專利名稱：一種凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物對(duì)蝦屬 凡納濱對(duì)蝦Uitopenaeus vannamei)fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5微衛(wèi)星遺傳變異圖譜的 方法。
背景技術(shù)：
凡 內(nèi) 賓)(寸蟲下{Li topenaeus vannamei )，俗稱南美白對(duì)蝦iPermeus vannamei)， 屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(fr^siacea)、十足目(Mecapoda、、游泳亞目 (Na tan tia )、對(duì)蝦科 QPenaeidae )、對(duì)蝦屬 iPenseus )、Li to-penaeus 亞屬，是廣溫廣鹽性熱 帶蝦類，是目前世界上三大養(yǎng)殖對(duì)蝦(中國(guó)對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦)中單產(chǎn)量最高的蝦 種，在對(duì)蝦漁業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。1988年7月，凡納濱對(duì)蝦由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所從美國(guó)夏威夷引進(jìn)我國(guó)，1992 年8月人工繁殖獲得了初步的成功，1994年通過人工育苗獲得了小批量的蝦苗，1999年深 圳天俊實(shí)業(yè)股份有限公司與美國(guó)三高海洋生物技術(shù)公司合作，引進(jìn)美SPF凡納濱對(duì)蝦種蝦 和繁育技術(shù)，成功地培育出了 SPF凡納濱對(duì)蝦苗。至此，凡納濱對(duì)蝦在我國(guó)被廣泛養(yǎng)殖。近年來，凡納濱對(duì)蝦在我國(guó)不論是海水，還是低鹽度海水及 淡水中養(yǎng)殖都取得了一定的進(jìn)展。目前，凡納濱對(duì)蝦已是我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)品種。 2007年，我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量101萬噸，占我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的80 %，同年，我國(guó)對(duì) 蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量126萬噸，占世界對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的37 %。但病害和養(yǎng)殖使得凡納濱對(duì)蝦資源 迅速衰減，尤其自90年代蝦病爆發(fā)以來，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)受到重挫，蝦病的流行使抗病 品系選育成為必要和需要解決的問題。本發(fā)明做出之前，國(guó)內(nèi)外有類似的研究報(bào)告，國(guó)內(nèi)中科院海洋研究所徐鵬等 (2001)發(fā)表的《中國(guó)對(duì)蝦微衛(wèi)星DNA的篩選》，張留所(2006)等發(fā)表的《凡納濱對(duì)蝦分子標(biāo) 記篩選、連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位》國(guó)外Franklin P6rez等(2005)在凡納濱對(duì)蝦中找到了 112對(duì)微衛(wèi)星，目前，利用微衛(wèi)星標(biāo)記在凡納濱對(duì)蝦多態(tài)性圖譜的構(gòu)建、特異性遺傳標(biāo)記等 方面的應(yīng)用尚未報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了簡(jiǎn)便快速的鑒定凡納濱對(duì)蝦fx5遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳 變異圖譜，豐富現(xiàn)有的凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記，尋找更多的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的微衛(wèi)星標(biāo) 記，提供了一種凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法。本發(fā)明是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的一種凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺 傳變異圖譜的方法，其特征在于包括以下步驟先提取凡納濱對(duì)蝦基因組并稀釋備用，再利 用凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì) 凡納濱對(duì)蝦不同群體或者群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚
3丙烯酰胺凝膠檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從 而獲得凡納濱對(duì)蝦在fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜(如圖1所示)。提取凡納濱對(duì)蝦基因組DNA，將其稀釋成50ng/ul，每個(gè)反應(yīng)加入Iul，反應(yīng)總體積 為 20ul。fx5微衛(wèi)星DNA序列的特異性引物核苷酸序列分別為正鏈5’ -TCTGGGACAATTTTGAGGATG _3，，負(fù)鏈 5，-GTCATCATCATTTCCATCTTTA _3，，退火溫度為 50°C。其PCR反應(yīng)加樣參數(shù)正反向引物各為0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2.0 mM Mg2+，0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到20ul。使用該引物的時(shí)設(shè)置 PCR程序參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，50°C退火1分鐘，72°C延伸1分 鐘，重復(fù)這個(gè)循環(huán)35次；之后延伸5分鐘，4 °C保存。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電 泳，利用長(zhǎng)度差異為50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作為分子量標(biāo)記， 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%-8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳_銀染系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)PCR產(chǎn)物中加上變性 Buffer之后95°C變性5分鐘，之后立刻置于冰上降溫，使用微量進(jìn)樣器上樣5ul，85 W恒 功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，約120分鐘，1%。的硝酸銀染色，顯色液(30 g NaOH, 0. 5g四硼酸鈉，8 ml 37 %的甲醛溶解至2 L超純水)顯色，超純水終止顯色，干燥放在 UTA-2100XL型號(hào)掃描儀中掃描保存圖片，分析多態(tài)性，確定各個(gè)個(gè)體的基因型，并進(jìn)一步 得到fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明適用于凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，家系鑒定，分子群體遺傳 學(xué)，遺傳圖譜的構(gòu)建，重要經(jīng)濟(jì)性狀的定位，功能基因的研究，進(jìn)一步用于輔助凡納濱對(duì)蝦 分子遺傳育種和養(yǎng)殖。現(xiàn)有的凡納濱對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記還不夠豐富，建立凡納濱對(duì)蝦遺傳連鎖圖譜，物理 圖譜，以及QTL定位需要更多的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的微衛(wèi)星標(biāo)記。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā) 明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明可以簡(jiǎn)便快速的鑒定凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳變異 圖譜，方法簡(jiǎn)便，所得結(jié)果可直觀的檢測(cè)出凡納濱對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體的基因型。(2)本發(fā)明的核心是fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的特異性引物，其核苷酸序列為正鏈 5，_ TCTGGGACAATTTTGAGGATG -3，，負(fù)鏈 5，-GTCATCATCATTTCCATCTTTA _3，，退火溫度為 50°C，可在凡納濱對(duì)蝦總?cè)簷z測(cè)中呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性。(3)本發(fā)明主要應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，家系鑒定， 分子群體遺傳學(xué)，遺傳圖譜的構(gòu)建，重要經(jīng)濟(jì)性狀的定位，功能基因的研究。


圖1本發(fā)明的fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在60尾凡納濱對(duì)蝦個(gè)體中的基因型圖譜，編號(hào) 1-60為凡納濱對(duì)蝦的60個(gè)個(gè)體，M為PBR322標(biāo)準(zhǔn)分子量。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例首先提取凡納濱對(duì)蝦基因組并稀釋備用，再利用凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA核心 序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同群體或者群體內(nèi) 個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn) 的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得凡納濱對(duì)蝦在fx5遺傳標(biāo) 記基因座位的多態(tài)性圖譜(如圖1所示)。1提取凡納濱對(duì)蝦基因組
1)取凡納濱對(duì)蝦肌肉30mg置于2.0 ml的離心管中，剪碎，加入600 ul STE裂解緩沖 液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl, ρΗ 8.0 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0)，50 μ 1 SDS 以及5 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)，混勻
2)56。C消化處理，直到裂解液澄清，6000rpm離心3 min
3)取上清，加入等體積飽和酚(250μ 1)、氯仿/異戊醇(24:1) (250 μ )，輕輕上下 顛倒混勻數(shù)分鐘，抽提去除蛋白，10000轉(zhuǎn)離心10 min
4)取上清液，重復(fù)一次步驟3，直至水相和有機(jī)相之間無蛋白層為止
5)取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500μ 1)，輕輕晃動(dòng)20分鐘，10000轉(zhuǎn)離心10
分鐘
6)取上清液，加入十分之一體積的NaAc(3 mol/L, PH值為5. 2)，緩慢搖勻，加2倍 體積的預(yù)冷的無水乙醇，放置于-80°C冰箱中大約30分鐘，10000轉(zhuǎn)離心10 min。將核酸沉 淀于管底
7)棄上清，加70%乙醇(1 ml)洗滌沉淀，4°C離心5 min (8000 rpm)
8)棄酒精，將離心管放在真空干燥器中干燥沉淀，直到乙醇全部揮發(fā)
9)加入一定量(100μ 1)無菌超純水或IXTE緩沖液和5 μ 1 RNaseA (10 mg/ml)， 37°C消化 RNA 30 min，-20°C保存?zhèn)溆谩?微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)
通過微衛(wèi)星查找軟件 SSRHunter 查找 LV_ES_RA29A15f (GeneBank FE058419. 1)EST 序列得到核心重復(fù)序列(TGA)m…(ATG)n，m=5-10, n=5_15，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Primer 5. 0對(duì)上述EST序列上下游進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到LV_ES_RA29A15f微衛(wèi)星引物，其核 苷酸序列為正鏈 5，- TCTGGGACAATTTTGAGGATG -3，，
負(fù)鏈 5，-GTCATCATCATTTCCATCTTTA -3，，退火溫度50°C。3 PCR 擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)正反向引物各為0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2. 0 mM Mg2+，0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到20ul。使用該引物的時(shí)設(shè)置PCR程 序參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性30s，50°C退火1 min，72°C延伸1 min，重復(fù)這 個(gè)循環(huán)35次；之后延伸5 min,4 °C保存。4電泳檢測(cè)
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%-8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)PCR產(chǎn)物中加 上變性Buffer之后95°C變性5分鐘，之后立刻置于冰上降溫，使用微量進(jìn)樣器上樣5ul，
585 W恒功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，約120分鐘，1%。的硝酸銀染色，顯色液(30 g Na0H，0. 5g四硼酸鈉，8 ml 37 %的甲醛溶解至2 L超純水)顯色5min，超純水終止顯色， 干燥放在UTA-2100XL型號(hào)掃描儀中掃描，保存圖片，分析多態(tài)性，得到fx5遺傳標(biāo)記基因 座位的多態(tài)性圖譜(如圖1所示)。
權(quán)利要求
一種凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法，其特征在于包括以下步驟先提取凡納濱對(duì)蝦基因組并稀釋備用，再利用凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA核心序列(TGA)m…(ATG)n, 其中m=5 10, n=5 15，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO1 2所示；然后使用該引物對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同群體或者群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得凡納濱對(duì)蝦在fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的 方法，其特征在于其PCR反應(yīng)加樣參數(shù)為正反向引物各為0.2 uM，0. 2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2. 0 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到20ul ；使用該引物 的時(shí)設(shè)置PCR程序參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，50°C退火1分鐘，72°C 延伸1分鐘，重復(fù)這個(gè)循環(huán)35次；之后延伸5分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方 法，其特征在于對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物在6°/Γ8%的聚丙 烯酰胺凝膠上電泳，干燥后在掃描保存圖片，分析多態(tài)性，得到各個(gè)個(gè)體的基因型，并進(jìn)一 步確定fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方 法，其特征在于在PCR產(chǎn)物的檢測(cè)中利用長(zhǎng)度差異為50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker 作為電泳的分子量標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的 方法，其特征在于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳_銀染系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)PCR產(chǎn) 物中加上變性Buffer之后95°C變性5分鐘，之后立刻置于冰上降溫，使用微量進(jìn)樣器上樣 5ul,85 W恒功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，120分鐘后，用質(zhì)量1%。的硝酸銀染色，用 30 g Na0H，0. 5g四硼酸鈉，8 ml體積37 %的甲醛溶解至2 L超純水的顯色液顯色，后用 超純水終止顯色。
全文摘要
一種凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法，其特征在于包括以下步驟先提取凡納濱對(duì)蝦基因組并稀釋備用，再利用凡納濱對(duì)蝦fx5微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)凡納濱對(duì)蝦不同群體或者群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得凡納濱對(duì)蝦在fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明可快捷的獲得凡納濱對(duì)蝦fx5遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方便簡(jiǎn)單，所得結(jié)果可直觀檢測(cè)出凡納濱對(duì)蝦每個(gè)個(gè)體的基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101967520SQ201010258780
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者何建國(guó), 呂玲, 李朝政, 翁少萍 申請(qǐng)人:中山大學(xué)