專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工表皮體外模型，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性以 及用于皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)的人工表皮體外模型，屬于生物醫(yī)學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著環(huán)境污染加重，化學(xué)品濫用，外界有害物質(zhì)刺激增多，皮膚過(guò)敏的發(fā) 生率呈逐年上升趨勢(shì)。對(duì)于物質(zhì)致敏性的評(píng)價(jià)越來(lái)越引起人們的注意，傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法主 要是以動(dòng)物試驗(yàn)為主，但在全球動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的影響下，發(fā)達(dá)國(guó)家普遍開(kāi)展了以替代、減少 和優(yōu)化為核心的“3R”運(yùn)動(dòng)，體外替代試驗(yàn)將逐步取代動(dòng)物試驗(yàn)。目前，許多國(guó)家都在對(duì)動(dòng) 物替代評(píng)價(jià)體系進(jìn)行研究，基于細(xì)胞的動(dòng)物替代試驗(yàn)方法是研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)階段基于細(xì)胞的動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)方法包括細(xì)胞的二維或三維培養(yǎng)。細(xì)胞的二維培 養(yǎng)檢測(cè)體系缺乏角質(zhì)層的屏障結(jié)構(gòu)，與在體情況不符，而且對(duì)難溶性物質(zhì)或制劑無(wú)法檢測(cè)； 細(xì)胞的三維培養(yǎng)，即構(gòu)建人工表皮，包括兩種模式角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的人工表皮，以及角 質(zhì)形成細(xì)胞與Langerhans前體細(xì)胞構(gòu)建的人工表皮。其中，角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的人工表皮 由于缺乏Langerhans相關(guān)功能的細(xì)胞，導(dǎo)致物質(zhì)致敏性判斷的敏感度和特異性差。另一方 面，目前使用的Langerhans前體細(xì)胞包括⑶34+造血干細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo) 得到Langerhans細(xì)胞后，與角質(zhì)形成細(xì)胞一起構(gòu)建出人工表皮，用于檢測(cè)物質(zhì)的致敏性。 但是，由于Langerhans前體細(xì)胞來(lái)源有限且存在明顯的個(gè)體差異，容易對(duì)結(jié)果的判斷產(chǎn)生 干擾，同時(shí)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化效率低，同時(shí)存在批次間差異，因此導(dǎo)致的試驗(yàn)周期長(zhǎng)，難以 商品化等問(wèn)題。對(duì)于物質(zhì)致敏性終末指標(biāo)的判斷，有兩種方法，即流式細(xì)胞法分析細(xì)胞表面標(biāo)記 分子的變化和ELISA法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。大量研究表明各種替代Langerhans細(xì) 胞的免疫細(xì)胞，其表面的CD86、CD54，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-I β的表達(dá)水平與物質(zhì)致敏性有很 強(qiáng)的相關(guān)性，三者聯(lián)合作為判斷終點(diǎn)具有很高的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性。單核細(xì)胞系是建系的單核細(xì)胞，研究表明在致敏物作用下單核細(xì)胞系可以表現(xiàn)出 Langerhans細(xì)胞的功能，細(xì)胞表面高表達(dá)⑶86和⑶54，同時(shí)分泌大量的IL-I β，且具有獲 取容易、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，是理想的Langerhans替代細(xì)胞，可用于檢測(cè)物 質(zhì)的致敏性。另外單核細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)可得到樹(shù)突狀細(xì)胞，作為一種專(zhuān)業(yè)的抗原遞 呈細(xì)胞，它能夠表達(dá)各種炎癥相關(guān)因子，如TNF- α、IL-I β、IL_6及IL_8等，在各種免疫調(diào) 節(jié)藥物的作用下，這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，可以根據(jù)這些改變來(lái)進(jìn)行免 疫調(diào)節(jié)藥物的篩選以及藥效學(xué)評(píng)價(jià)。但是，目前用單核細(xì)胞系細(xì)胞建立的模型均為單細(xì)胞二維培養(yǎng)模型，缺乏角質(zhì)層 屏障，因此只能用來(lái)檢測(cè)可溶性物質(zhì)的致敏性，不能用來(lái)檢測(cè)不溶性物質(zhì)及外用制劑的致 敏性，也不能反映外用免疫調(diào)節(jié)藥物的透皮性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種能夠用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性以 及用于皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)的人工表皮體外模型。本發(fā)明的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工表皮和 單核細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。優(yōu)選地，所說(shuō)的單核細(xì)胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細(xì)胞系。本發(fā)明的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構(gòu)建方法，包括 下列步驟1)用人角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建人工表皮；2)將單核細(xì)胞系細(xì)胞與步驟1)中得到的人工表皮進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得人工表皮體 外模型。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構(gòu)建方法，包括 下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接種前預(yù)先在插入式 培養(yǎng)皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-5天，待 細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)10-20天，得到人工表皮；2)將單核細(xì)胞系細(xì)胞以(2-8) X IO5個(gè)/ml的密度接種于孔板內(nèi)，將步驟1)中得 到的人工表皮連同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)有單核細(xì)胞系細(xì)胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng) 12-48小時(shí)至穩(wěn)定狀態(tài)，得到人工表皮體外模型。所說(shuō)的單核細(xì)胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG_1或U937細(xì)胞系。本發(fā)明的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，不僅能夠用于檢 測(cè)物質(zhì)的致敏性，而且能夠用于皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)，應(yīng)用范圍廣 泛，具有如下技術(shù)效果1、本發(fā)明將人工表皮與單核細(xì)胞系的細(xì)胞共培養(yǎng)，建成穩(wěn)定的體外模型，能克服 現(xiàn)有的二維或三維試驗(yàn)方法的弱點(diǎn)。由于模型中存在角質(zhì)層的屏障結(jié)構(gòu)，更接近在體情況， 可以用于各種化合物或外用制劑致敏性的檢測(cè)；同時(shí)由于采用的是單核細(xì)胞系的細(xì)胞，能 大大提高物質(zhì)致敏性判斷的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性，也克服了 Langerhans前體細(xì)胞來(lái)源 有限而不易產(chǎn)業(yè)化的問(wèn)題；在檢測(cè)物質(zhì)的致敏性時(shí)，通過(guò)檢測(cè)模型中相關(guān)細(xì)胞因子及細(xì)胞 表面標(biāo)記物的變化，可評(píng)價(jià)各種化合物、皮膚外用制劑及化妝品的致敏性，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、 靈敏度高，應(yīng)用范圍廣；2、本發(fā)明的人工表皮與單核細(xì)胞系的細(xì)胞共培養(yǎng)體外模型，在各種皮膚外用免疫 調(diào)節(jié)藥物的作用下，體外模型中的相關(guān)細(xì)胞因子會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子的變化情況 進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物進(jìn)行篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)；3、本發(fā)明的人工表皮體外模型構(gòu)建成本低，批間差異小，質(zhì)量容易控制；4、本發(fā)明的人工表皮體外模型所用的材料易得，便于規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例中所用的THP-1、MUTZ-3、KG-I和U937細(xì)胞系均購(gòu)買(mǎi)自ATCC。人角質(zhì)形成細(xì)胞的制備參照下列文獻(xiàn)中的方法=Boyce ST, Ham RG. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol,1983,81(ISuppl) :33s_40s.。人成纖維細(xì)胞的制備參照下列文獻(xiàn)中的方法Gray ΒΑ, Gollin SM. Rapid cell culture procedure for tissue samples. Am J Med Genet,1987,28 (2) :521_6.。實(shí)施例11、本實(shí)施例中的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和THP-I細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。2、本實(shí)施例中，人工表皮體外模型的構(gòu)建方法包括下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，以5X 105/ml的密度接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接 種前預(yù)先在插入式培養(yǎng)皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)3天，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)14天，得到人工表皮；2)將THP-I細(xì)胞系細(xì)胞以5X105/ml的密度接種于孔板內(nèi)，將得到的人工表皮連 同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)有THP-I細(xì)胞系細(xì)胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng)24小時(shí)達(dá)到穩(wěn) 定狀態(tài)，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實(shí)施例的人工表皮體外模型來(lái)檢測(cè)物質(zhì)DNFB (2,4- 二硝基氟苯)的致敏 性實(shí)驗(yàn)組將3mg DNFB均勻置于人工表皮體外模型表面，在37°C、含5% CO2的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集THP-I細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液用于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組人工表皮體外模型上不使用DNFB，直接收集THP-I細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng) 液用于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組收集的細(xì)胞和細(xì)胞液進(jìn)行分析，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的 THP-I細(xì)胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的培 養(yǎng)液中IL-I β的含量。檢測(cè)結(jié)果(1)流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的THP-I細(xì)胞表面⑶86的RFI值為191，⑶54的RFI值為 329 ；(2)實(shí)驗(yàn)組中IL-I β的含量為248. 8108士 1. 998ng/L，空白對(duì)照組中IL-I β的含 量為 155. 0082 士 1. 268ng/L，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞表面⑶86或⑶54的RFI (相對(duì)熒光強(qiáng)度)值> 120，并且細(xì)胞 培養(yǎng)液中IL-I β的含量高于對(duì)照組IL-I β的含量，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，以上指標(biāo)聯(lián)合判斷 物質(zhì)具有致敏性；否則判斷物質(zhì)不具有致敏性。檢測(cè)結(jié)果表明DNFB具有致敏性。實(shí)施例2
1、本實(shí)施例中的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和MUTZ-3細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。2、本實(shí)施例中，人工表皮體外模型的構(gòu)建方法包括下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，以2X 105/ml的密度接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接 種前預(yù)先在插入式培養(yǎng)皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)5天，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)14天，得到人工表皮；2)將MUTZ-3細(xì)胞系細(xì)胞以2X105/ml的密度接種于孔板內(nèi)，所用的培養(yǎng)基是含 20% FBS和10%飼養(yǎng)層5637細(xì)胞條件培養(yǎng)基的MEM培養(yǎng)基。其中飼養(yǎng)層5637細(xì)胞條件 培養(yǎng)基的制備方法為用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)該細(xì)胞至匯合狀態(tài)后，換 液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集培養(yǎng)液上清，過(guò)濾，凍存?zhèn)溆?。將?gòu)建的人工表皮連同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)有MUTZ-3細(xì)胞系細(xì) 胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng)24小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實(shí)施例的人工表皮體外模型來(lái)檢測(cè)物質(zhì)DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏 性實(shí)驗(yàn)組將3mg DNCB均勻置于得到的人工表皮體外模型表面，于37°C、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集MUTZ-3細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液用于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集MUTZ-3細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液 用于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組收集的細(xì)胞和細(xì)胞液進(jìn)行分析，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的 MUTZ-3細(xì)胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的 培養(yǎng)液中IL-I β的含量。檢測(cè)結(jié)果(1)流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果是CD86的RFI值180，CD54的RFI值為128。(2)實(shí)驗(yàn)組中IL-I β的含量為158. 0572士0. 6632ng/L，空白對(duì)照組中IL-I β的 含量為 110. 5537 士 0. 7758ng/L，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。判斷標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，檢測(cè)結(jié)果表明DNCB具有致敏性。實(shí)施例31、本實(shí)施例中的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和KG-I細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。2、本實(shí)施例中，人工表皮體外模型的構(gòu)建方法包括下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，以8X 105/ml的密度接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接 種前預(yù)先在插入式培養(yǎng)皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)1天，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)14天，得到人工表皮；2)將KG-I細(xì)胞系細(xì)胞以5XlO5Ail的密度接種于孔板內(nèi)，用含10% FBSUOng/ mlGM-CSF、50pg/ml IL-4和40ng/ml TNF_a的1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)3天。將得到的人工表 皮連同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)有KG-I細(xì)胞系細(xì)胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng)24小時(shí)達(dá) 到穩(wěn)定狀態(tài)，建立人工表皮體外模型。3、利用本實(shí)施例的人工表皮體外模型來(lái)檢測(cè)物質(zhì)DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏性實(shí)驗(yàn)組將3mg DNCB均勻置于構(gòu)建的人工表皮體外模型表面，于37°C、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集KG-I細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液用于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集KG-I細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液用 于檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組收集的細(xì)胞和細(xì)胞液進(jìn)行分析，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的 KG-I細(xì)胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的培 養(yǎng)液中IL-I β的含量。檢測(cè)結(jié)果(1)流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果是⑶86的RFI值139，⑶54的RFI值為148 ；(2)實(shí)驗(yàn)組中IL-I β的含量為203. 2301 士0. 876ng/L，空白對(duì)照組中IL-I β的含 量為 120. 5532 士 0. 6852ng/L，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。判斷標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)施例1中相同，檢測(cè)結(jié)果表明DNCB具有致敏性。實(shí)施例41、本實(shí)施例中的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，是由人工 表皮和U937細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。2、本實(shí)施例中，人工表皮體外模型的構(gòu)建方法包括下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，以5 X 105/ml的密度接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接 種前預(yù)先在插入式培養(yǎng)皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)3天，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)14天，得到人工表皮；2)將U937細(xì)胞系細(xì)胞以8 XlO5Ail的密度接種于孔板內(nèi)，用含10% FBS和50pg/ ml IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將構(gòu)建的人工表皮連同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至 培養(yǎng)有U937細(xì)胞系細(xì)胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng)12小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即得到人工表皮體外模型。3、利用本實(shí)施例的人工表皮體外模型來(lái)檢測(cè)物質(zhì)DNCB (2,4- 二硝基氯苯)的致敏 性實(shí)驗(yàn)組將3mg DNCB均勻置于構(gòu)建的人工表皮體外模型表面，于37°C、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集U937細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液檢測(cè)或冷凍保存。對(duì)照組人工表皮體外模型上不使用DNCB，收集U937細(xì)胞及其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液用 于檢測(cè)或冷凍保存。 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組收集的細(xì)胞和細(xì)胞液進(jìn)行分析，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的 U937細(xì)胞表面⑶86和⑶54分子的變化，用ELISA試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的培 養(yǎng)液中IL-I β的含量。檢測(cè)結(jié)果(1)流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果是CD86的RFI值273，CD54的RFI值為236 ；(2)實(shí)驗(yàn)組中IL-I β的含量為197. 562士0. 749ng/L，空白對(duì)照組中IL-1 β的含 量為 106. 112 士 0. 7958ng/L，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。判斷標(biāo)準(zhǔn)與實(shí)施例1中相同，檢測(cè)結(jié)果表明DNCB具有致敏性。
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，其特征在于，所說(shuō)的模型是由人工表皮和單核細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型，其特 征在于，所說(shuō)的單核細(xì)胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細(xì)胞系。
3.一種用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性和藥物篩選的人工表皮體外模型的構(gòu)建方法，其特征在 于，包括下列步驟1)用人角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建人工表皮；2)將單核細(xì)胞系細(xì)胞與步驟1)中得到的人工表皮進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得人工表皮體外模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人工表皮體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下列步驟1)取人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，接種到插入式培養(yǎng)皿的上室內(nèi)，接種前預(yù)先在插入式培養(yǎng) 皿的下室內(nèi)種滿(mǎn)人成纖維細(xì)胞，接種后在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-5天，待細(xì)胞 生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)后，轉(zhuǎn)至氣液界面培養(yǎng)10-20天，得到人工表皮；2)將單核細(xì)胞系細(xì)胞以(2-8)X105個(gè)/ml的密度接種于孔板內(nèi)，將步驟1)中得到的人 工表皮連同插入式培養(yǎng)皿的上室一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)有單核細(xì)胞系細(xì)胞的孔內(nèi)，共培養(yǎng)12-48 小時(shí)至穩(wěn)定狀態(tài)，得到人工表皮體外模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的人工表皮體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所說(shuō)的單核 細(xì)胞系選自THP-1、MUTZ-3、KG-1或U937細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)物質(zhì)致敏性以及用于皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)的人工表皮體外模型，所說(shuō)的模型是由人工表皮與單核細(xì)胞系細(xì)胞共培養(yǎng)而得。本發(fā)明的人工表皮體外模型具有如下技術(shù)效果1、通過(guò)檢測(cè)模型中相關(guān)細(xì)胞因子及細(xì)胞表面標(biāo)記物的變化，可評(píng)價(jià)各種化合物、皮膚外用制劑及化妝品的致敏性；在判斷物質(zhì)致敏性時(shí)，具有很高的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣；2、可以用于皮膚外用免疫調(diào)節(jié)藥物的篩選或藥效學(xué)評(píng)價(jià)；3、模型構(gòu)建成本低，批間差異小，質(zhì)量容易控制；4、模型所用的材料易得，便于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101955908SQ20101023379
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者劉維達(dá), 周武慶, 曹玉萍, 馬鵬程 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所