專(zhuān)利名稱(chēng)：一種內(nèi)切葡聚糖酶的突變體及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶的突變體及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
內(nèi)切葡聚糖酶(1，4_β -D-endoglucanase，EC 3. 2. 1. 4)可從內(nèi)部隨機(jī)作用于纖維素長(zhǎng)鏈中連接葡萄糖單元的β_1，4-糖苷鍵，生成長(zhǎng)短不一的葡萄糖鏈。如將該酶與外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶共同作用，則可將纖維素進(jìn)一步降解成葡萄糖或其他易于被進(jìn)一步加工轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，最后生成高附加值的生物技術(shù)產(chǎn)品。因此，內(nèi)切葡聚糖酶在生物能源、食品加工、造紙、洗滌等工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。嗜熱菌來(lái)源的酶產(chǎn)品較之其他酶蛋白，不僅具有較高溫度穩(wěn)定性能，且往往同時(shí)兼具其他抗逆性能。也因此，嗜熱來(lái)源的蛋白的應(yīng)用和其適應(yīng)機(jī)理在近幾十年都是世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。但目前嗜熱菌(》700C )來(lái)源的纖維素酶往往酶的活力或產(chǎn)量較低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。所以，除了進(jìn)一步篩選嗜熱來(lái)源的纖維素酶、提高中溫菌來(lái)源的纖維素酶的熱活力，也可以將嗜熱菌來(lái)源的纖維素酶作為蛋白質(zhì)工程改造的出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)等方法，可提高酶蛋白水解的效率。當(dāng)酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系尚不明確的情況下，篩選隨機(jī)突變文庫(kù)獲得相關(guān)突變體，也有助于增加對(duì)該酶及其相近酶蛋白催化機(jī)理、穩(wěn)定性等方面的認(rèn)識(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為人工合成，命名為celA-mut(3F-6)或celA-mut (C3-13)， 是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中的序列2或序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。所述序列2或序列4均由380個(gè)氨基酸組成，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白質(zhì)的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性蛋白所示的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至
3少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性蛋白所示的DNA分子。所述序列1或序列3均由1143個(gè)核苷酸組成，所述序列1的編碼區(qū)為自5’末端第1-1143位核苷酸，所述序列3的編碼區(qū)為自5’末端第1-1143位核苷酸。含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重組病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為將所述編碼基因插入載體pET28a的BamHI和B10I識(shí)別位點(diǎn)間得到的重組載體。擴(kuò)增所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列7所示，另一條引物序列如序列表中序列8所示。所述蛋白質(zhì)、所述編碼基因、所述重組載體在降解纖維素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述纖維素為羧甲基纖維素鈉。所述降解的溫度為75°C，pH值為6. 5。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的所獲得的內(nèi)切葡聚糖酶的突變體比之野生型在比活力上有所提高，維持最適反應(yīng)溫度(75°C)的同時(shí)具有較寬廣的工作溫度范圍，因此具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、內(nèi)切葡聚糖酶突變體及其編碼基因的獲得1、提取騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌保藏中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 1. 2430, AS 1. 2430T = JCM11007T) 的基因組 DNA 并以其為模板，以 5，-CGCGGATCCATGAATAAATGGTATGC-3，(forward)(序列 7) and 5，-CCGCTCGAGTTACTTTCCTCTTGCCTCAC-3，(reverse)(序列 8).為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增條件如下先95°C預(yù)變性％iin，然后95°C 45s, 55°C 30s, 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸IOmin0回收上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果獲得1143bp的條帶。2、含有內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的重組菌的獲得將上述1獲得的PCR產(chǎn)物用BamHI和BioI雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的 pET28a載體(購(gòu)自!Iomega公司)用T4連接酶4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌。提取重組菌的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序分析，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為celA，其核苷酸序列為序列表的序列5，通過(guò)比對(duì)，其為騰沖嗜熱厭氧菌的內(nèi)切葡聚糖酶celA的基因，該基因編碼的蛋白命名為CelA，其氨基酸序列為序列6，該質(zhì)粒為將序列表中的序列5插入pET28a載體的BamHI和BioI酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為 pET28a-celA。在這一基因的基礎(chǔ)上，利用易錯(cuò)PCR的方法，構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)。主要是通過(guò)改變PCR擴(kuò)增體系中錳離子的濃度，提高Taq DNA聚合酶的錯(cuò)配率，從而在基因序列中引入突變。共進(jìn)行三輪突變文庫(kù)構(gòu)建1)模板為pET28a_celA，PCR擴(kuò)增體系中錳離子的濃度為0. 15mM,引物5，-CGC GGATCCATGAATAAATGGTATGC-3‘ (forward)(序列 7) and 5’ -CCGCTCGAGTTACTTTCCTCTTGCCT CAC-3’ (reverse)(序列8)，其余均為常規(guī)條件，得到第一輪PCR產(chǎn)物，將上述第一輪PCR 產(chǎn)物BamHI和BioI雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的pET28a載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 BL2KDE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌。篩選重組菌，篩選方法為剛果紅底物平板法。具體來(lái)說(shuō)是在相應(yīng)的抗生素平板上生成大腸桿菌轉(zhuǎn)化子之后，將其逐一挑入含有內(nèi)切葡聚糖酶底物(CMC)的平板上(胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，CMC 2g/L，瓊脂 15g/L，另外分別添加抗生素卡那霉素至50 μ g/mL，誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0. ImM)。37°C培養(yǎng)約1 后生成菌落若干，將篩選平板正置于75°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一定時(shí)間后取出，直接在平板上傾倒0.1% (質(zhì)量百分含量)剛果紅染液少許。室溫靜止IOmin后就可以見(jiàn)活性克隆周?chē)膳c背景紅色形成一定反差的黃色水解圈。一般來(lái)說(shuō)，水解圈的直徑越大，克隆的內(nèi)切葡聚糖酶水解活力越大。挑選6個(gè)水解圈直徑最大的克隆提取質(zhì)?；旌?。2)將混合的質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增體系中錳離子的濃度為0. 20mM，引物5'-CGC GGATCCATGAATAAATGGTATGC-3，(forward)(序列 7) and 5，-CCGCTCGAGTTACTTTCCTCTTGCCTC AC-3’ (reverse)(序列8)，其余均為常規(guī)條件，得到第二輪PCR產(chǎn)物，按照1)的方法處理篩選得到水解圈直徑最大的克隆，提取質(zhì)粒送去測(cè)序。結(jié)果為該質(zhì)粒含有的第二輪PCR產(chǎn)物，第二輪PCR產(chǎn)物的基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄? 所示的DNA分子，序列1有1143個(gè)核苷酸組成，其編碼區(qū)為序列1自5’末端第1-1143位核苷酸，將該基因命名為celA-mut(3F-6)，該基因編碼的蛋白命名為celA-mut (3F-6)，該蛋白有380個(gè)氨基酸組成，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2所示。該質(zhì)粒為將序列1插入到pET28a的BamHI和BioI酶切位點(diǎn)得到的載體，命名為pET28a_celA (3F6)。3)以pET28a_celA(3F6)為模板，PCR擴(kuò)增體系中錳離子的濃度為0. 25mM,引物 5 ‘ -CGCGGATCCATGAATAAATGGTATGC-3 ‘ (forward)(序列 7) and 5，-CCGCTCGAGTTACTTTCCTCT TGCCTCAC-3’ (reverse)(序列8)，其余均為常規(guī)條件，得到第三輪PCR產(chǎn)物，按照1)的方法處理篩選得到水解圈直徑最大的克隆，提取質(zhì)粒送去測(cè)序。結(jié)果為該質(zhì)粒含有的第三輪PCR產(chǎn)物，第三輪PCR產(chǎn)物的基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄? 所示的DNA分子，序列3由1143個(gè)核苷酸組成，其編碼區(qū)為序列3自5’末端第1-1143位核苷酸，將該基因命名為celA-mut(C3-i;3)，該基因編碼的蛋白命名為celA-mut (C3-13)， 該蛋白有380個(gè)氨基酸組成，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列4所示。該質(zhì)粒為將序列3插入到pET28a的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)得到的載體，命名為pET28a-celA(C3_13)。與未突變的騰沖嗜熱厭氧菌的內(nèi)切葡聚糖酶celA的基因(核苷酸序列為序列5， 氨基酸序列為6)相比，突變后的CelA-mut(3F6)核苷酸突變位點(diǎn)為將序列5的第37位的 A突變?yōu)樾蛄?的第37位的G，序列5的第593位的A突變?yōu)樾蛄?的第593位的G，序列 5的第653位的A突變?yōu)樾蛄?的第653位的G，序列5的第746位的T突變?yōu)樾蛄?的第 746位的C。突變后的CelA-mut(3F-6)氨基酸突變位點(diǎn)為序列6的第13位的異亮氨酸突變?yōu)樾蛄?的第13位的纈氨酸，序列6的第198位的天冬氨酸突變?yōu)樾蛄?的第198位的甘氨酸，序列6的第218位的天冬氨酸突變?yōu)樾蛄?的第218位的甘氨酸，序列6的第249 位的纈氨酸突變?yōu)樾蛄?的第249位的丙氨酸；
突變后的celA-mut (C3-13)核苷酸突變位點(diǎn)為將序列5的第27位的T突變?yōu)樾蛄?3的第27位的C，將序列5的第37位的A突變?yōu)樾蛄?的第37位的G，將序列5的第75位的T突變?yōu)樾蛄?的第75位的C，將序列5的第593位的A突變?yōu)樾蛄?的第593位的G， 將序列5的第620位的A突變?yōu)樾蛄?的第620位的G，將序列5的第653位的A突變?yōu)樾蛄?的第653位的G，將序列5的第746位的T突變?yōu)樾蛄?的第746位的C，將序列5的第 800位的A突變?yōu)樾蛄?的第800位的G，將序列5的第961位的A突變?yōu)樾蛄?的第961 位的G，將序列5的第965位的A突變?yōu)樾蛄?的第965位的G ；突變后的celA-mut (C3-13) 氨基酸突變位點(diǎn)為序列6的第13位的異亮氨酸突變?yōu)樾蛄?的第13位的纈氨酸，序列6的第198位的天冬氨酸突變?yōu)樾蛄?的第198位的甘氨酸，序列6的第207位的谷氨酰胺突變?yōu)樾蛄?的第207位的絲氨酸，序列6的第218位的天冬氨酸突變?yōu)樾蛄?的第218位的甘氨酸，序列6的第249位的纈氨酸突變?yōu)樾蛄?的第249位的丙氨酸，序列6的第267 位的賴(lài)氨酸突變?yōu)樾蛄?的第267位的精氨酸，序列6的第321位的異亮氨酸突變?yōu)樾蛄?4的第321位的纈氨酸，序列6的第322位的谷氨酰胺突變?yōu)樾蛄?的第322位的絲氨酸。4、含有突變體的重組菌的獲得人工合成序列1，以合成的序列1的DNA分子為模板，引物5’-CGCGGATCCATGAATAA ATGGTATGC-3，(forward)(序列 7) and 5，-CCGCTCGAGTTACTTTCCTCTTGCCTCAC-3，(reverse) (序列8)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)BamHI和BioI雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的pET28a載體(購(gòu)自Promega公司)連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 的感受態(tài)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列1插入到pET28a的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將命名為pET28a-celA_mut (3F-6)， 將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為BL21 (DE3) /pET28a-celA-mut (3F6)；人工合成序列3，以合成的序列3的DNA分子為模板，引物5，-CGCGGATCCATGAATAA ATGGTATGC-3，(forward)(序列 7) and 5，-CCGCTCGAGTTACTTTCCTCTTGCCTCAC-3，(reverse) (序列8)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)BamHI和BioI雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的pET28a載體(購(gòu)自Promega公司)連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 的感受態(tài)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列3插入到pET28a的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將命名為pET28a-celA_mut (C3-13)， 將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為BL21 (DE3)/pET28a-celA-mut(C3-13)。采用同樣的方法將突變前的內(nèi)切葡聚糖酶celA的編碼序列(序列幻連接到 pET28a上，并轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)中得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列5插入到pET28a的BamHI和B10I酶切位點(diǎn)間得到的載體。含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為 BL21 (DE3)/pET28a-celA0實(shí)施例2、突變后的內(nèi)切核酸酶的獲得一、利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶突變體1、表達(dá)將上述獲得的BL21 (DE3)/pET28a-celA-mut(3F6)、BL21 (DE3)/ pET28a-celA-mut(C3-13)的單菌落分別接種至含有卡那霉素(終濃度為50 μ g/ml)的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。1 后將發(fā)酵液按照的接種量轉(zhuǎn)接至IOOOml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D_達(dá)到0. 6，再在培養(yǎng)基中加入無(wú)菌的IPTG，使IPTG在培養(yǎng)基中
6的終濃度為ImM進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵。證后結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液5000rpm離心IOmin收集菌體。將菌體重懸于50ml濃度為20mM的純化緩沖液(將NaCl溶于20mM的Tris-HCl緩沖液，該NaCl在Tris-HCl緩沖液的終濃度為0. 15M)，該緩沖液的pH為7. 9，F(xiàn)renchpress 破壁(l，00Mpa，3次)，離心(15，700g，4°C，10min)去除細(xì)胞碎片，棄之。將破壁上清置于72 °C水浴中熱處理20min，隨后離心(15，700g, 4 V，IOmin)，分別收集上清液，得到 celA-mut(3F6)禾口 celA-mut(C3-13)。2、純化分別將上述的上清液(celA-mut(3F6)和celA-mut (C3-13))經(jīng)超濾離心過(guò)濾器 (Amicon Ultra-15Centrifugal Filter devices)(分子重量阻斷值 IOkDa) (Millipore， USA)超濾濃縮、并經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾后，用Superdex 7510/300GL (購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品編號(hào)17-5174-01)分子篩純化，分別收集約Hmin時(shí)的蛋白峰，superdex75分子篩純化的條件為純化緩沖液:20mMρΗ7· 9Tri s_HCl，0. 15M NaCl ；純化流速0.%il/min。為提高純化效果，蛋白經(jīng)兩次連續(xù)分子篩純化。分別將經(jīng)Superdex 7510/300GL分子篩純化的蛋白用同一蛋白純化柱脫鹽，收集蛋白峰，得到純化的celA-mut(3F6)和celA-mut (C3_i;3)，記作純化酶液(3F6)和純化酶液 (C3-13)，脫鹽條件為脫鹽緩沖液IOOmMNa2HPO4-NaH2PO4 ；脫鹽流速0.%il/min。采用同樣的方法對(duì)BL21 (DE3) /pET28a-celA進(jìn)行表達(dá)和純化，得到突變前酶液。采用同樣的方法將空載體pET28a轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)中獲得重組菌BL21 (DE3) / pET28a，將該重組菌采用相同的步驟進(jìn)行培養(yǎng)和純化，得到的溶液作為對(duì)照酶液。將純化酶液(3F6)、純化酶液(C3-i;3)、突變前酶液和對(duì)照酶液均進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定(Experion全自動(dòng)電泳系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Biorad公司)。該儀器同時(shí)可以對(duì)樣品中的蛋白進(jìn)行定量。突變前蛋白在粗酶液中為87ngy Γ1，突變體(3F6)為137ngy Γ1，突變體(C3-13) 為140ngy Γ1?？梢钥闯?，與突變前的蛋白相比，突變后得到的純化酶液(3F6)和純化酶液 (C3-13)的表達(dá)量有一定提高。對(duì)照酶液中目標(biāo)蛋白無(wú)表達(dá)。二、功能檢測(cè)1)酶活測(cè)定對(duì)上述步驟一獲得的純化酶液(3F6)和純化酶液(C3-i;3)進(jìn)行酶活檢測(cè)。將1個(gè)酶活單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1 μ mol葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)單位。酶活測(cè)定的反應(yīng)體系如下將0.4g羧甲基纖維素鈉(CMC)溶于IOOml濃度為 50mM, pH6. 5的MES緩沖液(Sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)為M5^7))中，得到CMC底物溶液；取 65 μ 1上述CMC底物溶液，與5 μ 1濃度為0. 02mg/ml的上述步驟一獲得的純化酶液(3F6) 或純化酶液(C3-i;3)混合均勻，75°C反應(yīng)IOmin后，加入等體積DNS試劑(配置方法3， 5- 二硝基水楊酸0. 64% (質(zhì)量體積比，下同)，氫氧化鈉O. 1 % )，亞硫酸鈉(0. 5% )，苯酚(0. 5% )。按上述比例混合均勻后過(guò)濾，將試劑儲(chǔ)存于棕色試劑瓶中，放置1周以上再使用)，然后再95°C反應(yīng)^iin顯色。即時(shí)冷卻后，取100 μ 1，測(cè)試MOnm處的吸光值。以來(lái)自李氏木霉的商用纖維素酶(購(gòu)自諾維信公司)、突變前酶液和對(duì)照酶液為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，上述步驟2獲得純化酶液(3F6)(突變體3F6)和純化酶液 (C3-13)(突變體C3-i;3)與突變前酶液(野生型)相比，在比活力、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)上都有所改進(jìn)，比活力提高135士6% (突變體3F6)和193士8% (突變體C3-13)。來(lái)自李氏木霉的商用纖維素酶的比活力僅為19. llU/mg。分別配置0. 1-1. 5% (質(zhì)量百分含量)的CMC底物溶液(50mM MES緩沖液，ρΗ6· 5)。 在75°C下測(cè)試酶蛋白在不同反應(yīng)時(shí)間下Omin、4min、6min、8min、12min、16mir^n 20min)生成產(chǎn)物量(方法同上)。根據(jù)Graphpad軟件提供的非線性擬合的方法計(jì)算各酶動(dòng)力學(xué)常數(shù) (Kffl和Vmax)而k。at則由Vmax與酶蛋白濃度的比值計(jì)算而得。轉(zhuǎn)空載對(duì)照菌表達(dá)純化得到的酶液沒(méi)有檢測(cè)到活性。
酶蛋白樣品
比活力 (U mg-')a
^m (g I'1)
Και (s )
KJKm (lg-V1)
野生型酶(突變
前酶液) 突變體3F6 突變體C3-13
(突變后酶液)
294 士 10 396 土 15 567 土 23
1.39±0.12 1.34 ±0.09
1.00 土 0.12
1.94 ±0.11 2.15±0.16 2.47 土 0.09
1.41 ±0.13 1.61 ±0.13 2.51 ±0.312)酶學(xué)性質(zhì)表征A、最適酶促反應(yīng)溫度的測(cè)定取65 μ 1上述步驟1)的CMC底物溶液，加入5 μ 1濃度為0. 02mg/ml的上述步驟 2獲得的純化酶液(3F6)或純化酶液化3-13)，混合均勻后分別在451、501、551、601、 65 V、70°C、75 V、80 V、85 V和90°C下，按照上述步驟1)的酶活測(cè)定方法測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶在不同溫度下的酶活，以確定最適酶促反應(yīng)溫度。以突變前酶液和對(duì)照酶液為對(duì)照。結(jié)果顯示，突變前酶液在45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C和 90°C 的酶活分別為 85U/mg、102U/mg、119U/mg、158U/mg、272U/mg、408U/mg、567U/mg、532U/mg、351U/mg、 llU/mg ；純化酶液(3F6)在45°〇、50°〇、551、601、651、701、751、801、851和901 的酶活分別為 154U/mg、207U/mg、MOU/mg、^2U/mg、276U/mg、313U/mg、396U/mg、383U/mg、 203U/mg、llU/mg ；純化酶液(C3-13)在45°〇、501、551、601、651、701、751、801、851和901 的酶活分別為 130U/mg、176U/mg,200U/mg,206U/mg,204U/mg,244U/mg,294U/mg,285U/mg, 144U/mg、llU/mg。與突變前酶液一樣，純化酶液(3F6)和純化酶液(C3-13)的最適酶反應(yīng)溫度均為 750C (即為最適酶促反應(yīng)溫度，請(qǐng)核實(shí))；但同時(shí)在45°C-70°C范圍內(nèi)酶活較之突變前酶液有顯著的提高達(dá)到最高酶活的50%的溫度，突變前酶液為65°C，而純化酶液(3F6)和純化酶液(C3-i;3)分別為50°C和45°C。這說(shuō)明突變后蛋白較之突變前蛋白有更廣闊的工作溫度范圍。無(wú)論哪個(gè)溫度，對(duì)照酶液均沒(méi)有酶活。
8
B、最適酶促反應(yīng)pH值的測(cè)定將CMC溶于檸檬酸-磷酸緩沖液(lOOmM，pH 4. 5-7. 5)得到不同pH值的CMC底物溶液，所述CMC在CMC底物溶液中的濃度為0.4% (質(zhì)量百分含量)；將CMC溶于甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(50mM，pH 8. 0-11. 0)得到不同pH值的CMC 底物溶液，，所述CMC在CMC底物溶液中的濃度為0.4% (質(zhì)量百分含量)；取65 μ 1上述不同pH值的CMC底物溶液，加入5 μ 1濃度為0. 02mg/ml的上述步驟2獲得的純化酶液(3F6)或純化酶液(C3-13)，混合均勻后在75°C下，按照上述步驟1) 的酶活測(cè)定方法測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶在不同PH條件下的酶活，以確定最適酶促反應(yīng)的pH值。 以突變前酶液和對(duì)照酶液為對(duì)照。結(jié)果表明，突變前酶液在pH為4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. O和7. 5下酶活分別為 99U/mg、165U/mg、223U/mg、253U/mg、294U/mg、277U/mg、112U/mg ；突變前酶液的最適pH約為pH 6. 5，并且在約pH 5. O至約pH 7. 5的pH范圍內(nèi)，具有50%的最大酶活力。純化酶液(3F6)在pH 為 4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. O 和 7. 5 下酶活分別為 145U/ mg,284U/mg,297U/mg,396U/mg,380U/mg,295U/mg,163U/mg ；純化酶液(C3-13)在pH 為 4. 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· O 和 7. 5 下酶活分別為 229U/ mg、383U/mg、418U/mg、567U/mg、519U/mg、441U/mg、276U/mg ；純化酶液(3F6)或純化酶液(C3-13)的最適pH均為pH6. 0，并且在約pH4. 75至 PH7.5的pH范圍內(nèi)，均具有50%的最大酶活力。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中的序列2或序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性蛋白所示的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性蛋白所示的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重組病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述編碼基因插入載體pET28a的多克隆位點(diǎn)間得到的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列7所示，另一條引物序列如序列表中序列8所示。
7.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在降解纖維素中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在降解纖維素中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求4或5所述重組載體在降解纖維素中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維素為羧甲基纖維素鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解的溫度為751，？!1值為6.5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種內(nèi)切葡聚糖酶的突變體及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為人工合成，命名為celA-mut(3F-6)或celA-mut(C3-13)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中的序列4的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中的序列2或序列4氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的所獲得的內(nèi)切葡聚糖酶的突變體比之野生型在比活力上有所提高，維持最適反應(yīng)溫度(75℃)的同時(shí)具有較寬廣的工作溫度范圍，因此具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102443576SQ20101050565
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者梁朝寧, 薛燕芬, 馬延和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所