專利名稱：一種能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
自上世紀50年代開始，抗生素作為生長促進劑廣泛的應(yīng)用于飼料中。但由于抗生 素的長期使用，導(dǎo)致動物腸道正常菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥菌株，而且抗生素在畜禽產(chǎn)品中的殘 留直接影響人類的健康安全和生態(tài)環(huán)境。很多國家和飼養(yǎng)者反對抗生素作為生長促進劑， 歐盟和美國等許多國家都已經(jīng)從立法上限制了抗生素的使用。在我國，由于近幾年來發(fā)生 的食品安全事件，人們的健康意識不斷增強以及對綠色健康食品的日趨熱衷，尋找對動物 和人類有益無害的飼料藥物和抗生素替代品是急需解決的問題。益生菌制劑是最有前途的抗生素替代品，無論在食品還是飼料中，益生菌的生理 功效已得到人們的一致認同。益生菌在國內(nèi)外都有非常廣泛的應(yīng)用。目前美國FDA準許 直接飼喂的微生物有40多種，年使用量在30萬噸以上；在歐洲僅法國市場上銷售的益生 菌制劑品種就不下50個；日本及東南亞等國對益生菌的使用也十分普遍，估計使用量也在 10000噸以上；我國農(nóng)業(yè)部第1126號公告公布的允許使用的飼料添加劑品種目錄中，飼料 級微生物添加劑有16種。隨著養(yǎng)殖戶對益生菌的認識不斷深入及對抗生素弊端的認識，益 生菌制劑的使用量在逐年增加，目前估計年使用量在10萬噸以上。在益生菌制劑中最受人們關(guān)注的就是乳酸菌制劑，乳酸菌是動物腸道的優(yōu)勢菌群 之一，能產(chǎn)酸和細菌素，抑制有害菌的生長繁殖，維持腸道菌群平衡，還能產(chǎn)生免疫活性，而 且能活體進入腸道的乳酸菌比死菌的作用大得多，但是一般乳酸菌的營養(yǎng)要求較高，對不 良環(huán)境的抵抗力差，特別是抗干燥、抗高溫的能力較弱，保存性都差，不利于飼料的加工、運 輸和貯存。作為活性因子，耐胃酸并順利到達腸道及定植存活的能力較弱。而乳酸芽孢桿 菌，其學名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，該菌除具備普通乳酸菌的優(yōu)點外，還具 備耐酸、耐熱、耐干燥的特點，芽孢的產(chǎn)生可以防止生產(chǎn)和貯存過程中菌數(shù)衰減的問題。乳 酸芽孢桿菌在動物生產(chǎn)中有很重要的作用，具體的作用方式為乳酸芽孢桿菌進入動物機體 后，能在胃腸道中產(chǎn)生乳酸等物質(zhì)，能降低胃中PH值，不僅激活胃蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胃蛋白 酶，促進動物體對蛋白飼料的消化，同時還為動物機體內(nèi)優(yōu)勢菌群(乳酸菌、雙歧桿菌等) 創(chuàng)造有利于生長繁殖的環(huán)境，減少有害菌的侵害。乳酸芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素能粘附于有 害菌的細胞膜上，使有害菌細胞膜表面形成通透性通道，胞內(nèi)物質(zhì)流失而導(dǎo)致有害菌死亡。 該益生菌還能分泌大量的酶類，在補充動物體自身酶源不足外，還能促進飼料消化，尤其是 大腸后段的飼料消化，減少氨氮等的排放，改善畜舍環(huán)境，是一種非常適合飼料和養(yǎng)殖業(yè)應(yīng) 用的益生菌。為了更好將乳酸芽孢桿菌進行工業(yè)化生產(chǎn)，國內(nèi)的科研人員對乳酸芽孢桿菌進行 了大量的研究工作。篩選培養(yǎng)基成分以提高其活菌數(shù)就是其中之一。劉鑫2002年碩士論 文中得出芽孢乳酸桿菌(凝結(jié)芽孢桿菌TQ33)的高密度培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)蛋白胨10 ；酵母膏10 ；葡萄糖6 ；MgS04. 7H20 1 ；K2P04 2 ；MnS04 :50ppm，用過濾培養(yǎng)法獲得 最終菌體濃度為1.5X101(lCFU/mL。葛風清等(2007)用麩皮、豆粕和無機離子做培養(yǎng)基，搖 瓶培養(yǎng)56h，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，生物量達到19.68。崔東良等(2007)利用優(yōu)化后培養(yǎng) 基(玉米粉 15g/L 豆粕粉 10g/L(NH4)2S046g/L玉米漿6g/L MgS04. 7H20 lg/LK2HP04. 3H20 2g/L MnS04 0. 05g/L)培養(yǎng)培養(yǎng)24h活菌數(shù)量達到7. 5 X 109CFU/mL, 36h活菌數(shù)量達到 9. 3X 109CFU/mL。王進華等(2003)發(fā)酵培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生7. 5X 107CFU/mL以上的芽 孢(活菌計數(shù))，占總菌數(shù)的52-58%。按目前的研究成果來看，乳酸芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成不盡相同，但總體活菌數(shù) 還是偏低，選擇一種乳酸芽孢桿菌高活菌數(shù)的培養(yǎng)基組成對于工業(yè)化生產(chǎn)有非常重要的意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。本發(fā)明通過添加一定比例的生物素和維生素E，并且調(diào)整菌種生長所需的碳源、氮 源和無機離子的比例，提高了乳酸芽孢桿菌的萌發(fā)和生長數(shù)量，提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)， 從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，按總質(zhì)量分數(shù)100%計，包括 生物素0. 003-0. 006%，維生素E 0. 01-0. 05%，吐溫800. 01-0. 03%，酵母膏1%，葡萄糖 1. 5-2. 0%，磷酸氫二鉀 0. 15-0. 2%，硫酸鎂 0. 08-0. 15%，硫酸錳 0. 03-0. 06%，余量為水。優(yōu)選，所述的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，按總質(zhì)量分數(shù)100%計，包括 生物素0.005%，維生素E 0.03%，吐溫800. 02%，酵母膏1%，葡萄糖1.8%，磷酸氫二鉀 0. 18%，硫酸鎂0. 1%，硫酸錳0. 05%，余量為水。所述的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的PH值優(yōu)選為7. 0。本發(fā)明的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基是通過以下方法配制的，按照培養(yǎng) 基各個組份的含量，秤取生物素，維生素E，吐溫80，酵母膏，葡萄糖，磷酸氫二鉀，硫酸鎂， 硫酸錳，加入到水中，攪拌充分溶解，調(diào)節(jié)pH值為7. 0，然后滅菌備用。本發(fā)明的生物素、維生素E、吐溫80、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鎂 都是現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)品，都能從市場上購買到。本發(fā)明通過添加一定比例的生物素和維生素E，并且調(diào)整菌種生長所需的碳源、 氮源和無機離子的比例，提高了乳酸芽孢桿菌的萌發(fā)和生長數(shù)量。以本發(fā)明的能提高乳 酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基作為乳酸芽孢桿菌的培養(yǎng)基，按常規(guī)培養(yǎng)方法，經(jīng)種子培養(yǎng)、 擴大培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，乳酸芽孢桿菌的種子培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度為36°C，培養(yǎng)時間為 20-22h ；擴大培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度為36°C，培養(yǎng)時間為24h ；發(fā)酵培養(yǎng)的條件為培養(yǎng) 溫度為36°C，培養(yǎng)時間為36h，最終發(fā)酵液的活菌總數(shù)可達IoiiCFUAiL以上，培養(yǎng)效果好， 可用于大量增殖乳酸芽孢桿菌，對于工業(yè)化生產(chǎn)具有非常重要的意義。
具體實施例方式以下是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1
4
(1)配制能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基按總質(zhì)量分數(shù)100%計，按照下述組份的含量，生物素0.005%，維生素E 0. 03%, 吐溫800. 02%，酵母膏1%，葡萄糖1.8%，磷酸氫二鉀0. 18%，硫酸鎂0. 1%，硫酸錳 0. 05%，余量為水，秤取上述物質(zhì)，將除水以外的物質(zhì)加入到水中，混合均勻，充分溶解，調(diào) 節(jié)PH值為7. 0，而制得能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，將該培養(yǎng)基滅菌備用。(2)種子培養(yǎng)將乳酸芽孢桿菌單菌落接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培 養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為20 22h，制成發(fā)酵 種子。(3)擴大培養(yǎng)將發(fā)酵種子無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的 小發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為24h，接種量為10%， 制成擴大培養(yǎng)菌液。(4)發(fā)酵培養(yǎng)將擴大培養(yǎng)菌無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng) 基的大發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為36h，接種量為 10%,發(fā)酵結(jié)束，形成最終發(fā)酵液。(5)發(fā)酵液活菌數(shù)的檢測。發(fā)酵液活菌總數(shù)的檢測，采用常用的稀釋平板活菌計數(shù)法，培養(yǎng)基為本實施例的 能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。經(jīng)檢測最終發(fā)酵液的活菌總數(shù)為6X IOiiCFUAIL實施例2 (1)配制能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基按總質(zhì)量分數(shù)100%計，按照下述組份的含量，生物素0. 003%，維生素E 0. 05%, 吐溫800. 01 %，酵母膏1%，葡萄糖2.0%，磷酸氫二鉀0. 15%，硫酸鎂0. 15%，硫酸錳 0. 03%，余量為水，秤取上述物質(zhì)，將除水以外的物質(zhì)加入到水中，混合均勻，充分溶解，調(diào) 節(jié)PH值為7. 0，而制得能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，將該培養(yǎng)基滅菌備用。(2)種子培養(yǎng)將乳酸芽孢桿菌單菌落接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培 養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為20 22h，制成發(fā)酵 種子。(3)擴大培養(yǎng)將發(fā)酵種子無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的 小發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為24h，接種量為10%， 制成擴大培養(yǎng)菌液。(4)發(fā)酵培養(yǎng)將擴大培養(yǎng)菌無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng) 基的大發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為36h，接種量為 10%,發(fā)酵結(jié)束，形成最終發(fā)酵液。(5)發(fā)酵液活菌數(shù)的檢測。
發(fā)酵液活菌總數(shù)的檢測，采用常用的稀釋平板活菌計數(shù)法，培養(yǎng)基為本實施例的 能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。經(jīng)檢測最終發(fā)酵液的活菌總數(shù)為2X lO^CFU/mL。實施例3 (1)配制能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基按總質(zhì)量分數(shù)100%計，按照下述組份的含量，生物素0. 006%，維生素E 0.01%, 吐溫800. 03 %，酵母膏1 %，葡萄糖1. 5 %，磷酸氫二鉀0. 2 %，硫酸鎂0. 08 %，硫酸錳 0. 06%，余量為水，秤取上述物質(zhì)，將除水以外的物質(zhì)加入到水中，混合均勻，充分溶解，調(diào) 節(jié)PH值為7. 0，而制得能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，將該培養(yǎng)基滅菌備用。(2)種子培養(yǎng)將乳酸芽孢桿菌單菌落接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培 養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為20 22h，制成發(fā)酵 種子。(3)擴大培養(yǎng)將發(fā)酵種子無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的 小發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為24h，接種量為10%， 制成擴大培養(yǎng)菌液。(4)發(fā)酵培養(yǎng)將擴大培養(yǎng)菌無菌接種到含有本實施例的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng) 基的大發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間為36h，接種量為 10%,發(fā)酵結(jié)束，形成最終發(fā)酵液。(5)發(fā)酵液活菌數(shù)的檢測。發(fā)酵液活菌總數(shù)的檢測，采用常用的稀釋平板活菌計數(shù)法，培養(yǎng)基為本實施例的 能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。經(jīng)檢測最終發(fā)酵液的活菌總數(shù)為3X lO^CFU/mL。
權(quán)利要求
一種能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，其特征在于，按總質(zhì)量分數(shù)100％計，包括生物素0.003 0.006％，維生素E 0.01 0.05％，吐溫800.01 0.03％，酵母膏1％，葡萄糖1.5 2.0％，磷酸氫二鉀0.15 0.2％，硫酸鎂0.08 0.15％，硫酸錳0.03 0.06％，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，其特征在于，按總質(zhì) 量分數(shù)100%計，包括生物素0.005%，維生素E 0.03%，吐溫800. 02%，酵母膏1%，葡萄 糖1.8%，磷酸氫二鉀0. 18%，硫酸鎂0. 1%，硫酸錳0. 05%，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基，其特征在于，該能 提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基的PH值為7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基。按總質(zhì)量分數(shù)100％計，它包括生物素0.003-0.006％，維生素E 0.01-0.05％，吐溫800.01-0.03％，酵母膏1％，葡萄糖1.5-2.0％，磷酸氫二鉀0.15-0.2％，硫酸鎂0.08-0.15％，硫酸錳0.03-0.06％，余量為水。以本發(fā)明的能提高乳酸芽孢桿菌活菌數(shù)的培養(yǎng)基作為乳酸芽孢桿菌的培養(yǎng)基，按常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)乳酸芽孢桿菌，其最終發(fā)酵液的活菌總數(shù)可達1011CFU/ml以上，培養(yǎng)效果好，可用于大量增殖乳酸芽孢桿菌，對于工業(yè)化生產(chǎn)具有非常重要的意義。
文檔編號C12N1/20GK101948783SQ20101027070
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者曹要玲, 鄭文才 申請人:廣州廣牧豐生物技術(shù)有限公司