專利名稱：利用apoa5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種血漿甘油三酯水平的預測方法，特別是涉及一種利用載脂蛋白 A5 (apolipoprotein A5, AP0A5) SHc^W SNP (single nucleotide polymorphism, SNP,#. 核苷酸多態(tài)性)位點預測血漿甘油三酯水平的方法。
背景技術：
血脂異常，尤其是甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高是冠心病發(fā)病的主要風險因素之一。由于冠心病是長期累積的疾病，一旦出現(xiàn)心梗就很難再逆轉，給人們的生活和社會經濟都造成重大的負擔，因此，如何在早期出現(xiàn)冠心病高危因素的時候就進行有效的發(fā)現(xiàn)和防控病程發(fā)展，就成為重要課題。目前隨著我國社會經濟快速發(fā)展，人們膳食結構、生活方式都有了巨大的變化，我國人群血脂水平和血脂異常檢出率明顯增高。通過大規(guī)模流行病學研究已經表明了血漿甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高是冠心病的獨立危險因素。根據(jù)2005年衛(wèi)生部報告我國高甘油三酯血癥患病率為11.9%，其中，男性為14.5%，女性為9.9% ；城市人群為 14.2%，農村為10.9%。引起高甘油三酯血癥的因素有很多，除繼發(fā)性高甘油三酯血癥外， 脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipaseAPL)及其輔助因子載脂蛋白CII的基因突變或缺陷也會導致嚴重的高甘油三酯血癥，但實際上只有一小部分的原發(fā)性嚴重高甘油三酯血癥患者帶有這些基因的異常。2001年，一個新的載脂蛋白家族成員，載脂蛋白A5(AP0A5)在人和鼠的比較基因組研究中被發(fā)現(xiàn)。動物實驗和大量人群研究均提示，載脂蛋白A5參與體內TG的代謝，是血漿TG水平的重要決定因子，與高甘油三酯血癥密切相關。AP0A5敲除和轉基因小鼠模型顯示與血清甘油三酯水平呈負相關。由此，載脂蛋白A5作為一個新的高甘油三酯血癥候選基因而為人們所關注。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法。該方法利用AP0A5基因中的一個SNP位點rs2^6788的基因型分型，實現(xiàn)檢測個體 AP0A5基因的活性高低，以及由此引發(fā)的對個體血漿甘油三酯水平高低和冠心病罹患風險的預測。為解決上述技術問題，本發(fā)明的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法， 包括步驟(1)抽提檢測對象的DNA樣本，該樣本可為血液DNA樣本，如該DNA樣本來源于外周血，但不限于外周血；(2)將模板DNA進行PCR擴增，并將PCR產物純化；(3)純化后的PCR產物進行DNA測序，確定AP0A5基因中的SNP位點rs2266788的基因型分型；
(4)根據(jù)SNP位點的基因型，判斷血漿甘油三酯水平。所述步驟(2)中的PCR擴增的引物是上游GACAGGGAGGCCACCAAAG(SEQ ID NO. 1所示),下游GCAAAGCCTGGTGAATGTAATG (SEQ ID NO. 2 所示)。所述步驟(3)中的SNP位點是SEQ ID NO. 3所示的第407位堿基，該堿基基因型分為等位基因型C或等位基因型T ；所述步驟(4)中的判斷標準是如果帶有等位基因型C，則判斷個體AP0A5基因表達量及活性降低，個體血漿甘油三酯水平增高，個體罹患甘油三酯高脂血癥和冠心病的風險增加，因此，根據(jù)基因型判斷，風險增加程度基因型CC > CT > TT。本發(fā)明有效地通過一個SNP位點分型，檢測出AP0A5基因的活性高低，為預測及判斷個體血漿甘油三酯水平情況、甘油三酯高脂血癥及由此引發(fā)的冠心病患病風險提供依據(jù)。
具體實施例方式實施例ISNP位點與人群甘油三酯水平的相關性通過對大量冠心病關聯(lián)研究的數(shù)據(jù)進行了整理和深度挖掘中發(fā)現(xiàn)AP0A5中多態(tài)位點rs2^6788與人群甘油三酯水平存在顯著的相關性，具體參見以下實驗結果。一、人群樣品的PCR直接測序研究基于上述相關性，進行了基因水平、轉錄水平以及細胞水平的大量、深入研究，其中，PCR直接測序研究的實驗步驟如下(1)外周血DNA樣本抽提使用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒，按照試劑盒的說明制備3222例中國人群樣品的外周血DNA樣本。樣品來源于與上海的數(shù)家三級甲等醫(yī)院的心血管內科進行合作采集獲得， 年齡在45-75歲，男女皆有，無親緣關系個體，冠心病患者確定標準為冠狀動脈造影術顯示有1支或以上的冠狀動脈主支存在50%以上的狹窄的個體，對照為冠狀動脈造影術顯示無血管狹窄或斑塊的個體，病例和對照都可能或有某些基礎性疾病。(2) PCR 擴增將模板DNA進行PCR擴增，其PCR反應體系為10微升PCR體系水6. 1微升， IxHotStarTaq 緩沖液 1 微升，2. OmM Mg2+I 微升，0. 2mM dNTPO. 2 微升，0. 2 μ M 上游引物(SEQID NO. 1所示)0. 2微升，0. 2 μ M下游引物(SEQ ID Ν0. 2所示)0. 2微升，0. 3U HotStarTaq 聚合酶(Qiagen Inc.)和 1 微升模板 DNA (約 IOng)。反應條件95°C15min，94°C 20s, (62V ~0. 5V / 循環(huán))40s，72°C 80s, 11 個循環(huán)； 94°C 20s, 56°C 30s, 72°C 80s, 25 個循環(huán)；72°C 5min。(3) PCR產物純化采用蟲下喊醇(shrimp alkaline phosphatase, SAP)禾口夕卜切醇(exonuclease I, Exon I)純化 PCR 產物。反應體系4μ1 PCR 產物(30ng/y 1) ；0. 5μ 1 SAP (3. 3U/y 1)； 0. 5μ 1 Exon I(20U/y 1)；用 ddH20 定容至 10 μ 1。反應條件37°C 60 分鐘，80°C 15 分鐘。(4) PCR 產物 DNA 測序測序使用BigDye 3. 1試劑盒(購自ABI公司)，在 AB13730XL(AppliedBiosystems, FosterCity, CA)上進行測序，以 Polyphred 讀取序列。
(5)根據(jù)SNP位點(SEQ ID NO. 3所示序列中的第407位堿基)，確定基因型分型為等位基因型C或等位基因型T ；(6)統(tǒng)計方法通過3222例中國人群樣品中的PCR直接測序實驗，確定了 rs2^6788位點與個體的血漿甘油三酯水平呈顯著相關，C等位基因的存在作為高風險等位基因可使個體的甘油三酯水平明顯升高。具體數(shù)據(jù)為根據(jù)基因型區(qū)分成三個組，然后計算出各個組的平均甘油三酯水平分別為ττ組1. 67士 1. 17 ；TC組1. 87士 1.30 ；CC組2. 14士 1.49 ；應用卡方檢驗得到P = 8. 74 X 10_13，經過年齡與性別校正后P值為9. 50X 10Λ二、ΑΡ0Α5基因表達差異研究由于ΑΡ0Α5基因僅在肝臟中有表達，所以選擇了 89例的肝臟組織樣品。樣品來源于自主采集的正常移植肝臟的穿刺活檢樣品，為正常肝組織。樣本采集于正常供肝的病理活檢部分，約50 200mg每例，在采集后立刻浸入ImL RNALater (購自QIAGEN公司)中，4°C過夜，待樣本被RNALater充分浸透后，轉移至-70°C保存。本研究工作樣本采集及使用均得到倫理學批準。將-70°C保存的樣本于室溫復溶后，從RNALater中取出， 在 DEPC-處理的 ddH20 中漂洗掉 RNALater，轉移至 ImL Trizol (Invitrogen Inc.)中，以 Pro200homogenizer (Proscientific Inc.)進行勻菜。然后依 Trizol 的方案(protocol) 得到 DNA 和 RNA。以 Biophotometer (Eppendorf Inc.)進行初步定量。對得到的RNA以DNase I (Takara Inc.)進5行處理，并用酚/氯仿抽提純化，乙醇沉淀。RNA以DEPC-treated ddH20復溶并稀釋至終濃度約lug/ul。-70°C保存。所得RNA 利用RT-PCR Kit (購自Promega公司)轉錄成cDNA。通過對這89例樣本DNA的rs2266788的分型，具體方法參考“一、人群樣品的PCR 直接測序研究”，從這89例中選擇了 24例肝臟樣品，其中TT 9例、TC 8例和CC 7例。利用SYBRGreen熒光定量PCR技術(實時熒光定量SYBR green-based assay)。PCR方法熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司(STOR Premix Ex TaqTM TaKaRa)，按照該試劑盒進行操作， 并在 ABI PRISM(R) 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems)系統(tǒng)上進行檢測。對這M例樣品中AP0A5基因的表達情況進行了研究，經過卡方檢驗，分析發(fā)現(xiàn)C 等位基因型確實會與AP0A5基因表達降低相關聯(lián)(P = 0. 044)，具體見表1 ；隱性模型顯示當CC純合時AP0A5的基因表達水平明顯降低(P = 0. 012)，具體見表2。表1三種基因型
權利要求
1.一種檢測AP0A5基因中的SNP位點rs2266788的引物是SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物。
2.一種利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，步驟包括(1)抽提檢測對象的DNA樣本；(2)將模板DNA進行PCR擴增，并將PCR產物純化；(3)純化后的PCR產物進行DNA測序，確定AP0A5基因中的SNP位點rs2266788的基因型分型；(4)根據(jù)SNP位點的基因型，判斷血漿甘油三酯水平。
3.如權利要求2所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述步驟(1)中的DNA樣本是血液DNA樣本。
4.如權利要求1所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述步驟O)中的PCR擴增的引物是SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物。
5.如權利要求1所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述步驟(3)中的DNA測序是DNA直接測序。
6.如權利要求1所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述步驟(3)中的SNP位點是SEQ ID NO. 3所示的第407位堿基，該堿基基因型分為等位基因型C或等位基因型T。
7.如權利要求1所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述步驟(4)中的判斷標準是如果帶有等位基因型C，則判斷個體AP0A5基因表達量及活性降低，個體血漿甘油三酯水平增高。
8.如權利要求7所述的利用AP0A5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，其特征在于 所述血漿甘油三酯水平增高，則個體甘油三酯高脂血癥和冠心病的罹患風險增加，其風險增加程度為基因型CC > CT > TT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用APOA5多態(tài)預測血漿甘油三酯水平的方法，步驟包括1)抽提檢測對象的DNA樣本；2)將模板DNA進行PCR擴增，并將PCR產物純化；3)純化后的PCR產物進行DNA測序，確定SNP位點的基因型分型；4)根據(jù)SNP位點的基因型，判斷血漿甘油三酯水平。本發(fā)明有效地通過一個SNP位點分型，檢測出APOA5基因的活性高低，為預測及判斷個體血漿甘油三酯水平情況、甘油三酯高脂血癥及由此引發(fā)的冠心病患病風險提供依據(jù)。
文檔編號C12Q1/61GK102409083SQ20101029032
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月25日 優(yōu)先權日2010年9月25日
發(fā)明者王海豐, 王穎, 黃薇 申請人:上海人類基因組研究中心, 上海南方基因科技有限公司