專利名稱：一種檢測黃牛sh2b1基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛SH2B1基因第2795位單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個體間基因組序列的差異，這些 差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失 以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學(xué) 院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組 DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。它的變異形式有顛換、轉(zhuǎn) 換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs 約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類基因編碼區(qū)單核苷 酸多態(tài)性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs, pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs，iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少，由于它在遺傳性疾病研究中卻具有重要 意義，因此，編碼區(qū)內(nèi)的cSNP的研究更受關(guān)注?；蚓幋a區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種一 種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP (Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其 所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP (Non-Synonymous cSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改 變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS), 該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種 改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進行新品種選育。在肉牛育 種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇， 達到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳 標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標(biāo)記位點信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。 標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記 技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn) 分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)作為 新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。瘦素(1印tin)由脂肪組織分泌，隨血液循環(huán)至下丘腦，通過神經(jīng)細胞膜上瘦素長型受體參與能量代謝、維持體質(zhì)量穩(wěn)定等生物學(xué)效應(yīng)，JAK2分子的活化對瘦素的這一生物 學(xué)效應(yīng)起著關(guān)鍵作用?；罨腏AK2使瘦素受體多個酪氨酸殘基磷酸化并募集胰島素受體 底物(IRM)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAB)等瘦素信號通路下游分子，以參與能量平衡和體質(zhì) 量的調(diào)節(jié)。SH2B1屬于胞漿JAK2接頭蛋白，包含SH2和PH結(jié)構(gòu)域及多個酪氨酸殘基位點。 SH2B1通過SH2結(jié)構(gòu)域與JAK2結(jié)合，增強瘦素JAK2/STAT3信號通路，參與瘦素的敏感性及 體質(zhì)量的調(diào)節(jié)。另外，活化的SH2B1通過SH2結(jié)構(gòu)域連接上游IR、IGF-IR以及其它帶磷酸 化的酪氨酸殘基的信號蛋白，同時提供多個磷酸化的位點募集下游帶SH2結(jié)構(gòu)域的信號 蛋白，參與調(diào)控脂肪細胞分化的信號通路。因此，研究哺乳動物SH2B1基因遺傳變異和分子 遺傳特征具有重要理論和實踐意義。目前，對于SH2B1基因的研究較少，且集中在小鼠和人類上，主要是關(guān)于其功能的 研究。國內(nèi)外(除SH2B1與人類肥胖之外)尚未見關(guān)于動物SH2B1基因遺傳變異的研究。 中國黃牛SH2B1基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經(jīng) 濟性狀(如體重、日增重、體高等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方 法，尋找與經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含SH2B1基因的待測黃牛 全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛SH2B1基因；用限制性內(nèi)切酶BglI 消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)果鑒定黃牛SH2B1基因第2795位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游弓丨物:cagcaactcc aactcctctg gc 22 ；下游弓I物:ctccccgggc cactccg17。所述的PCR擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性50s，65°C退火30s，72°C 延伸7s, 30 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為4%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛SH2B1基因第2795位的單核苷酸多態(tài) 性為=GG基因型表現(xiàn)為209bp和15bp條帶；GA基因型表現(xiàn)為224bp,209bp和15bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明對黃牛SH2B1基因第2795位點上的錯義突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生 變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，當(dāng)?shù)?795位點由G突變?yōu)锳時，三聯(lián)密碼GCC改變?yōu)?ACC，在轉(zhuǎn)錄過程相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)編碼氨基酸發(fā)生改變(肽鏈266位的丙基酸突變?yōu)樘K基 酸，Ala ^6Thr)，使具有重要生理功能的SH2B1基因所編碼蛋白的空間二、三級構(gòu)型發(fā)生 變化，以至影響蛋白的生物學(xué)功能。本發(fā)明提供的黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，針對第2795位點由G突 變?yōu)锳的轉(zhuǎn)換突變，通過在新設(shè)計的下游引物的3’端引入堿基錯配，構(gòu)造出當(dāng)限制性內(nèi)切 酶Bgl I所識別的切割位點。由G變?yōu)锳時，PCR擴增SH2B1基因后在錯配位置附近無法形成限制性內(nèi)切酶Bgl I識別位點，而突變沒有發(fā)生時，PCR擴增SH2B1基因后可形成Bgl I識別位點；通過電泳檢測分型可以準(zhǔn)確、快速、方便的檢測SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性GG 基因型表現(xiàn)為209bp和15bp條帶；GA基因型表現(xiàn)為2Mbp、209bp和15bp條帶；進而對3 個黃牛群體的SH2B1基因SNP的等位基因和基因型頻率的變化監(jiān)控。由于SH2B1基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、胸圍、體斜長、坐骨端寬等 生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為SH2B1基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)， 以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種 群。


圖1為黃牛SH2B1基因第2590bp 281!3bp的224bp PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖2為黃牛SH2B1基因第2590bp ^13bp的224bp PCR產(chǎn)物BglI酶切之后的 電泳結(jié)果；圖3a和圖3b為SNP的不同基因型(GG、GA)測序圖。
具體實施例方式本發(fā)明通過對黃牛SH2B1基因第2795位點錯義突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生 變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速 建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。下面結(jié)合具體樣本的檢測和性狀關(guān)聯(lián)對本發(fā)明做進一步的 詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛SH2B1基因第一外顯子區(qū)PCR-RFLP引物的設(shè)計以NCBI所公布的牛(NW_001494303)序列為參考，利用I^rimer 5. 0設(shè)計能夠擴增 包含黃牛SH2B1基因第一外顯子區(qū)SNP位點的PCR引物，其引物序列如下上游弓丨物:cagcaactcc aactcctctg gc 22 ；下游弓丨物:ctccccgggc cactccg17 ；其中，上游引物引入了錯配堿基，以便于與發(fā)生突變的SNP位點形成能夠被內(nèi)切 酶所識別。以上述引物對黃?；蚪M擴增，能夠擴增包含黃牛SH2B1基因(NW_001494303 序列)第一外顯子區(qū)域第2590bp ^13bp的224bp的基因片段，擴增后片段的電泳檢測 如圖1所示，其中，泳道1 6為檢測片段，泳道M為Marker ；對擴增的片段進行測序鑒定 后，其中，第27Mbp ^13bp的序列(5，> 3’ )如下所示TGCTGAGTTTCATGGGGGCTGAAGAGGCTGCCCCTGATCCC !GCC! GGAGTGGCCCGGGGAG ；上述序列當(dāng)中存在單核苷酸多態(tài)性當(dāng)SH2B1基因第2795bp (即SH2B1基因⑶S 區(qū)第796位)的G突變?yōu)锳時，導(dǎo)致編碼第266位的密碼子由GCC (如框線所示序列)突變 為ACC，從而形成錯義密碼子突變，即由突變?yōu)閊6Thr。而￡為設(shè)計引物時引入的 突變堿基，以便于SNP突變的檢測。當(dāng)SH2B1基因第2795bp未發(fā)生突變時，引物P進行PCR擴增SH2B1基因產(chǎn)物的第 2795bp ^05bp序列為GCCGGAGTGGC，形成了限制性內(nèi)切酶Bgl I的酶切位點；當(dāng)2795bp位 點由G突變?yōu)锳時，PCR擴增SH2B1基因產(chǎn)物的第2795bp ^05bp序列為ACCGGAGTGGC， 限制性內(nèi)切酶BglI不能識別；從而對該位點SNP多態(tài)性進行檢測。當(dāng)用限制性內(nèi)切酶BglI對引物P對應(yīng)擴增的基因片段酶切消化時，由于擴增序列中只存在上述一處BglI識別位點，因此，如果能夠被只能夠被BglI所識別，則擴增的片段 將會被切成2個片段。b、以引物P進行PCR擴增待測黃牛的SH2B1基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以5個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 河南南陽牛(213)，河南平頂山市郟縣紅牛(306)，山東魯西牛(113)，陜西秦川牛(189)，吉 林草原紅牛(MO)。表1黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
1.一種檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含SH2B1基因的 待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛SH2B1基因；用限制性內(nèi) 切酶BglI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂 糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛SH2B1基因第2795位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游弓I物:cagcaactcc aactcctctg gc 22 ；下游弓丨物:ctccccgggc cactccg17。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的PCR擴增反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性50s，65°C退火30s，72°C延伸7s，30 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為4%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛SH2B1基因第2795位的單核苷酸多態(tài)性為GG基因型表現(xiàn) 為209bp和15bp條帶；GA基因型表現(xiàn)為224bp,209bp和15bp條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃牛SH2B1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含SH2B1基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛SH2B1基因；用限制性內(nèi)切酶BglI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛SH2B1基因第2795位的單核苷酸多態(tài)性。由于SH2B1基因功能涉及體重、日增重、體斜長和胸圍4個重要的生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為SREBPlc基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK102094081SQ20101023690
公開日2011年6月15日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者劉俊霞, 屈煉, 楊明娟, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)