含有8種甘油三酯的藥物組合物、制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及含有8種甘油酯的藥物組合物、制 劑、制備方法及其在制備抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 薏該仁是禾本科薏該屬植物薏該Coix lacryma-jobi L. var ma-yuen (Roman.) Stapf的成熟干燥種仁，為利水滲濕藥，很久以來為藥食兩用品種?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)薏苡 仁具有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)?、降血脂和減肥等藥理作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者通 過TLC、HPLC-MS、GC等方法對薏苡仁的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其含有多種活性成分， 主要包括薏苡仁酯、甘油三酯類、脂肪酸類、內(nèi)酰胺類、薏苡仁內(nèi)酯、糖類、留醇類、三萜 類等化合物。其中，酯類是首先被發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的成分，也是報(bào)道最多最受關(guān) 注的化學(xué)成分。雖然目前在中國臨床上以薏苡仁油為有效成分的康萊特注射劑已得到 普遍應(yīng)用，但關(guān)于其物質(zhì)基礎(chǔ)和抗癌活性成分的研究鮮有報(bào)道，向智敏等[中國中藥雜 志，2005, 30(18) :1436-1438]僅采用液質(zhì)聯(lián)用法對薏苡仁油中三酯類成分進(jìn)行了定性分 析，初步推定12種甘油三酯成分：三亞油酸甘油酯、二亞油酸油酸甘油酯、棕櫚酸二亞油酸 甘油酯、亞油酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、二棕櫚酸亞油酸甘油酯、三油酸 甘油酯、油酸亞油酸硬脂酸甘油酯、棕櫚酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸硬脂酸甘油酯、二 棕櫚酸油酸甘油酯和二油酸硬脂酸甘油酯，但并未對各成分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性進(jìn) 行深入研究。而薏苡仁油中不僅含有上述甘油三酯成分外，還含有甘油一酯、甘油二酯和脂 肪酸酯等。由此可見，薏苡仁油脂成分的復(fù)雜性，這必然會(huì)使實(shí)際生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制和 臨床用藥安全面臨很大的挑戰(zhàn)。
[0003] 因此，開發(fā)一種安全、有效、可控的治療腫瘤的藥物即成為本發(fā)明關(guān)注的熱點(diǎn)。本 發(fā)明對薏苡仁油中甘油三酯成分逐一進(jìn)行了分離、結(jié)構(gòu)確證、藥效活性篩選，選取了 8種具 有顯著抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的甘油三酯單體，將其按照不同比例組合，進(jìn)行藥效試驗(yàn)研 究，得到了本發(fā)明所述的藥物組合物、制劑及其在抗腫瘤和增強(qiáng)免疫能力中的應(yīng)用。采用本 發(fā)明所述組合物用藥，成分及組成確定，可有效保障工業(yè)生產(chǎn)中各批次成品質(zhì)量的穩(wěn)定性， 也避免了因直接采用薏苡仁粗油入藥因成分復(fù)雜不清而導(dǎo)致的毒副反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種含有甘油酯的藥物組合物，具體由如下質(zhì)量百分含量 的8種成分組成：
[0005] 三亞油酸甘油酯 2.08-2.99 1-油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 24.24-34.85 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 3.44-4.95 U-二油酸-2-亞油酸甘油酯 22.32-32.09 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 10.32-14.84 1,3 -二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.40-0.58 三油酸甘袖酯 12.80-18.40 1-棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 4.40-6.33
[0006] 優(yōu)選的，上述8種成分的質(zhì)量百分含量為：
[0007] 三亞油酸甘油酯 2.34-2.86 1-油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 27.27-33.33 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 3.87-4.73 U-二油酸-2-亞油酸甘油酯 25.11-30.69
[0008] 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 11.61-14.19 U-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.45-0.55 三油酸甘油酯 14.40-】8.40 1 -棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 4.95-6.05
[0009] 更優(yōu)選的，上述8種成分的質(zhì)量百分含量為：
[0010] 三亞油酸甘油酯 2.55-2.65 1-油酸-2,3-二亞油酸甘油酯 29.69-30.91 1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘油酯 4.21-4.39 ],3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 27.34-28.46 1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯 12.64-13.16 U-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯 0.49-0.51 三油酸甘油酯 15.68-16.32 1 -棕櫚酸-2,3-二油酸甘油酯 5.39-5.61
[0011] 其中，所述8種甘油三酯成分可以通過如本發(fā)明實(shí)施例所述方法分離獲得，也可 以采用本領(lǐng)域常規(guī)合成方法制備或者直接市場購買。
[0012] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種含有甘油酯的藥物制劑，具體包括本發(fā)明所述藥 物組合物及一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、乳 化劑、粘合劑、潤滑劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、崩解劑、潤滑劑或抗氧化劑，必要時(shí)還可以 加入香味劑、甜味劑、防腐劑或著色劑。
[0014] 所述藥學(xué)上可接受的載體可以選自：甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫 代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、維生素 C、維生素 E、EDTA二鈉 、EDTA 鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸鉀、醋酸氯己定、木糖醇、麥芽糖、葡萄 糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻 酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二 醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。
[0015] 所述藥物制劑可以是口服固體制劑、口服液體制劑或注射劑。
[0016] 優(yōu)選的，
[0017] 所述口服固體制劑選自膠囊劑、片劑、滴丸、顆粒劑、濃縮丸中的一種；所述口服液 體制劑選自水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或是一種在使用前可用水或其 它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品；所述注射劑選自納米混懸劑、脂質(zhì)體、乳劑、凍干粉針劑和 水針劑中的一種。
[0018] 更優(yōu)選的，
[0019] 所述注射劑包括如下成分：本發(fā)明所述藥物組合物50~350g，注射用大豆磷脂 或可供注射用大豆磷脂10~40g，注射用甘油或可供注射用甘油15~50g，注射用水加至 1000ml〇
[0020] 其可通過如下方法制備：
[0021] 稱取處方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂，加適量的注射用水 后，用高剪切分散乳化機(jī)分散至無塊狀及顆粒狀固體，加入按配方量稱取的注射用甘油或 可供注射用甘油，并加注射用水至規(guī)定量，攪拌均勻備用；
[0022] 另稱取含有8種活性成分的藥物組合物，將稱取的油酯與水相分別加熱至60~ 70°C后，置高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓乳化，乳化時(shí)均質(zhì)機(jī)低壓為5~12MPa，高壓為25~50MPa， 再循環(huán)均質(zhì)3~6遍，至2μηι以下顆粒應(yīng)不少于95%，5 μ m以上顆粒不得檢出，必要時(shí)用 NaOH或HC1調(diào)節(jié)pH至4. 8~8. 5,優(yōu)選6. 8~7. 0,最優(yōu)選為6. 8 ;
[0023] 將制得均勻乳劑氮?dú)饧訅和ㄟ^小于等于3 μ m的微孔濾芯過濾器過濾，充氮灌裝 滅菌，冷卻即得。
[0024] 所述膠囊劑包括如下成分：含有8種活性成分的藥物組合物200~800g，抗氧化 劑和/或乳化劑〇. 20~0. 60g，制成1000粒。
[0025] 其可通過如下方法制備：
[0026] 膠液配制：按重量比為1:0. 6~1. 2:0. 3~0. 8:0. 0001~0. 01稱取適量明膠、純 化水、甘油和防腐劑；依次將甘油、純化水、防腐劑（選自10%羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨 酸鉀和醋酸氯己定中的一種）加入化膠罐內(nèi)，加熱至70°C~90°C后，再加入明膠不斷攪拌、 抽真空，直至明膠完全溶解，將膠液過濾，在56~62 °C下存放，備用；
[0027] 藥液配制：將配方量的藥物組合物、抗氧化劑和/或乳化劑（抗氧化劑為維生素 E，乳化劑為吐溫80)加入配料罐內(nèi)，不斷攪拌，直至混合均勻；
[0028] 壓膠囊：根據(jù)膠囊大小選擇合適的壓丸模具，在15~30°C、相對濕度小于35%條 件下進(jìn)行壓丸定型后干燥，剔除大小丸，再用95%藥用乙醇洗丸后，繼續(xù)干燥至含水量小于 12%，目檢剔除不合格膠囊，印字，包裝即得。
[0029] 本發(fā)明通過藥效實(shí)驗(yàn)表明，所述藥物組合物及其制劑對多種人腫瘤細(xì)胞株均有不 同程度的抑制作用，可作為治療腫瘤疾病藥物。
[0030] 因此，本發(fā)明的目的還在于提供一種上述藥物組合物、藥物制劑在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。以及上述藥物組合物在制備提高機(jī)體免疫功能藥物中的應(yīng)用，及其與LAK細(xì) 胞（淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞）的組合在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0031 ] 其中，所述腫瘤是指早期、中期或晚期的肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或 乳腺癌。
[0032] 以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明所述組合物及其制劑在抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功 能方面的有益效果。
[0033] -、體外MTT法測定藥物組合物及其制劑對8種人腫瘤細(xì)胞株的抑制作用
[0034] 1、實(shí)驗(yàn)材料及配制
[0035] (1)細(xì)胞株：PANC-1 (人胰腺癌細(xì)胞）、SK0V3 (人卵巢癌細(xì)胞）、MCF-7 (人乳腺癌細(xì) 胞）、Bcap-37 (人乳腺癌細(xì)胞）、SMMC-7721 (人肝癌細(xì)胞）、H印G-2 (人肝癌細(xì)胞）、A549 (人 肺癌細(xì)胞）、H460 (人肺癌細(xì)胞），上述細(xì)胞株由上海醫(yī)藥工業(yè)研究藥理評價(jià)研究中心保存， 傳代維持。
[0036] (2)01^1完全培養(yǎng)基：添加10%新生牛血清（6四0)81^)、雙抗。
[0037] (3)0. 25%胰蛋白酶溶液（Trypsin):購自 Invitrogen 公司，-20°C保存。
[0038] (4)磷酸緩沖液（PBS) :NaC18g，KC10. 2g，Na2HP04l. 15g，ΚΗ2Ρ040· 2g，溶于 1L 雙蒸 水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。
[0039] (5) MTT (AMRESC0)溶液：用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。
[0040] (6)溶解液：每100ml去離子雙蒸水含SDSlOg，異丁醇5ml，濃鹽酸0· 1ml。
[0041] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0042] 樣品對上述細(xì)胞株的抑制作用通過MTT法測得。
[0043] 具體步驟如下：
[0044] (1)細(xì)胞培養(yǎng)：①將細(xì)胞從液氮中取出，在37°C水浴中迅速解凍，細(xì)胞在無菌操 作臺(tái)中移入l〇ml無菌離心管中加6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清 液，沉淀中加入5-6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，滴管吹打使其懸浮后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C細(xì)胞培 養(yǎng)箱內(nèi)。②次日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入5~6ml細(xì)胞培養(yǎng) 基，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。③隔日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 PBS (pH7. 4) 2~3ml晃動(dòng)清洗，倒掉PBS溶液后再重復(fù)一次清洗。在培養(yǎng)瓶中加入3~5滴 0. 25%胰蛋白酶溶液晃動(dòng)均勻，加蓋置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3分鐘左右，于顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁上脫離，加細(xì)胞培養(yǎng)基2ml，滴管吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁后，分別移 入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞培養(yǎng)基5~6ml吹打均勻，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。④隔 日，重復(fù)③步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，貼壁細(xì)胞不允許生長過密，懸浮細(xì)胞始終保持對數(shù)生 長期。（2)樣品及對照品制備：稱取適量藥物組合物樣品溶解于DMS0中，得到濃度為10mg/ ml 的溶液。再用 PBS作梯度稀釋，得到濃度 10mg/ml、5000 μ g/ml、2500 μ g/ml、1250 μ g/ml、 625 μ g/ml、312. 5 μ g/ml 的稀釋樣品。
[0045] (3)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10 μ 1，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測試。將 DMS0相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對照。
[0046] (4)取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%小牛血清 的培養(yǎng)基中，經(jīng)苔盼藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2X 105個(gè)細(xì)胞/ ml〇
[0047] (5)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37°C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。
[0048] (6)每孔中加入20 μ 1的5mg/ml MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3~4小時(shí)。
[0049] (7)每孔加入100 μ 1溶解液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲臢晶體充分 溶解。測定570nm光吸收值。
[0050] (8)根據(jù)光吸收值計(jì)算各樣品濃度組的細(xì)胞生長抑制率。計(jì)算公式如下：
[0051] (1 -實(shí)驗(yàn)孔平均光吸收值/對照孔平均光吸收值）X 100%
[0052] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053] 表1不同濃度樣品對8種細(xì)胞株的生長抑制率（％ )
[0055] 表2樣品在體外對8種細(xì)胞株的IC5。（ μ g/ml)
[0057] 4、結(jié)論
[0058] 不