專利名稱：甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒的制作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒
技術領域：
本發(fā)明涉及食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及甘氨酸測定方法及其試齊U盒。
背景技術：
甘氨酸為非人體必需氨基酸。甘氨酸有獨特的甜味，能緩和酸、堿味，掩蓋食品中添加糖精的苦味并增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且會打破人體對氨基酸的吸收平衡而影響其它氨基酸的吸收，導致營養(yǎng)失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用，只能分解轉(zhuǎn)化為熱能，這樣會增加肝臟負擔。而分解產(chǎn)物中的含氮化合物要通過尿液排出體外，又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品，可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業(yè)為提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量，在生產(chǎn)加工中違規(guī)使用甘氨酸，對青少年及兒童的正常生長發(fā)育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》GB2760規(guī)定，甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調(diào)味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發(fā)明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據(jù)下述甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應完成甘氨酸+酮戊二酸甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶乙酵酸+谷氨酸谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+ 谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶本發(fā)明的方法利用甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glycine transaminase ；EC 2. 6. 1. 4)酶(偶) 聯(lián)氨甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase ；EC 6. 3. 5. 5)、丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 51)酶促反應終點法。甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶解甘氨酸反應產(chǎn)生谷氨酸，再通過(偶)聯(lián)合氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算甘氨酸的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將甘氨酸濃度調(diào)整到1毫摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、 丙酮酸脫氫酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與乙酰輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
甘氨酸的含量
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸濃度測定方法，其測定的技術原理是根據(jù)下述甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應完成甘氨酸+酮戊二酸甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶乙酵酸+谷氨酸谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+二氧化碳+水二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶。
2.一種甘氨酸的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1.1標準樣品的制備將一定量的甘氨酸溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與乙酰輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到甘氨酸的含量ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)甘氨酸含量= -χ標準濃度(mmol/L)ΔΑ (標準)-ΔΑ (空白)式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標準)表示步驟2. 4)標準樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自 NADPH、NADH或thio-NADH的還原型輔酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、乙酰輔酶A、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與乙酰輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；其中還原型輔酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸與乙酰輔酶A組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨甲酰磷酸合成酶與丙酮酸脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶組成的；其中還原型輔酶、甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、單價磷酸鹽、氨甲酰磷酸、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶氨甲酰磷酸合成酶丙酮酸脫氫酶酮戊二酸l-100mmol/L腺苷二磷酸I-IOOmmo 1/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L氨甲酰磷酸 I-IOOmmo 1/L 乙酰輔酶 A 1-lOOmmol/Lo6. 2根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶酮戊二酸腺苷二磷酸單價磷酸鹽氨甲酰磷酸乙酰輔酶A 組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶氨甲酰磷酸合成酶丙酮酸脫氫酶6. 3根據(jù)權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/Lc20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶酮戊二酸腺苷二磷酸單價磷酸鹽氨甲酰磷酸乙酰輔酶A 組成如下的試劑2 緩沖液穩(wěn)定劑氨甲酰磷酸合成酶丙酮酸脫氫酶組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶 1000-80000U/L。20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據(jù)甘氨酸轉(zhuǎn)氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應完成，本發(fā)明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于食品檢驗。
文檔編號C12Q1/25GK102298015SQ20101021163
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權日2010年6月25日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司