基。將本發(fā)明紫紅曲菌W5S7的發(fā)酵液以5000r/min的速度離心20min，保留發(fā)酵上清 液，將沉淀與95%乙醇混合，在超聲波振蕩器頻率為IOkHz時(shí)提取60min，再將提取液離心 分離，重復(fù)三次；將乙醇提取液與發(fā)酵上清液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在轉(zhuǎn)數(shù)80r/min、蒸 發(fā)溫度60°C的條件下濃縮至原體積1/4，將濃縮液置于80°C鼓風(fēng)干燥箱中，干燥至恒重，研 磨成粉末，即制得紫紅曲菌W5S7粉劑。本發(fā)明制成的紫紅曲菌W5S7粉劑具有制作簡(jiǎn)單、性 質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)屬于紅曲菌屬(Monascus)， 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究所，保藏日期為2010年9月16日，保藏號(hào)為CGMCC No.4174。


圖1為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株在固體培養(yǎng)基上的 菌落形態(tài)圖。圖2為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)菌株的分生孢子形態(tài)圖。圖3為本發(fā)明紫紅曲菌W5S7 (Monascus purpureus W5S7)菌株的菌絲與分生孢子 形態(tài)圖。圖4為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對(duì)枯草芽胞桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖。圖5為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對(duì)酵母菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖6為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對(duì)大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖7為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲菌W5S7防腐劑對(duì)白色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖。圖8為用不同濃度紫紅曲菌W5S7防腐劑水溶液處理后的熟五花肉。圖9為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲霉菌W5S7與Genbank中收錄的相近菌株所構(gòu)建 的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖10為具體實(shí)施方式
一中紫紅曲霉菌W5S7與現(xiàn)有相近似菌株的基因比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7 (Monascuspurpureus W5S7)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4174。本實(shí)施方式的紫紅曲菌W5S7是從克東腐乳中分離、純化后，經(jīng)微波輻照誘變技術(shù) 進(jìn)行誘變篩選得到。具體步驟如下(一)菌種的分離純化用接種針挑取小塊腐乳外皮， 在查氏合成培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離，28 30°C恒溫培養(yǎng)5 6d，觀察菌落生長(zhǎng)，將紅色 或紫色的菌落作為初篩菌落；將初篩菌落接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在28 30°C恒溫純化 培養(yǎng)；(二)菌種的微波誘變及選育將純化后的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫 培養(yǎng)7d，用無菌生理鹽水將孢子洗滌下來，倒入裝有已滅菌玻璃珠的三角瓶中，震蕩將孢子 打散，濾去菌絲體，得到的孢子懸液，并用無菌水調(diào)整孢子濃度IO5個(gè)/mL ；將IOmL孢子懸液 移入無菌試管內(nèi)，并將試管置于微波裝置中，微波頻率2450MHz，輻照功率100 800W (間隔 100W)；輻照時(shí)間10 150S(間隔IOs)的條件下對(duì)孢子懸液進(jìn)行輻照。對(duì)輻照后孢子懸液 進(jìn)行倍比稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)3d，記錄總菌落數(shù)和存活菌落數(shù)，計(jì) 算致死率和突變率，確定最佳誘變條件為微波功率500W，輻照時(shí)間70s ；(三)初篩將輻 照后孢子懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)，7 IOd后觀察菌落形態(tài)差異，選取顏 色變化較大的菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)7d,用無菌水洗滌孢子，分別制 得孢子懸液，進(jìn)行復(fù)篩備用；(四)復(fù)篩分別將初篩到的紅曲霉菌孢子懸液吸取10mL，接 種于150mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)數(shù)200r/min的條件培養(yǎng)14d，根據(jù) 《GB4926-2008食品添加劑紅曲米粉》國標(biāo)中色價(jià)的測(cè)定方法一分光光度法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行 檢測(cè)，在波長(zhǎng)為505nm處，測(cè)得發(fā)酵液吸光度值最大的即為抑菌物質(zhì)產(chǎn)量最高菌株，選定為 紫紅曲菌W5S7菌株。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉60，黃豆粉5，葡萄糖3，NaN034， 酵母粉 5，ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。將本發(fā)明紫紅曲菌W5S7的孢子濃度為IO5的菌懸液按體積比5%接種于液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 30°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180r/min，培養(yǎng)基初始pH4. 5，培養(yǎng)14d后得到 液態(tài)發(fā)酵液。將發(fā)酵液在5000r/min的條件下離心20min，保留上清液，將沉淀與95%乙醇 混合，在超聲波振蕩器頻率為IOkHz提取60min，再將提取液離心分離，重復(fù)三次。將發(fā)酵 上清液與乙醇提取液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中轉(zhuǎn)數(shù)80r/min，蒸發(fā)溫度60°C時(shí)，濃縮至原體積 1/4，將濃縮液置于80°C鼓風(fēng)干燥箱中，干燥至恒重，研磨成粉末，即制成紫紅曲菌W5S7防 腐劑粉劑。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉60，黃豆粉5，葡萄糖3，NaN034，酵母粉5， ZnSO4O. 2，MgSO4I, K2HP035。本發(fā)明對(duì)紫紅曲菌W5S7防腐劑粉劑進(jìn)行了抑菌性試驗(yàn)，試驗(yàn)選取大腸桿菌、白 色葡萄球菌、枯草芽孢、霉菌、酵母菌作為指示菌。用移液管分別吸取預(yù)先培養(yǎng)的濃度均 為IO5 IO6CfuAiL的大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、白色葡萄球菌、酵母菌及青霉菌的菌液各 0. 5mL，分別均勻涂布的在平板培養(yǎng)基上，將已滅菌的中性濾紙片(直徑為6mm)貼在涂布菌 液的平板培養(yǎng)基上。其中，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌及白色葡萄球菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基； 青霉菌采用PDA培養(yǎng)基；酵母菌采用麥芽汁培養(yǎng)基。取紫紅曲菌W5S7防腐劑粉劑2g溶于 IOOmL 95%乙醇溶液中，用微量進(jìn)樣器取紫紅曲菌W5S7防腐劑乙醇溶液10 μ L滴加到濾紙 片上，同時(shí)以滴加95%乙醇的中性濾紙片做空白對(duì)照，細(xì)菌37°C培養(yǎng)24h，酵母菌28°C培養(yǎng) 24h，青霉菌28°C培養(yǎng)48h，測(cè)量抑菌圈直徑大小并計(jì)算抑菌率，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。其中 抑菌率的計(jì)算公式為
抑菌率=(抑菌圈直徑-濾紙片直徑)/濾紙片直徑X 100%表1紫紅曲菌W5S7防腐劑對(duì)指示菌的抑菌效果
權(quán)利要求
一種具有防腐功能的紫紅曲菌，其為紫紅曲菌W5S7(Monascus purpureus W5S7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.4174。
全文摘要
一種具有防腐功能的紫紅曲菌。屬于微生物領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種紫紅曲菌菌株，其在保持了原有著色功能的同時(shí)，具有良好的抑菌防腐功能，對(duì)食品中常見的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制效果。本發(fā)明具有防腐功能的紫紅曲菌為紫紅曲菌W5S7(MonascuspurpureusW5S7)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.4174。本發(fā)明為生物防腐劑在食品防腐領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101988037SQ20101052997
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者徐偉 申請(qǐng)人:哈爾濱商業(yè)大學(xué)