專(zhuān)利名稱(chēng)：一種節(jié)水型的稚鮑養(yǎng)殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水貝類(lèi)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高稚鮑養(yǎng)殖成活率、節(jié)水節(jié) 能、綠色環(huán)保的養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)的鮑養(yǎng)殖研究從20世紀(jì)70年代開(kāi)始起步，經(jīng)過(guò)近三十年的發(fā)展，取得了巨大 的成績(jī)和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，隨著稚鮑人工養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，技術(shù)上的缺陷也逐漸凸 顯出來(lái)，在養(yǎng)殖過(guò)程中，特別是在稚鮑剝離后，容易引發(fā)一些稚鮑疾病，隨著養(yǎng)殖規(guī)模迅速 的發(fā)展，其養(yǎng)殖工作普遍存在著稚鮑于剝離后數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)不同程度大量死亡的現(xiàn)象，死亡 率高達(dá)80%以上，保苗率一般維持在3-20%之間，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)的保苗率低于10%，目前此 種情況一直未能得以解決。由于鮑苗、稚鮑大量死亡導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，許多場(chǎng)家不能維持 正常生產(chǎn)，部分場(chǎng)家停產(chǎn)、轉(zhuǎn)產(chǎn)，致使供給的稚鮑量銳減。給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 病原體感染是引起稚鮑死亡的主要原因，人工養(yǎng)殖主要是細(xì)菌性疾病和病毒性疾病。常見(jiàn) 的潛在致病菌有副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等。目前常規(guī)的防治稚鮑掉板的方法主要是定期施用抗生素，抗生素雖然具有藥物直 接入水、濃度高、吸收快、療效好的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是可能對(duì)稚鮑產(chǎn)生刺激性、引發(fā)新病癥。如 果長(zhǎng)期大量使用抗生素，不僅會(huì)使?jié)撛谥虏【退幘暝黾樱矔?huì)使一些鮑病例變得難以 治愈。此外鮑體內(nèi)抗生素殘留會(huì)影響稚鮑品質(zhì)，不利于銷(xiāo)售，進(jìn)而造成養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)損失。 中草藥防治稚鮑掉板也是一種常見(jiàn)的辦法，具有無(wú)藥物殘留、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)，但也有見(jiàn) 效慢的缺點(diǎn)，因而尋求一種更高效、經(jīng)濟(jì)的辦法顯得極為迫切。蛭弧菌蛭質(zhì)體是指蛭弧菌侵入宿主細(xì)菌前的生長(zhǎng)形式。蛭弧菌的生活史可分為脫 離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體狀態(tài)和在宿主細(xì)菌內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的蛭質(zhì)體狀態(tài)。游 泳體蛭弧菌侵入宿主的周質(zhì)空間的同時(shí)失去鞭毛，宿主細(xì)胞也開(kāi)始膨脹，變?yōu)橐粋€(gè)對(duì)滲透 壓并不敏感的球形體(即"蛭質(zhì)體")。與游泳體相比，蛭質(zhì)體具有制備、保存更為方便，環(huán) 境耐受力強(qiáng)，殺菌作用時(shí)間雖略慢但更久等特點(diǎn)，同時(shí)還具有潛在的滅活疫苗功能。當(dāng)游泳 體蛭弧菌入侵宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也進(jìn) 入蛭質(zhì)體狀態(tài)，開(kāi)始分泌多種酶，消解宿主細(xì)胞的大分子為小分子物質(zhì)，進(jìn)而整合為自身的 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使自身生長(zhǎng)，變長(zhǎng)。最終，長(zhǎng)條狀的蛭質(zhì)體分成很多短的節(jié)段，長(zhǎng)出鞭毛，重新成 為游泳體。之后它們分泌必需的酶類(lèi)，破壁而出，再次成為脫離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游 泳的游泳體。在此蛭質(zhì)體發(fā)育期間，蛭弧菌并不改變宿主細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，使原宿主仍具有 抗原作用，可刺激生物體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)?！熬G色養(yǎng)殖”成為近年來(lái)國(guó)家的重大需求，引起水產(chǎn)界的廣泛關(guān)注。目前，用蛭弧菌 蛭質(zhì)體來(lái)進(jìn)行稚鮑養(yǎng)殖在國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無(wú)論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國(guó)外，Lenz and Hespell (1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對(duì)動(dòng)物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R. W.，HespellR. B. Attemptsto grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. Archives of Microbiology, 1978,119(3) =245-248] 在國(guó)內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì) 胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)菌沒(méi)有侵染作用[林茂，楊先樂(lè)，薛暉，曹海鵬，邱軍強(qiáng)。蛭弧菌 BDH2102對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1) :7_11]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種提高稚鮑免疫力，促進(jìn)稚 鮑生長(zhǎng)，提高稚鮑成活率的節(jié)水型養(yǎng)殖方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)一種節(jié)水型稚鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于，養(yǎng)殖過(guò)程如下(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開(kāi)始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液； 且每5-30天換水一次，每次為全池?fù)Q水；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)到1. 0-1. 6cm時(shí)，即可收稚鮑；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏，其簡(jiǎn)稱(chēng)為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M209172，保藏日期為2009年8月7日。BDFM05 呈單細(xì)胞，橢圓形，大小為1. 43X0. 53 μ m,端生鞭毛，鞭毛長(zhǎng)度至少2μ m ；所述蛭弧菌 (Bdellovibrio sp. )BDFM05以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直徑2 3mm的透明圓 形噬菌斑，采用蛭質(zhì)體高密度發(fā)酵方法發(fā)酵，得到一定濃度的蛭弧菌蛭質(zhì)體。優(yōu)選地，所述鋪磚是先將磚洗刷干凈并用高錳酸鉀溶液消毒，消毒后再采取騎疊 式擺磚。優(yōu)選地，所述海水在注入前經(jīng)過(guò)砂濾和沉淀處理。所投喂的餌料為人工合成餌料，優(yōu)選地，所述投喂餌料時(shí)要先停止曝氣，投餌 0. 5-lh后再開(kāi)始曝氣。優(yōu)選地，所述稚鮑下池后，曝氣量控制在10-100L/h/m3，光照控制在50-2001ux，水 溫控制在15-28°C。優(yōu)選地，所述在投喂的餌料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液是指用濃度為10-107pfU/mL 的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡餌料20 40分鐘。優(yōu)選地，所述在養(yǎng)殖水體中添加的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，使蛭弧菌蛭質(zhì)體在水體中 的濃度至少達(dá)到10pfu/mL。優(yōu)選地，所述每次換水后都立即添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，并使蛭弧菌蛭質(zhì)體在水 體中的濃度至少達(dá)到10pfu/mL。優(yōu)選地，所述蛭弧菌蛭質(zhì)體在水體中的濃度為10_107pfu/mL。優(yōu)選地，所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液的制備方法為在含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌 BDFM05 (CCTCC M209172)，恒溫?fù)u床 150rpm 300rpm、20 35°C培養(yǎng) 24 48h ；培養(yǎng)液于 40C 6000 8000rpm離心15 20min，取沉淀，向沉淀中加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧 菌沉淀物，即制得蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明所述的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液能顯著提高稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。本發(fā)明中所述的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在控制稚鮑養(yǎng)殖環(huán)境、餌料、水體中細(xì)菌的效 果顯著，能夠明顯改善稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。2、本發(fā)明所述的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在控制和消除稚鮑潛在致病菌應(yīng)用中安全性 好。蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液通過(guò)裂解潛在致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌蛭質(zhì)體可侵 染、裂解宿主細(xì)菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中潛在致病菌的生物凈 化因子，且其在裂解完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，從而克服了抗生素濫用帶來(lái)的副 作用和常規(guī)消毒劑對(duì)稚鮑的不利影響，同時(shí)已有研究已證明蛭弧菌對(duì)人等無(wú)毒。3、所述的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液能凈化水質(zhì)并促進(jìn)稚鮑生長(zhǎng)。蛭弧菌蛭質(zhì)體對(duì)水質(zhì)有凈化作用，能改善動(dòng)物胃腸道環(huán)境，促進(jìn)生長(zhǎng)。4、含有本發(fā)明所述的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液適合推廣應(yīng)用于鮑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程。蛭弧菌蛭質(zhì)體對(duì)人和鮑魚(yú)無(wú)毒副作用。適合于鮑魚(yú)大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖，可以為鮑 魚(yú)的綠色加工生產(chǎn)提供保障并且為控制和消除鮑魚(yú)潛在致病菌提供了一種新方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)施地位山東某養(yǎng)殖 場(chǎng)，本發(fā)明的稚鮑為皺紋盤(pán)鮑，由該養(yǎng)殖場(chǎng)提供。實(shí)施例1蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以雙層平板法于28°C培養(yǎng)三天可形成直 徑2 3mm的透明圓形噬菌斑，所用的蛭弧菌蛭質(zhì)體通過(guò)高密度蛭弧菌蛭質(zhì)體的發(fā)酵方法 進(jìn)行發(fā)酵在裝有IOOmL營(yíng)養(yǎng)肉湯(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)的 錐形瓶中接種0. 5mL 107cfu/mL副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，購(gòu)于美國(guó)典型微 生物菌種保藏中心 AmericanType Culture Collection，編號(hào)ATCC 17802)，200rpm、28°C 搖床培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)液分別于4°C、5000rpm離心15min，棄上清。用5mL生理鹽水懸浮 沉淀菌體，之后加入到一個(gè)裝有IOOmL DNB (dilute nutrient broth)液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉 湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于IOOOmL蒸餾水，pH值為 7. 2 7. 6)的錐形瓶中，再加入ImL含103pfu/mL的蛭弧菌BDFM05 (CCTCC M209172)。恒溫 搖床250rpm、28°C培養(yǎng)36h。培養(yǎng)液于4°C 6000rpm離心20min，取沉淀，加入IOmL DNB液體 培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于IOOOmL 蒸餾水中，pH值為7. 2 7. 6)懸浮沉淀菌體，得到濃度為107-109pfU/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體 菌液。實(shí)施例2蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液在養(yǎng)殖中應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施地的養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚內(nèi)，每個(gè)水池規(guī)格為2X2X0. 75m，水深為 0.45m。每池放置曝氣管8條。水池上方蓋上遮光度為60%的遮光布，避免光照過(guò)強(qiáng)。光照強(qiáng)度一般控制在(50-200) lux。實(shí)施地海域的具體水質(zhì)條件為水溫15-28°C，鹽度27-33%。，pH為6. 8-7. 2，海水 經(jīng)過(guò)砂濾、沉淀處理，并在進(jìn)入養(yǎng)殖池前，在池進(jìn)水管口包扎一個(gè)200目的網(wǎng)袋，防止細(xì)砂 入池。水源水質(zhì)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)要求，符合農(nóng)業(yè) 部《無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。鋪磚前，將四角水泥方磚洗刷干凈并用高錳酸鉀溶液消毒，消毒后再放入池底，池 底共放60塊四腳水泥磚，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)、騎疊式放置，每列6塊，每側(cè)5列。放磚后各池均用高 錳酸鉀溶液消毒，反復(fù)沖洗干凈，然后注入經(jīng)過(guò)砂濾和沉淀處理的海水。稚鮑下池，所選取 的附苗波紋板附稚鮑量在30-2000粒/板，稚鮑體長(zhǎng)在2. 0-4. 5mm，稚鮑健康、活力好，每池 稚鮑剝離量為10000粒，投鮑后即開(kāi)始曝氣，曝氣量為50L/h/m3。本發(fā)明設(shè)置一個(gè)生產(chǎn)對(duì)照組-正常流水，日換水量為池水量的2倍，每天早上6 00 用高壓水沖洗池子，晚上18:00正常投餌，期間不加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，完全的工廠養(yǎng)殖方 式，將其編為A組。其他具體編排方案如下(1)在養(yǎng)殖水體中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，但 餌料中不加。每次換水后立即在養(yǎng)殖水體中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，所需48個(gè)水池分為B-1、 B-2、B-3、B-4, C-I、C_2、C_3、C_4，D_l、D_2、D_3、D_4，E_l、E_2、E_3、E—4，F(xiàn)_l、F_2、F—3、 F-4，G-l、G-2、G-3、G-4，每組2個(gè)重復(fù)。各組的換水周期及加菌液濃度如下B 組(Β-1、Β-2、Β-3、Β-4):5天換(全池)水一-次；
C 組(C-l、C-2、C-3、C-4):10天換(全池)水-一次；
D 組(D-l、D-2、D-3、D-4):15天換(全池)水-一次；
E 組(Ε-1、Ε-2、Ε-3、Ε-4)20天換(全池)水-一次；
F 組(F-l、F-2、F-3、F-4)25天換(全池)水-一次；
G 組(G-l、G-2、G-3、G-4)30天換(全池)水-一次；
B-I、C-1、D-1、E-1、F-I、G--1組每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，
使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到IO1PfuAiL ；B-2、C-2、D-2、E_2、F_2、G-2組每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液， 使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到103pfu/mL ；B-3、C-3、D-3、E_3、F_3、G-3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到105pfU/mL ；B-4、C-4、D-4，E_4、F_4、G-4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到107pfu/mL。(2)在餌料中加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，但在養(yǎng)殖水體中不加。每天投餌前用蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡餌料半小時(shí)，而每次換水后養(yǎng)殖水體都不加 蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。所需48個(gè)水池分為b-1、b-2、b-3、b-4 ；c-1、c-2、c-3、c-4 ；d-l、d_2、 d-3、d-4 ；e-1、e-2、e_3、e_4 ；f_l、f_2、f_3、f-4 ；g-l, g_2、g-3、g-4 每組 2 個(gè)重復(fù)。各組 的換水周期及加菌液濃度如下b 組(b-1、b-2、b-3、b-4) 5 天換(全池)水一次；c 組(c-1、c-2、c-3、c-4) 10 天換(全池)水一次；d 組(d-1、d-2、d-3、d-4) 15 天換(全池)水一次；
e 組(e-1、e-2、e_3、e_4) 20 天換(全池)水一次；f 組(f-1、f-2、f-3、f-4) 25 天換(全池)水一次；g 組(g-1、g_2、g_3、g-4) 30 天換(全池)水一次；b-l、c-l、d-l、e-l、f-l、g-l組投的餌料經(jīng)過(guò)濃度為IO1PfuAiL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液菌液浸泡過(guò)的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。b-2、c-2、d-2、e-2、f-2、g-2組投的餌料經(jīng)過(guò)濃度為103pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液菌液浸泡過(guò)的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。b-3、c-3、d-3、e-3、f-3、g-3組投的餌料經(jīng)過(guò)濃度為105pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液菌液浸泡過(guò)的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。b-4、c-4、d-4、e-4、f-4、g-4組投的餌料經(jīng)過(guò)濃度為107pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液菌液浸泡過(guò)的餌料；每次換水不在水體加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。(3)在養(yǎng)殖水體和餌料中均添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。每天投餌前用蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡餌料半小時(shí)，每次換水后養(yǎng)殖水體也加蛭弧 菌蛭質(zhì)體菌液。所需 48 個(gè)水池分為 Bb-l、Bb-2、Bb-3、Bb-4 ;Cc-l、Cc-2、Cc-3、Cc_4 ；Dd-U Dd-2、Dd-3、Dd-4 ；Ee_l、Ee_2、Ee_3、Ee_4 ；Ff-1、Ff-2、Ff-3、Ff-4 ；Gg_l、Gg_2、Gg_3、Gg-4 每組 2 個(gè)重復(fù)。各組的換水周期 及加菌液濃度如下Bb 組(Bb-I、Bb--2、Bb--3、Bb--4):5天換(全池)水一-次；
Cc 組(Cc-I、Cc--2、Cc--3、Cc--4):10天換(全池)水-一次；
Dd 組(Dd-I、Dd--2、Dd--3、Dd--4):15天換(全池)水-一次；
Ee 組(Ee-I、Ee--2、Ee--3、Ee--4)20天換(全池)水-一次；
Ff 組(Ff-UFf--2、Ff--3、Ff--4)25天換(全池)水-一次；
Gg 組(Gg-I、Gg--2、Gg--3、Gg--4)30天換(全池)水-一次；
Bb-I、Cc-I、Dd--1、Ee--1、Ff-1、Gg-I組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌
蛭質(zhì)體菌液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到IO1PfuAiL ；每次投餌的餌料用濃度為 IO1PfuAiL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡半小時(shí)；Bb-2、Cc-2、Dd_2、Ee_2、Ff-2, Gg-2組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 蛭質(zhì)體菌液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到103pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為 103pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡半小時(shí)。Bb-3、Cc-3、Dd_3、Ee_3、Ff-3, Gg-3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 蛭質(zhì)體菌液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到105pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為 105pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡半小時(shí)；Bb-4、Cc-4、Dd_4、Ee_4、Ff-4, Gg-4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌 蛭質(zhì)體菌液，使水體中蛭弧菌蛭質(zhì)體菌體濃度達(dá)到107pfU/mL ；每次投餌的餌料用濃度為 107pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡半小時(shí)。本發(fā)明的各組池中，所投喂的餌料為人工合成餌料，餌料量隨稚鮑大小而變化，當(dāng) 要投喂餌料時(shí)，要先停止曝氣，投餌Ih后再開(kāi)始曝氣。為了減少殘餌對(duì)水質(zhì)的破壞，需要每 天對(duì)除A組外各組池底和四角方磚上的殘餌進(jìn)行虹吸，也可間隔5天對(duì)殘餌進(jìn)行虹吸。除 此之外，每晚需要觀察稚鮑活動(dòng)情況，吃食狀況等。
從剝離下板到最后統(tǒng)計(jì)稚鮑，時(shí)間為60天，為了 了解蛭弧菌蛭質(zhì)體對(duì)稚鮑的成活 率的影響促進(jìn)生長(zhǎng)能力，需要最后對(duì)活稚鮑進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按一定指標(biāo)統(tǒng)計(jì)稚鮑。(4)養(yǎng)殖指標(biāo)與測(cè)量①稚鮑初始量，每池1萬(wàn)稚鮑。②收稚鮑平均殼長(zhǎng)，隨機(jī)抽取50粒稚鮑，測(cè)量殼長(zhǎng)，取平均值。③稚鮑平均重量，隨機(jī)抽取50粒稚鮑，稱(chēng)其總重后取平均④收鮑總量，稱(chēng)取IOg稚鮑，計(jì)算其粒數(shù)，將稚鮑稱(chēng)總重估算粒數(shù)。⑤成活率，某階段結(jié)束時(shí)稚鮑量占該階段投稚鮑量的百分率。(5)稚鮑免疫指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束每組取樣18個(gè)去殼，3個(gè)/管放于6個(gè)分別盛有ImL Hank’ s緩沖液(pH 值7-8)的2ml-Eppendorf管中，貯于-80°C以備抗免疫指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí)取出樣品，使其 在冰上融化。進(jìn)行勻漿，然后6000r/min，-4°C離心5min.取上清用于免疫指標(biāo)的測(cè)定。①酚氧化物酶的測(cè)定酚氧化物酶的活性測(cè)定是通過(guò)測(cè)定和L-DOPA (左旋多巴)反應(yīng)生成的多巴胺的吸 光值來(lái)計(jì)算的。把每個(gè)樣品100 μ L到1. 5mL的Eppendorf管中，每個(gè)樣品重復(fù)三次。再加 入用PBS液配制的0. 5mg/mL海藻酸鈉在26-27°C下反應(yīng)30min。加入50 μ L的用PBS液配 制的3mg/mL的L-DOPA(左旋多巴)，IOmin后，在490nm處讀取吸光值。對(duì)照液用相應(yīng)的 PBS液代替海藻酸鈉。②溶菌酶活力測(cè)定以溶壁微球菌凍干粉為底物。用0. lmol/L,pH = 6.4的磷酸鹽緩沖液配成底物懸 液(0D570nm 0. 3)，取3. OmL該懸液于試管內(nèi)置冰浴中，再加入50 μ L待測(cè)血清，混合，測(cè) AO值。然后將試液移入37°C溫浴中置30min，取出后再置于冰浴中l(wèi)Omin，以終止反應(yīng)，測(cè) 其A值。溶菌活力UL按(AO-A)/A式計(jì)算。③感染實(shí)驗(yàn)感染試驗(yàn)于預(yù)先消毒的盛有15L砂濾海水(鹽度29 30%。)的透明水族箱中進(jìn)
行，從A，B-U B-2.....Gg-4各個(gè)組隨機(jī)取稚鮑200顆，設(shè)兩個(gè)重復(fù)。向各組水體中添加副
溶血弧菌液，使水體中副溶血弧菌菌體濃度達(dá)到108cfu/mL。實(shí)驗(yàn)期間不流水養(yǎng)殖，正常投 餌，以5L/h/m3連續(xù)曝氣，水溫為22°C，pH控制在7. 2。人工感染后，連續(xù)觀察5天，最終計(jì) 算成活率，采用相對(duì)存活率(Relative Percentage Survival, RPS)計(jì)算式RPS (% ) = (1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)X 100%此種方法對(duì)稚鮑養(yǎng)殖的各項(xiàng)指標(biāo)影響具體見(jiàn)下表表1 5天換水對(duì)稚鮑生長(zhǎng)情況和免疫力的影響組別稚鮑初始 殼長(zhǎng) (mm)收稚鮑平 均殼長(zhǎng) (mm)收稚鮑 平均重 量(mg)收稚鮑 總里 (只)存活率 (%)酚氧化 酶活性 (U/mL)溶菌酶 活性 (U/mL)RPS(%)A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630B-I3.5311.84232.37858285.821.3450.60988..2B-23.5412.65283.40865686.561.4560.70789.5B-33.5313.06311.86877487.741.6650.79695.4B-43.5213.42338.37899689.961.7320.918100b-13.5210.87179.81856485.641.4340.60686.9b-23.5111.54215.15868586.851.4830.70489.6b-33.5312.43268.87878787.871.6710.79894.7b-43.5513.05311.14899289.921.7590.909100Bb-I3.5412.37264.99857785.771.3780.59989.2Bb-23.5312.83295.67866086.601.5010.70493.5Bb-33.5513.61352.94886388.631.6730.79998.1Bb-43.5213.82369.53899789.971.8080.926100表2 10天換水對(duì)稚鮑生長(zhǎng)情況和免疫力的影響
酚氧化RPS(%；)
收稚鮑平 收稚鮑平收稚鮑溶菌酶
稚鮑初始存活率酶(PO)
組別均殼長(zhǎng) 均重量 總量活性
殼長(zhǎng)(mm)(%) 活性
(mm)(mg) (只)(U/mL)
(U/mL)
A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630C-I3.5411.94238.31846784.671.3320.61488.7C-23.5412.66284.07864586.451.5010.70689.5C-33.5413.07312.58879687.961.6850.79894.2C-43.5113.34332.35896289.621.7760.915100.c-13.5410.86179.32848584.851.4420.61685.6c-23.5211.62219.66867786.771.4950.70588.4c-33.5512.47271.47878687.861.6620.80493.6c-4
3.5113.08313.29898689.861.7820.908100Cc-I3.5512.36264.35844684.461.3510.60989.2Cc-23.5112.89299.84864786.471.5320.70793.5Cc-33.5413.67357.63879687.961.6800.79996.6Cc-43.5413.85371.94897889.781.7930.924100
表3 15天換水對(duì)稚Ii■生長(zhǎng)情況和免疫力的影響
組別稚鮑初 始?xì)らL(zhǎng) (mm)收稚鮑平 均殼& (mm)收稚鮑平 均重量 (mg)收稚鮑 總量 (只)存活率 (%)酚氧化 酶(PO) 活性 (U/mL)溶菌酶 活性 (U/mL)RPS(%)A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630D-I3.5511.76227.69854485.441.3710.61488.4D-23.5512.65283.40863886.381.4920.70888.8D-33.5413.14317.62875687.561.6940.80393.6D-43.5513.36333.85895689.561.7660.916100d-13.5410.85178.82853485.341.4680.61685.2d-23.5511.46210.71864986.491.4520.70688.5d-33.5412.36264.35876787.671.6740.80593.4d-43.5313.03309.71894989.491.7620.914100Dd-I3.5412.35263.71854485.441.3980.60889.5Dd-23.5312.79292.91865386.531.5490.70793.5Dd-33.5413.55348.29885888.581.6760.79796.8Dd-43.5513.24324.93899889.981.7940.928100
表4 20天換水對(duì)稚Ι ■生長(zhǎng)情況和免疫力的影響
組別稚鮑初始 殼長(zhǎng)(mm)收稚鮑平 均殼長(zhǎng) (mm)收稚鮑平 均重量 (mg)收稚鮑 總量 (只)存活率 (%)酚氧化 酶(PO) 活性 (U/mL)溶菌酶 活性 (U/mL)RPS(%)A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630E-I3.5111.66221.93845884.581.3920.61488.5
E-23,.5212.55276.73864186.411.5020.70888.9E-33.5413.07312.58878587.851.6800.80393.6E-43,.5413.22323.46895689.561.7910.916100e-13,.5310.63168.16847584.751.4650.61685.4e-23..5211.42208.51867486.741.4830.70688.3e-33..5512.36264.35878987.891.6760.80592.4e-43,.5313.04310.43898589.851.7880.914100Ee-I3..5312.25257.36843684.361.3450.60889.2Ee-23.,5412.78292.23866386.631.5670.70793.4Ee-33.,5413.46341.40872887.281.6760.79796.7Ee-4

3. 表.53 13.19 5 25天換水對(duì)稚舍321.26 8958 89.58 包生長(zhǎng)情況和免疫力的影響1.7930.928100
收稚鮑平收稚鮑平收稚鮑
組稚鮑初始?jí)哟婊盥?br> 均殼長(zhǎng)均重量 總量
別 長(zhǎng)(mm)(%)
(mm)(mg) (只)
酚氧化 酶(PO)
活性
溶菌酶 活性 (U/mL)
RPS(%)
(U/mL)A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630F-I3.5111.66221.93845184.511.4052.46487.5F-23.5212.55276.73864586.451.5012.55888.6F-33.5413.07312.58878787.871.6962.65392.3F-43.5413.22323.46895689.561.8432.766100f-13.5310.63168.16847784.771.5082.46684.5f-23.5211.42208.51867286.721.5392.55687.6f-33.5512.36264.35878587.851.6962.65592.8f-43.5313.04310.43897689.761.7842.764100Ff-I3.5312.25257.36851585.151.4522.45888.4Ff-23.5412.78292.23865786.571.5912.55792.5Ff-33.5413.46341.40873687.361.7022.64795.7Ff-4

3.53 13.19 表6 30天換水對(duì)稚舍321.26 8946 89.46 包生長(zhǎng)情況和免疫力的影響1.7482.778100
11組別稚鮑初始 殼長(zhǎng)(mm)收稚鮑平 均殼長(zhǎng) (mm)收稚鮑平 均重量 (mg)收稚鮑 總量 (只)存活 率 (%)酚氧化酶 (PO) 活性 (U/rnL)溶菌酶 活性 (U/mL)RPS (%)A3.5410.58165.80624562.450.7660.4630G-I3.5111.58217.40843884.381.4050.61887.6G-23.5312.47271.47863586.351.5260.71588.4G-33.5113.24324.93876487.641.6820.80792.4G-43.5213.19321.26894989.491.8610.917100g-i3.5210.44159.31847784.771.4920.61784.8g-23.5211.27200.40866386.631.5930.70687.6g-33.5412.18252.97877887.781.7080.80491.5g-43.5212.88299.14897189.711.7990.917100Gg-I3.5412.14250.49850485.041.4550.60588.4Gg-23.5112.65283.40863586.351.5920.70392.3Gg-33.5313.38335.35873887.381.7340.80695.6Gg-43.5113.17319.81895389.531.8260.927100從表1-6可以看出，在相同的換水周期下，隨著蛭弧菌蛭質(zhì)體的濃度升高，成活率 都有一定升高，且都明顯高于A組，說(shuō)明采用新型的添加蛭弧菌蛭質(zhì)體的方法，明顯節(jié)約養(yǎng) 殖成本，以2 X 2 X 0. 75m的水池為例，按每天兩個(gè)交換量的流水方式，水深0. 45m來(lái)計(jì)算，每 天需要3. 6噸海水，以海水的成本0. 264元/噸(養(yǎng)殖場(chǎng)提供的數(shù)據(jù))，這樣一口水池每天 的耗水費(fèi)用達(dá)到0. 95元，而應(yīng)用蛭弧菌蛭質(zhì)體的日耗水費(fèi)用只有0. 047元，兩者相差0. 9 元。因此這種新方法不僅大大節(jié)約了用水量，還節(jié)省了大量的人力，物力資源，節(jié)約了養(yǎng)殖 成本，提高了成活率。從不同換水周期來(lái)看，相同濃度下的各組稚鮑成活率，體長(zhǎng)等都沒(méi)有太大的變化， 說(shuō)明采用新型養(yǎng)殖方法，5-30天不換水蛭弧菌蛭質(zhì)體仍能促進(jìn)稚鮑的生長(zhǎng)。綜合來(lái)看，在 lOpfu/mL濃度下，30天不換水是比較經(jīng)濟(jì)的方式，采用這樣的方法，效果較佳。免疫力方面，添加蛭弧菌蛭質(zhì)體的各組免疫指標(biāo)明顯高于A組；感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，A組的存活率為0%，其他所有添加過(guò)蛭弧菌蛭質(zhì)體的各組相對(duì)存活率為84. 5-100%o 說(shuō)明蛭弧菌蛭質(zhì)體能夠顯著提高稚鮑的免疫力。水質(zhì)方面，氨態(tài)氮用次溴酸納氧化法測(cè)定(GB12763.4-91)；亞硝酸鹽氮用重 氮-偶氮光度法測(cè)定(GB12763.4-91)。應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組的水質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果 表明，A組水池中的各項(xiàng)水質(zhì)測(cè)定值均高于試驗(yàn)組B、C、D. . . G組。其中，A組氨態(tài)氮的檢測(cè) 結(jié)果為0. 0356mg/L, B-I與Gg-4之間最低為0. 0258mg/L、最高為0. 0354mg/L ；A組檢測(cè)亞 硝酸鹽氮結(jié)果為0. 051mg/L, B-I與Gg_4之間最低為0. 043mg/L、最高為0. 051mg/L。由以上結(jié)果分析可知，應(yīng)用濃度為IO1-IO7PfVmL蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液可有效改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，調(diào)節(jié)水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮的含量，從而提供有利于稚鮑生存的水體環(huán) 境?；【鷶?shù)方面，采用涂布TCBS平板法檢測(cè)，對(duì)照組A水體弧菌數(shù)在2. 67 X 102cfu/mL左 右，然而添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液的各組弧菌總數(shù)一般在2. 35-3. 82X IO1CfuAiL,說(shuō)明蛭弧 菌蛭質(zhì)體能有效控制水體的弧菌數(shù)，并達(dá)到改善水質(zhì)的目的細(xì)菌數(shù)方面，綜合來(lái)看，無(wú)論是 在水體，還是在餌料，抑或兩者中都添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，都能明顯的提高稚鮑的體質(zhì)， 增強(qiáng)稚鮑的免疫力，而且能夠改善水質(zhì)，達(dá)到節(jié)水節(jié)能、提高成活率的良好效果。從蛭弧菌蛭質(zhì)體添加方式來(lái)看，不論在水體、餌料，或者是兩者均使用蛭弧菌蛭質(zhì) 體，三種方法都能大大提高稚鮑的成活率、促進(jìn)稚鮑的生長(zhǎng)。但在養(yǎng)殖水體和餌料中均添加 蛭弧菌蛭質(zhì)體的方法效果最佳。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例限 制，其他任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理所作的改變、修飾、替代、均應(yīng)為等效的置換， 都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種節(jié)水型稚鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開(kāi)始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液；且每5 30天換水一次，每次為全池?fù)Q水；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)到1.0 1.6cm時(shí)，即可采收稚鮑；所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其簡(jiǎn)稱(chēng)為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209172，保藏日期為2009年8月7日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述鋪磚是先將磚洗刷干凈并用高 錳酸鉀溶液消毒，消毒后再采取騎疊式擺磚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述海水在注入前經(jīng)過(guò)砂濾和沉淀 處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述投喂餌料時(shí)要先停止曝氣，投餌 0. 5-lh后再開(kāi)始曝氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述稚鮑下池后，曝氣量控制在 10-100L/h/m3，光照控制在 50-2001ux，水溫控制在 15_28°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述在投喂的餌料中添加蛭弧菌蛭 質(zhì)體菌液是指用濃度為10-107pfU/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液浸泡餌料20 40分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述在養(yǎng)殖水體中添加的蛭弧菌蛭 質(zhì)體菌液，使蛭弧菌蛭質(zhì)體在水體中的濃度至少達(dá)到10pfu/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述每次換水后都立即添加蛭弧菌 蛭質(zhì)體菌液，并使蛭弧菌蛭質(zhì)體在水體中的濃度至少達(dá)到10pfu/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌蛭質(zhì)體在水體中的濃 度為 10-107pfu/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)所述的養(yǎng)殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌 液的制備方法為在含副溶血弧菌的DNB液體培養(yǎng)基中接入蛭弧菌BDFM05，恒溫?fù)u床150rpm 300rpm、 20 35°C培養(yǎng)24 48h ；培養(yǎng)液于4°C 6000 8000rpm離心15 20min，取沉淀，向沉淀 中加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種節(jié)水型稚鮑養(yǎng)殖方法，養(yǎng)殖過(guò)程如下(1)在養(yǎng)殖池內(nèi)鋪磚，然后注入海水；(2)稚鮑下池，同時(shí)開(kāi)始曝氣；(3)定期投喂餌料，并在養(yǎng)殖水體中和/或投喂的餌料中添加蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液；且每5-30天換水一次，每次換水量為一個(gè)量程；(4)當(dāng)稚鮑體長(zhǎng)達(dá)到1.0-1.6cm時(shí)，即可采收稚鮑；所述菌株為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOM209172，保藏日期為2009年8月7日。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有(1)能節(jié)能減排，更環(huán)保；(2)蛭質(zhì)體制備、保存更方便，耐受力強(qiáng)，殺菌作用時(shí)間更久；(3)能夠明顯改善稚鮑體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101982070SQ201010270789
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔣小平, 蔡俊鵬 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)