專利名稱：一種鑒別牦牛肉干產(chǎn)品肉種來源的三重pcr-rflp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及到牦牛肉、黃牛肉和水牛肉的三重 PCR-RFLP快速鑒別。
背景技術(shù)：
牦牛是我國青藏高原特有的牛種，其肉質(zhì)優(yōu)良、味美、無污染，是天然的綠色食品。 牦牛肉以高蛋白質(zhì)和低脂肪而名列肉類前茅，牦牛肉產(chǎn)品在市場的占有率也在迅速地擴(kuò) 大，價格與其他牛肉存在較大差距。因此，市面上出現(xiàn)了很多用黃牛肉(包括瘤牛和普通 牛)和水牛肉假冒牦牛肉產(chǎn)品的現(xiàn)象。為了確保廣大消費者的權(quán)益，為執(zhí)法人員提供技術(shù) 支撐，需要對牦牛肉、黃牛肉和水牛肉進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒別。對生鮮肉進(jìn)行感官鑒別時，根據(jù)肉在顏色、氣味、滋味和纖維粗細(xì)等方面的差異， 借助“看、聞、摸”，綜合三個要點得出的判斷，對肉類來源進(jìn)行感官鑒另U。這在實際應(yīng)用中存 在如下問題由于都是牛肉，所以很難通過感官手段進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。而免疫學(xué)檢測是基于可 溶性抗原與抗體的免疫反應(yīng)，應(yīng)用種間特異性抗原進(jìn)行設(shè)計研究的方法，但利用這種方法， 由于樣品經(jīng)過不同溫度的加熱處理會影響ELISA方法的檢測準(zhǔn)確性。特別是當(dāng)樣品經(jīng)過高 溫深加工處理后，蛋白發(fā)生了變性，改變了特異抗原決定簇，因此很難鑒別和區(qū)分不同的動 物物種。另外目前用于動物源性檢測的試劑盒靈敏度較低，也不適于推廣使用。而PCR-RFLP技術(shù)快速、簡便、廉價，在肉產(chǎn)品的種屬鑒別方面已有相關(guān)報道，但未 見有牦牛肉、黃牛肉和水牛肉快速鑒別的三重PCR-RFLP方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決牦牛肉干產(chǎn)品中肉種來源鑒別，提供一種快速牦牛肉、黃牛 肉和水牛肉鑒別的三重PCR-RFLP方法，為打擊用黃牛肉(包括瘤牛和普通牛)和水牛肉假 冒牦牛肉干產(chǎn)品的不法行為提供技術(shù)支撐。將牦牛肉、黃牛肉和水牛肉按以下方法進(jìn)行鑒別(1)1. 5mL離心管中加入約 lOOmg樣品，用剪刀剪碎，加200 uL TE溶液(pH 8. 0)，旋渦混勻；⑵加入400 u L裂解液， 旋渦混勻；⑶加入500iiL酚氯仿異戊醇(25 24 1)，劇烈振蕩，12000rpm離心 lOmin ； (4)取上清液，加入等體積氯仿異戊醇(24 1)，劇烈振蕩，12000rpm離心lOmin ； (5)取上清液，加入等體積氯仿，劇烈振蕩，12000rpm離心lOmin ； (6)取上清液，加0. 8倍體 積異丙醇，12000rpm離心lOmin ； (7)棄上清液，收集DNA，接著取70%乙醇清洗1次，再將其 室溫下自然干燥；(8)加100 yL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后將其_20°C保存以備用。 (9)PCR擴(kuò)增及檢測用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cytb基因的通用上游引物F:5’-TAC CAT GAG GAC MATAT CAT TCTG-3，和通用下游引物R :5，_CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。 PCR 反應(yīng)總體積為 25ii L，其中 10XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 ii L (2. 5U/ U L)，dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各 2 u L,模板 DNA 2 u L,滅菌蒸 餾水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95°C變性10min，95°C變性45s，53°C退火60s，72°C延伸60s，35個循環(huán)后再72°C繼續(xù)延伸7min。取4 ii L PCR產(chǎn)物與1 y L 6X loadding buffer混合， 采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠(加入染色劑Gold view I)在5v/cm恒壓電泳條件下 約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。(10)取Cytb基因片段的PCR產(chǎn)物7 y L，然后依 次加入 HgaI、ApaI 和 PflMI 三種限制性內(nèi)切酶各 0. 5 ii L，NEB buffer 2. 5 u L, ddH209 u L, 37°C溫浴3h。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后依據(jù)酶切圖譜進(jìn)行判斷HgaI 把牦牛樣品酶切割為220bp和252bp，Apal把普通牛樣品酶切割為173bp和299bp，PflMI 把水牛樣品酶切割為69bp和403bp。本發(fā)明在鑒別過程中采用PCR-RFLP方法，具有簡便、快捷、廉價和準(zhǔn)確性高的特點。


圖1是具體實施方式
一中步驟(9)牦牛肉(1、2)、黃牛肉(3、4)和水牛肉(5、6)產(chǎn) 品擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的凝膠電泳圖；圖2是具體實施方式
一中步驟(10)用三重酶切對具體實 施方式一中步驟(9)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-RFLP分析后檢測的凝膠電泳圖M :Marker 1,1 對照組，2 牦牛肉，3 黃牛肉，4 水牛肉，5 牦牛、黃牛和水?；旌先鈽樱?-11 牦牛肉干產(chǎn)品。
具體實施例方式具體實施方式
一將牦牛肉、黃牛肉和水牛肉按以下方法進(jìn)行鑒別(1)1. 5mL離 心管中加入約lOOmg樣品，用剪刀剪碎，加200iiL TE溶液(pH 8. 0)，旋渦混勻；(2)加 入400 yL裂解液，旋渦混勻；(3)加入500 yL酚氯仿異戊醇(25 24 1)，劇烈振 蕩，12000rpm離心lOmin ； (4)取上清液，加入等體積氯仿異戊醇(24 1)，劇烈振蕩， 12000rpm離心lOmin ； (5)取上清液，加入等體積氯仿，劇烈振蕩，12000rpm離心lOmin ； (6) 取上清液，加0. 8倍體積異丙醇，12000rpm離心lOmin ； (7)棄上清液，收集DNA，接著取70% 乙醇清洗1次，再將其室溫下自然干燥；(8)力卩100yL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后 將其-20°C保存以備用。(9)PCR擴(kuò)增及檢測用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cytb基因的通用上 游引物 F:5，-TAC CAT GAG GAC AAATAT CAT TCT G_3’ 和通用下游引物 R :5’-CCT CCTAGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。PCR 反應(yīng)總體積為 25 ii L，其中 10 XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2u L(2. 5U/ u L), dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/u L 的上、下游引物各 2 u L，模板DNA 2 u L，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95°C變性lOmin，95°C變性45s， 53°C退火60s，72°C延伸60s，35個循環(huán)后再72°C繼續(xù)延伸7min。取4 y L PCR產(chǎn)物與1 y L 6X loadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠(加入染色劑Gold view I) 在5v/cm恒壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。(10)取Cytb基因片 段的PCR產(chǎn)物7ii L，然后依次加入Hgal、Apal和PflMI三種限制性內(nèi)切酶各0. 5 u L, NEB buffer 2. 5uL, ddH209 u L，37°C溫浴3h。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后依 據(jù)酶切圖譜進(jìn)行判斷HgaI把牦牛樣品酶切割為220bp和252bp，Apal把普通牛樣品酶切 割為173bp和299bp，PflMI把水牛樣品酶切割為69bp和403bp。
權(quán)利要求
一種快速鑒別牦牛肉、黃牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法，其特征在于可以把牦牛肉、黃牛肉和水牛肉按以下方法鑒別(1)1.5mL離心管中加入約100mg樣品，用剪刀剪碎，加200μLTE溶液(pH 8.0)，旋渦混勻；(2)加入400μL裂解液，旋渦混勻；(3)加入500μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，劇烈振蕩，12000rpm離心10min；(4)取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，劇烈振蕩，12000rpm離心10min；(5)取上清液，加入等體積氯仿，劇烈振蕩，12000rpm離心10min；(6)取上清液，加0.8倍體積異丙醇，12000rpm離心10min；(7)棄上清液，收集DNA，接著取70％乙醇清洗1次，再將其室溫下自然干燥；(8)加100μLTE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后將其-20℃保存以備用。(9)PCR擴(kuò)增及檢測用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cytb基因的通用上游引物F5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反應(yīng)總體積為25μL，其中10×PCRBuffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95℃變性10min，95℃變性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環(huán)后再72℃繼續(xù)延伸7min。取4μLPCR產(chǎn)物與1μL 6×loadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2％瓊脂糖凝膠(加入染色劑Gold view I)在5v/cm恒壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。(10)取Cytb基因片段的PCR產(chǎn)物7μL，然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三種限制性內(nèi)切酶各0.5μL，NEB buffer 2.5μL，ddH209μL，37℃溫浴3h。酶切產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后依據(jù)酶切圖譜進(jìn)行判斷HgaI把牦牛樣品酶切割為220bp和252bp，ApaI把普通牛樣品酶切割為173bp和299bp，PflMI把水牛樣品酶切割為69bp和403bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別牦牛肉、黃牛肉和水牛肉的PCR-RFLP方法，其特征 在于步驟八中的擴(kuò)增引物為通用上游引物 F :5，-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3，通用下游引物 R:5’ -CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別牦牛肉、黃牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法，其 特征在于步驟(10)用Hgal、Apal和PflMI三個限制性內(nèi)切酶同步進(jìn)行PCR-RFLP分析。
全文摘要
快速鑒別牦牛肉、黃牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，可用于牦牛肉干產(chǎn)品的來源追溯和物種成分的快速鑒別。它解決了目前牦牛肉、黃牛肉和水牛肉鑒別方法準(zhǔn)確性低等缺陷，提供了一種牦牛肉、黃牛肉和水牛肉準(zhǔn)確鑒別的PCR-RFLP方法?？蓪㈥笈Ｈ狻ⅫS牛肉和水牛肉按以下方法進(jìn)行鑒別提取樣品DNA，采用通用引物擴(kuò)增和凝膠電泳檢測，然后利用HgaI、ApaI和PflMI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行同步酶切和PCR-RFLP分析，即可快速鑒別牦牛肉、黃牛肉和水牛肉。本發(fā)明采用PCR-RFLP方法，具有簡便、快捷、廉價和準(zhǔn)確性高的特點。
文檔編號C12Q1/68GK101875976SQ20101022670
公開日2010年11月3日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者何建文, 馮海永, 安添午, 張 浩, 王繼卿, 羅玉柱, 趙會靜, 韓建林 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)