專利名稱：一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續(xù)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)alpha半乳糖苷酶以提高該酶活力持續(xù)性的方法。
背景技術(shù)：
飼料中含有水蘇糖等含α半乳糖苷的動(dòng)物腸道消化酶難以消化的糖類，不僅影響動(dòng)物對(duì)碳水化合物的消化吸收，而且會(huì)提高單胃動(dòng)物消化道粘度，妨礙動(dòng)物腸道消化酶對(duì)飼料中其它營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收。在飼料中添加α半乳糖苷酶可望有效去除水蘇糖等對(duì)動(dòng)物消化功能的不利影響。但酶活力持續(xù)性不足是目前應(yīng)用的α半乳糖苷酶存在的一個(gè)問(wèn)題。包括α半乳糖苷酶在內(nèi)的各種酶的重組表達(dá)方式有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種，這兩種酶的重組表達(dá)方式使酶分子與宿主細(xì)胞之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)，即酶分子不是宿主細(xì)胞的組成部分，從而很容易失活。 如果使酶分子成為細(xì)胞的有機(jī)組成部分，則只要細(xì)胞保持存活狀態(tài)酶分子也會(huì)保持活力， 從而可以顯著提高酶的活力持續(xù)性。本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種使α半乳糖苷酶成為釀酒酵母細(xì)胞有機(jī)組成的技術(shù)，即將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細(xì)胞的組成部分，只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活則α半乳糖苷酶始終保持活性狀態(tài)，從而顯著提高了 α半乳糖苷酶活力持續(xù)性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有的α半乳糖苷酶活力持續(xù)性不足的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種使α半乳糖苷酶成為釀酒酵母細(xì)胞有機(jī)組成部分的技術(shù)，使α半乳糖苷酶只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高α半乳糖苷酶活力持續(xù)性。本發(fā)明的一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續(xù)性的方法，包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子下游MF α 1信號(hào)肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N 端到C端GAL1啟動(dòng)子+MF α 1信號(hào)肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有重量百分比 3. 5-7%半乳糖的YPD培養(yǎng)基中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活狀態(tài)，α半乳糖苷酶即可保持活力。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 α半乳糖苷酶展露表達(dá)將α半乳糖苷酶基因(來(lái)自釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae, Genbank號(hào) X03102)連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列(來(lái)自釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae, Genbank號(hào)S73336)的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子(來(lái)自釀酒酵母表達(dá)載體PYES263，Genbank號(hào)AY42807》下游MF α 1信號(hào)肽序列(來(lái)自釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，Genbank 號(hào)Μ17301)的 C 端，構(gòu)建成表達(dá)框(從 N 端到 C 端) GALl啟動(dòng)子+MF α 信號(hào)肽序列+ α半乳糖苷酶基因+FLO序列。將包含該表達(dá)框的釀酒酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces cerevisiae，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司)， 則MF α 信號(hào)肽將引導(dǎo)α半乳糖苷酶向釀酒酵母細(xì)胞外分泌，而α半乳糖苷酶下游的 FLO序列則錨定在釀酒酵母細(xì)胞壁中，從而使α半乳糖苷酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面。實(shí)施例2 α半乳糖苷酶展露表達(dá)的誘導(dǎo)在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，添加3. 5-7%半乳糖(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo·，Ltd·)，則表達(dá)框“GAL1啟動(dòng)子+MF α 信號(hào)肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl啟動(dòng)子就會(huì)活化，誘導(dǎo)α半乳糖苷酶在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)。實(shí)施例3半乳糖對(duì)α半乳糖苷酶展露表達(dá)的作用在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，如果不含半乳糖，則未檢測(cè)到α半乳糖苷酶活性，這是因?yàn)楸磉_(dá)框“GAL1啟動(dòng)子+MF α 信號(hào)肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl啟動(dòng)子無(wú)法活化。實(shí)施例4 α半乳糖苷酶展露表達(dá)后其活力持續(xù)性顯著提高按照實(shí)施例1和實(shí)施例2所示步驟進(jìn)行展露表達(dá)的α半乳糖苷酶活性為
mL (3. 5 %半乳糖)和678U/mL (3. 5_7 %半乳糖)，半衰期均為73天，即第73天時(shí)能保持起始活性的一半。而如果在實(shí)施例1和實(shí)施例2所示的展露表達(dá)表達(dá)框“GAL1啟動(dòng)子+MF α 1 信號(hào)肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中去除FLO序列，則α半乳糖苷酶進(jìn)行分泌表達(dá)，活性為228U/mL(3. 5%半乳糖)和216U/mL(3. 5_7%半乳糖)，半衰期均僅為5天，即第 5天時(shí)能保持起始活性的一半。因此，將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細(xì)胞的組成部分，只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活則α半乳糖苷酶始終保持活性狀態(tài)，從而顯著提高了 α半乳糖苷酶活力持續(xù)性。α半乳糖苷酶活性單位U定義為在37°C、pH 5. 0的條件下，1分鐘內(nèi)從0. 01摩爾 / 升的 pNPG(p-nitrophenyl-alpha-D-galactopyranoside，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&Services Co. , Ltd.)溶液中釋放出1微摩爾pNP(p-nitrophenyl p-nitrophenyl，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司， Shanghai Sangon Biological EngineeringTechnology&Services Co.，Ltd.)所需要白勺 α 半乳糖苷酶酶量為IU。最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續(xù)性的方法，其特征在于包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動(dòng)子下游MF α 1信號(hào)肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到 C端GAL1啟動(dòng)子+MF α 1信號(hào)肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有重量百分比3. 5-7%半乳糖的YPD培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明的一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續(xù)性的方法，包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GAL1啟動(dòng)子下游MFα1信號(hào)肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動(dòng)子+MFα1信號(hào)肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細(xì)胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細(xì)胞保持存活狀態(tài)，α半乳糖苷酶即可保持活力。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102242094SQ20101017180
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者何國(guó)慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風(fēng)蘭 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)