專利名稱：一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，屬于基因工程菌株構(gòu)建方法，具體涉及一種高產(chǎn)油酸 的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
為應(yīng)對(duì)愈演愈烈的石油危機(jī)，世界各國(guó)都在積極制定和實(shí)施新的能源發(fā)展戰(zhàn)略， 希望通過(guò)各種可能途徑尋找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生產(chǎn)生物柴 油的原料主要依賴于油料作物、木本油料人工林、動(dòng)物脂肪及廢棄油脂等。從油料樹木中提 取油脂，具有占用耕地面積、周期長(zhǎng)、成本高等一系列制約因素。發(fā)展動(dòng)物油脂也同樣面臨 一系列制約因素。因此，開辟新的植物源油脂生產(chǎn)途徑，特別是工業(yè)化生產(chǎn)途徑對(duì)滿足不斷 增長(zhǎng)的生物柴油的需求具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，除高等植物和動(dòng)物能生產(chǎn)油脂外，低等的微生物也能產(chǎn)生油脂，大部分 微生物油脂的脂肪酸組成和一般植物油相似。通常情況下微生物細(xì)胞僅含油2 3%，但在 適宜條件下，某些微生物產(chǎn)生并貯存的油脂占其生物總量的20%以上，在已知細(xì)菌、酵母、 霉菌和藻類中都發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)油脂的菌株。酵母是一種繁殖速度很快的生物，利用酵母作為生 物反應(yīng)器生產(chǎn)脂肪酸，為生物柴油原料生產(chǎn)開辟了一條新的技術(shù)途徑。酵母生產(chǎn)油脂時(shí)，具 有增殖快，生長(zhǎng)周期短，適合工廠化生產(chǎn)，投入較少，收獲穩(wěn)定，不受季節(jié)、氣候等環(huán)境條件 影響，且不消耗化學(xué)肥料和農(nóng)藥，因而對(duì)環(huán)境污染減輕。但目前常見的產(chǎn)油酵母存在產(chǎn)油率 低，油脂成分組成復(fù)雜，與生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物柴油的原料要求仍為較大距離。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，將植物脂肪酸合成相關(guān)基因特別是控制產(chǎn)脂量和脂肪酸品 質(zhì)的基因?qū)虢湍钢校瑯?gòu)建優(yōu)質(zhì)“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在酵母細(xì)胞中 的高效表達(dá)，增加酵母產(chǎn)油量，提高和控制脂肪酸組成。此種新方式可從根本上解決酵母產(chǎn) 脂菌油質(zhì)差、產(chǎn)油率低的缺陷，又可充分發(fā)揮酵母適合于生物反應(yīng)器發(fā)酵以及林源優(yōu)質(zhì)脂 肪酸合成酶的優(yōu)點(diǎn)。Δ 9硬脂酰-ACP脫飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，簡(jiǎn)稱SAD)是目前研究最 多、最廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化的反應(yīng)是在第9 10碳原子之間形成第一個(gè) 雙鍵，是不飽和脂肪酸生物合成途徑的第一步脫飽和，直接調(diào)控膜脂與貯脂中飽和與不飽 和脂肪酸的比例，該酶對(duì)調(diào)節(jié)油料作物種子中脂肪酸含量和組分具有非常重要的意義。千 年桐是生產(chǎn)生物柴油的理想樹種之一，將千年桐的SAD基因(VeSAD)構(gòu)建在酵母表達(dá)載體 上并整合到產(chǎn)油酵母中高效表達(dá)，使產(chǎn)油酵母的飽和脂肪酸向油酸轉(zhuǎn)化，從而大大提高油 脂成分中油酸的含量，為酵母產(chǎn)油符合生物柴油的質(zhì)量要求奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株 的構(gòu)建方法，提供一種高產(chǎn)油酸的酵母工程菌株，該載體以PCAMBIA2300為基本骨架，含有 千年桐VeSAD基因，可以改變產(chǎn)油酵母脂肪酸成分從而提高油酸含量，從而提高淺白隱球酵母的油脂含量，該菌株的名稱為Cryptococcus albidus VeSAD-I，保存在中國(guó)林業(yè)科學(xué) 研究院亞熱帶林業(yè)研究所觀賞植物研究組實(shí)驗(yàn)室。用于本發(fā)明工程菌株Cryptococcus albidus pCAM2300_sad中表達(dá)千年桐VeSAD 基因的質(zhì)粒是pCAM2300-sad，構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株 的構(gòu)建方法，在酵母基因組中含有千年桐VeSAD基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次含有CaMV35S啟 動(dòng)子、千年桐VeSAD序列、終止密碼子，其中所述的酵母是淺白隱球酵母；該方法的步驟如 下(1)、含酶切位點(diǎn)千年桐VeSAD基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列獲得根據(jù)千年桐VeSAD基因(GenBank登錄號(hào)為EU072353)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以千 年桐未成熟種子總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位點(diǎn)，下游引 入Kpn I酶切位點(diǎn)，電泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5 α，測(cè)序，命名該載體為pGEM-T-sad ；(2)、VeSAD正義表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)合表達(dá)載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點(diǎn)——Kpn I、Sma I,BamH I,Xba I、 Sail, Pst I，選用Sal I, Kpn I兩個(gè)位置來(lái)作為插入目的片段的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶Sal I、 Kpn I酶切位點(diǎn)的引物，以克隆載體質(zhì)粒pGEM-T-Vesad為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；將擴(kuò)增產(chǎn)物 與表達(dá)載體PCAM2300 —起均用Sal I和Kpn I雙酶切；分別回收相應(yīng)的片段，用T4DNA連 接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，表達(dá)載體命名為 pCAM2300-sad；(3)重組農(nóng)桿菌菌株獲得采用凍溶法將重組表達(dá)載體pCAM2300-sad農(nóng)桿菌菌株EHA105、LBA4404、AGL-I ；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，活化含重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，與淺白隱球酵母菌液共培養(yǎng)， 轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上，獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR和Southern 分子鑒定，表明千年桐VeSAD基因已經(jīng)插入淺白隱球酵母的基因組中。經(jīng)過(guò)油脂成分檢測(cè)， 該菌株的油酸占總含油量的50. 21%，比對(duì)照提高了 14. 4%。本發(fā)明有益的效果是本發(fā)明將從千年桐種子總RNA中分離的VeSAD基因構(gòu)建到 酵母表達(dá)載體PCAMBIA2300上，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將VeSAD基因?qū)霚\白隱球酵母，使植 物脂肪酸合成基因在酵母中高效表達(dá)，增加了淺白隱球酵母的產(chǎn)油率，特別是提高了油脂 中油酸的含量，更加適合生物柴油的要求，為生物柴油原料生產(chǎn)提供一種高效產(chǎn)油脂的工 程菌株。


圖1 本發(fā)明質(zhì)粒pCAM2300-sad構(gòu)建過(guò)程示意圖；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明1實(shí)驗(yàn)材料
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1.1植物材料從中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所樹木園采取千年桐發(fā)育中的果實(shí)，將種 子剝出在液氮中速凍后-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 2菌株與質(zhì)粒淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏 中心，大腸桿菌E. coli DH5a、根癌農(nóng)桿菌EHA 105、LBA4404、AGL-I為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì) 粒pCAMBIA2300為本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pGEM-T Easy購(gòu)自Promega公司。1. 3主要生化試劑RNA提取試劑盒購(gòu)自天澤基因工程有限公司(四川綿陽(yáng))；cDNA合成試劑盒、 IPTG、X-gal、購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠純化回收試劑 盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞、T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物合成及菌液測(cè)序分別由上 海生工生物工程技術(shù)有限公司和上海聯(lián)合基因公司完成，脂肪酸成分測(cè)定由亞熱帶林木培 育重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室完成。1. 4培養(yǎng)基配制LB培養(yǎng)基(g.L—1)蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，調(diào)pH至7. O。YPD培養(yǎng)基(組分g·!/1):蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，自然pH。SM培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)(g · L—1)酵母氮基6. 70，葡萄糖20，調(diào)pH至6.0。MM(組分 g · L-1) =K2HPO4 2. 2822，KH2PO4 1. 3609，NaCl 0. 146，MgSO4 · 7H20 0. 49294，CaCl2 0. 077693，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025021，(NH4)2SO4 0. 52856，C6H2O6 1. 9817。IM (誘導(dǎo)培養(yǎng)基)在匪液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入40mM MES,調(diào)pH到5. 3，然后加入5%的甘油(W/V)，115°C滅菌30min。固體培養(yǎng)基滅菌前加入瓊脂0. 8_1 %。YEPD培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)(g · L—1):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基(g· Γ1)葡萄糖 80，(NH4)2SO4 3. 0，MgSO4 · 7H20 3. 0，ΚΗ2Ρ042· 0， ρΗ5· 5-6. 02實(shí)驗(yàn)方法2. 1千年桐發(fā)育中種子總RNA提取(1)液氮研磨破碎細(xì)胞，取約IOOmg左右的細(xì)粉至新離心管中；(2)加入ImL溶液A振蕩混合30s ； (3)加入0. 3mL溶液B和0. 2mL氯仿，振蕩混勻；(4)室溫離心13000g，5min,取上清(約0. 8mL)移至新離心管中；(5)加入0. 5mL溶液C和0. 2mL氯仿，振蕩混勻；(6)室溫離心13000g，3min，取上清(約950mL)移至新管中；(7)加1/2體積的溶液D，振蕩混勻；(8)室溫離心13000g，5min，形成白色沉淀；(9)加ImL 75%乙醇振蕩混勻，離心13000g, 3min，棄上清；(10)重復(fù)步驟9，吹干后溶于30uL DEPC處理的純水中。(11)取2uL在1. 0%的瓊脂糖凝膠中快速電泳檢測(cè)總RNA的完整性。于_80°C保
5存待用。溶液A-D是試劑盒中的產(chǎn)品，A 裂解緩沖液，B 第一次分相液，C 第二次分相液， D =RNA沉淀液。2. 2反轉(zhuǎn)錄運(yùn)用(上海生工)AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，以總RNA為模板，合成cDNA第一 鏈。具體方法如下(1)冰浴中加總 RNA3uL下游特異性引物IuL無(wú)RNA酶去離子水3uL總體積7uL(2)混勻離心 3 5s，70°C 5min,冰浴 30s(3)冰浴加入5 X Reaction Buffer 4uLRNA 酶抑制劑(20U/uL) IuLdNTP (IOmM)2uL(4)混勻離心，37°C 5min,加入 luLM-MLV RT (20U/uL)，混勻。(5) 37°C 6Omin ；最后 70°C保溫 IOmin02. 3PCR擴(kuò)增VeSAD基因含酶切位點(diǎn)cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)根據(jù)在GenBank上登錄的VeSAD基因核苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，引物序 列如下Vesad FP :GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CTVesad RP :GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT其中Vesad FP含酶切位點(diǎn)Sal I,Vesad RP含酶切位點(diǎn)Kpn I，以2. 2合成的cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增千年桐VeSAD基因cDNA編碼區(qū)。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C 30S、 58°C 30S、72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢 測(cè)。2. 4擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序2. 4. IPCR產(chǎn)物的回收將VeSAD cDNA用B型小量DNA片斷快速膠回收試劑盒(博大泰克)進(jìn)行特異性 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化，操作步驟如下(1)在1. 0%的瓊脂糖凝膠中電泳，使擴(kuò)增產(chǎn)物分離形成特異帶；(2)切下目的條帶置離心管中；(3)加700uL溶膠液，55°C溶膠，其間偶爾搖動(dòng)；裝柱，12000rpm,離心30s ；去掉廢 液；(4)加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm離心30s。重復(fù)漂洗一次。 倒掉廢液后再于12000rpm離心2min ；(5)加入45uL的洗脫緩沖液(Elution buffer)或水，室溫放置2min，12000rpm離 心。管底溶液即為回收的目的片斷。
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2. 4. 2回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化回收產(chǎn)物連接到pGEM T-Easy載體上，按照Promega公司pGEM_T Easy連接試劑 盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)化按照寶生物E. coli DH 5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。(1)將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，在離心管中分別加入下列 成分回收產(chǎn)物4uL ；T載體IuL ；2 X T4 Buffer 5uL ；T4DNA連接酶(3U/uL) IuL ；輕輕混勻后 離心收集到管底，16°C過(guò)夜連接。(2)從-80°C冰箱中取IOOuL感受態(tài)細(xì)胞，室溫下解凍后立即置冰上；(3)加入5uL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min ；(4) 42°C水浴熱擊90s，迅速置于冰上冷卻3 5min ；(5)向管中加入ImL LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)lh，使菌恢 復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Amp1O ；(6)將上述菌液搖勻后取200uL加入40uL X-gal及4uL IPTG混合均勻，涂布于含 Amp的篩選平板上。37°C倒置過(guò)夜培養(yǎng)。(7)白色菌落為重組子。2. 4. 3 質(zhì)粒 DNA 提取將5mL含Amp (50mg/L)LB液體培養(yǎng)基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色單菌落 37 振蕩過(guò)夜。質(zhì)粒提取按照博大泰克公司試劑盒描述的方法進(jìn)行。(1)取l-3mL在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，12000rpm離心30s，棄盡上清。(2)用250uL已加入RNaseA的溶液I均勻懸浮細(xì)菌沉淀，室溫放置5min ；(3)加入250uL溶液II，溫和上下翻轉(zhuǎn)4_6次混勻，使菌體充分裂解；(4)加入350uL溶液III，上下翻轉(zhuǎn)6-8次混勻，12000rpm離心IOmin ；(5)吸取離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000rpm離心Imin ；(6)將制備管放回離心管，加入500uL的Buffer Wl，12000rpm離心Imin ；棄濾液；(7)將制備管放回離心管，加入700uL的Buffer W2，12000rpm離心Imin ；棄濾液； 重復(fù)洗滌一次。(8)將制備管移入新的離心管中，在膜正中央加40-60UL水，室溫靜置Imin ； 12000rpm離心lmin。將收獲的重組質(zhì)粒于_20°C保存。2. 4. 4質(zhì)粒的酶切鑒定根據(jù)pGEM T-Easy載體的圖譜，選用EcoR I限制性內(nèi)切酶對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行鑒 定。將酶切鑒定的陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)的菌液，送往上海聯(lián)合基因集團(tuán)公司聯(lián)眾基因科技研究院 測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。命名該載體為pGEM-T-SKSAD，在添加Amp的液體LB培養(yǎng)基中繁殖含該載 體的大腸桿菌E. coli DH 5α然后提取質(zhì)粒就能大量生產(chǎn)該載體。2. 5含VeSAD基因的表達(dá)載體構(gòu)建將pGEM-T-SKSAD與表達(dá)載體pCAM2300用Sal I和Kpn I雙酶切。分別回收相應(yīng) 的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。將菌液涂布在含Kan 的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，雙酶切質(zhì)粒來(lái)驗(yàn)證目的片段插入是否 正確，結(jié)果如圖2。表達(dá)載體命名為pCAM2300-sad，全長(zhǎng)9933bp，其特征在于所含VeSAD基因 能在植物、真菌中表達(dá)，在添加Kan的液體LB培養(yǎng)基中繁殖含該載體的大腸桿菌E. coliDH 5α然后提取質(zhì)粒就能大量生產(chǎn)該載體。
2.6表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌采用凍融法，將表達(dá)載體pCAM2300-sad導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404、AGL-I中。(1)取200uL EHA 105感受態(tài)細(xì)胞，加入IOuL表達(dá)載體質(zhì)粒，冰浴30min ；(2)液氮中速凍5min，迅速置于37°C水浴5min ；(3)冰浴5min后，加入800uL LB液體培養(yǎng)基，180rpm 28°C培養(yǎng)3h后涂布在含有 相應(yīng)抗生素的LB固體平板上，28°C培養(yǎng)1-2天。(4)挑選單菌落于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，堿法提取農(nóng)桿菌 質(zhì)粒DNA。(5)以相應(yīng)的菌液和質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定，判斷目的片段是否插入到表 達(dá)載體上。PCR反應(yīng)條件參照2. 3。經(jīng)電泳檢測(cè)表明3個(gè)農(nóng)桿菌均已導(dǎo)入表達(dá)載體質(zhì)粒pCAM2300_sad。2.7農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化淺白隱球酵母將含有質(zhì)粒pCAM2300-sad的根癌農(nóng)桿菌在LB平板培養(yǎng)基(含50 μ g/mL卡那霉 素，50 μ g/mL利福平)上劃線活化，挑取農(nóng)桿菌單克隆接種于IOmL液體LB培養(yǎng)基中(含 50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL利福平)，28°C，180r/min振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，用IM 培養(yǎng)基重懸(含50 μ g/mL卡那霉素，50 μ g/mL利福平)，稀釋至0D600至0. 15左右，繼續(xù) 培養(yǎng)5-6h至0D600為0. 4-0. 6 ；接種淺白隱球酵母于IOmL YPD培養(yǎng)基中，28°C，180r/min 振蕩培養(yǎng)18h后，按1 5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-6h。分別離心收集酵母和根癌 農(nóng)桿菌菌體，用無(wú)菌水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體，農(nóng)桿菌濃度稀釋至0D600為0. 5左 右(約1010個(gè)細(xì)胞/mL)，酵母稀釋至0D660為0.7左右(約108個(gè)細(xì)胞/mL)，各取50 μ L 加入IOmL IM培養(yǎng)基(含AS 200ymol/L)中，25°C，180r/min培養(yǎng)過(guò)夜后，取100 μ L培養(yǎng) 液涂布鋪有微孔濾膜的IM(含AS 200ymol/L)平板上，25°C倒置遮光培養(yǎng)2d。2. 8轉(zhuǎn)化子的篩選將微孔濾膜轉(zhuǎn)接到SM I培養(yǎng)基(含100 μ g · mL—1卡那霉素，200 μ g · mL—1頭孢呋 辛那)上培養(yǎng)3-5d，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子和野生型淺白隱球酵母同時(shí)在SMII培養(yǎng)基平板 (含150μ g · mL—1卡那霉素，300 μ g · mL—1頭孢呋辛那)上劃線，倒置培養(yǎng)3_5d，觀察其生 長(zhǎng)情況，能夠正常生長(zhǎng)的可以初步認(rèn)為是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。2. 9轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取及PCR鑒定采用玻璃珠法提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以DNA為模板，以Vesad FP和VesadRP 為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件參照2. 3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8% (W/V)的瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)。2. 10 轉(zhuǎn)化子的 PCR-Southern 鑒定PCR擴(kuò)增同2. 3，回收純化VeSAD擴(kuò)增產(chǎn)物，以未轉(zhuǎn)化的野生菌作為陰性對(duì)照，表達(dá) 載體質(zhì)粒pCAM2300-sad作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。按Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit II 操作步驟探針標(biāo)記、轉(zhuǎn)膜、雜交，最后 進(jìn)行顯影分析。雜交結(jié)果表明千年桐VeVeSAD基因已整合到淺白隱球酵母基因組中。2. 11轉(zhuǎn)基因產(chǎn)油脂酵母的發(fā)酵培養(yǎng)挑取保存于斜面的酵母細(xì)胞，于PDA斜面培養(yǎng)基上28°C活化培養(yǎng)2d，用接種環(huán)挑
8取活化后的酵母細(xì)胞分別接入到50ml的液體種子培養(yǎng)基中，于28°C，180r/min振蕩培養(yǎng) 24h。然后將種子液按10%的比例接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，三角瓶裝液量 均為為100ml，在28°C，180r/min振蕩培養(yǎng)144h。2. 12油脂提取及脂肪酸成分測(cè)定油脂提取利用酸熱法提取油脂，脂肪甲酯化采用氫氧化鉀_甲醇室溫酯化法，油 脂脂肪酸組成及相對(duì)含量的氣相色譜分析在Agilent 6890N氣相色譜儀上測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)千年桐VeSAD基因的少根根霉菌株的油酸含量明顯高于未轉(zhuǎn)化 的野生型菌株，油酸含量為50. 21%，比對(duì)照提高了 14. 4%。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是在酵母基因組中含有千年桐VeSAD基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次含有CaMV35S啟動(dòng)子、千年桐VeSAD序列、終止密碼子，其中所述的酵母是淺白隱球酵母；該方法的步驟如下(1)、含酶切位點(diǎn)千年桐VeSAD基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列獲得根據(jù)千年桐VeSAD基因核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以千年桐未成熟種子總RNA為模板，經(jīng)RT PCR擴(kuò)增，在VeSAD上游引入Sal I酶切位點(diǎn)，下游引入Kpn I酶切位點(diǎn)，電泳回收VeSAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測(cè)序，命名該載體為pGEM T sad；(2)、VeSAD正義表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)合表達(dá)載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點(diǎn)——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、SalI、Pst I，選用Sal I、Kpn I兩個(gè)位置來(lái)作為插入目的片段的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶Sal I、Kpn I酶切位點(diǎn)的引物，以克隆載體質(zhì)粒pGEM T Vesad為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I雙酶切；分別回收相應(yīng)的片段，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，表達(dá)載體命名為pCAM2300 sad；(3)重組農(nóng)桿菌菌株獲得采用凍溶法將重組表達(dá)載體pCAM2300 sad農(nóng)桿菌菌株EHA105、LBA4404、AGL 1；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，活化含重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，與淺白隱球酵母菌液共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移到含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上，獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR和Southern分子鑒定，表明千年桐VeSAD基因已經(jīng)插入淺白隱球酵母的基因組中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是 PCR擴(kuò)增VeSAD基因含酶切位點(diǎn)cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)，根據(jù)在GenBank上登錄的VeSAD基因核 苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，引物序列如下Vesad FP :GAT GTC GAC ATG GCA CTC AAG CTVesad RP :GAC GGT ACC TAA CAG CTG CAC TT其中Vesad FP含酶切位點(diǎn)Sal I，Vesad RP含酶切位點(diǎn)Kpn I，以cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增千年桐VeSAD基因cDNA編碼區(qū)，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C 30S、58°C 30S、 72°C lmin,30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin ；擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是 所述的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體pCAM2300-sad含有千年桐VeSAD基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)油酸的淺白隱球酵母工程菌株的構(gòu)建方法，提供一種高產(chǎn)油酸的酵母工程菌株，該載體以pCAMBIA2300為基本骨架，含有千年桐VeSAD基因，可以改變產(chǎn)油酵母脂肪酸成分從而提高油酸含量，該方法的步驟如下(1)含酶切位點(diǎn)千年桐VeSAD基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列獲得；(2)VeSAD正義表達(dá)載體構(gòu)建；(3)重組農(nóng)桿菌菌株獲得；(4)淺白隱球酵母工程菌株的獲得。本發(fā)明有益的效果是本發(fā)明將從千年桐種子總RNA中分離的VeSAD基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pCAMBIA2300上，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將VeSAD基因?qū)霚\白隱球酵母，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表達(dá)，增加了淺白隱球酵母的產(chǎn)油率，特別是提高了油脂中油酸的含量。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101892250SQ20101016201
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者吳開云, 李紀(jì)元, 李辛雷, 田敏, 范正琪, 陳東亮 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所