專利名稱：流體轉(zhuǎn)移控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流體轉(zhuǎn)移控制方法，所述方法基于對待轉(zhuǎn)移流體內(nèi)染料強(qiáng)度的測量。 更具體而言，本發(fā)明利用控制染料和猝滅劑分子用于流體轉(zhuǎn)移控制。
背景技術(shù)：
對于試驗的準(zhǔn)備而言，多數(shù)情況下需要將幾種流體試劑混合，對所述試驗的重現(xiàn) 性結(jié)果而言，轉(zhuǎn)移經(jīng)控制體積的每一種試劑和樣品是重要的。因為所有的流體轉(zhuǎn)移過程均 具有某一變動(variance)，因此轉(zhuǎn)移誤差不可避免，但至少它必須可能檢測那些具有不可 接受誤差的轉(zhuǎn)移過程，以便忽略這些試驗的結(jié)果。特別地，實時PCR系統(tǒng)要求所有反應(yīng)組分的精確混合物用于可信的且可比較的定 量，因為實時PCR所要求的樣品材料、引物/探針以及主混合物(Master mixes)的量顯著 地影響定量結(jié)果。但是當(dāng)然，其他試驗也要求具有混合幾種組分的裝置，且所述裝置的體積 轉(zhuǎn)移控制也是重要的。為了解決這些不確定性，標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)技術(shù)可以使用，主要建立了兩 種不同的標(biāo)準(zhǔn)化方法用于定量實時PCR(qPCR)(1)為了針對樣品材料(DNA或RNA)的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將未調(diào)節(jié)的參照基因與靶 基因組合測量，并計算靶基因/參照基因的比值(相對定量方法參見例如LightCycler 480 操作者手冊，179ff頁)。(2)為了針對熒光強(qiáng)度的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，加入?yún)⒄杖玖?不參加qPCR反應(yīng))， 并將所有測量的熒光數(shù)值針對參照染料熒光進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(應(yīng)用生命系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)，ROX 參照染料，US 5，736，333)。但這兩種標(biāo)準(zhǔn)化方法均呈現(xiàn)一些問題。當(dāng)應(yīng)用相對定量而不是使用絕對定量時， 標(biāo)準(zhǔn)化方法(1)只能控制樣品材料的量/質(zhì)量(amount/quality)。此外，該方法不能控制 除樣品材料外的任何其他PCR組分的量。標(biāo)準(zhǔn)化方法(2)只能針對由qPCR系統(tǒng)變動生成 的熒光強(qiáng)度差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)某一組分的量低于某一限度時，它不能控制或警告使用者。目前，沒有本領(lǐng)域已知的對待混合用于試驗裝置的組分體積提供控制系統(tǒng)的流體 轉(zhuǎn)移控制系統(tǒng)。本發(fā)明提供了用于試驗裝置的封閉系統(tǒng)，其包括鑒定混合用于所述試驗的組分體 積誤差的控制策略。依照本發(fā)明的方法特別適用于實時PCR擴(kuò)增的裝置。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是流體轉(zhuǎn)移控制方法，該方法包括a)提供含控制染料的待轉(zhuǎn)移溶液，b)將預(yù)定體積的包含一定濃度所述控制染料的所述溶液轉(zhuǎn)移至復(fù)數(shù)個容器中，C)測量各個容器內(nèi)控制染料的強(qiáng)度，d)將步驟C)中對各個容器測量的強(qiáng)度與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，如果步驟C)中測量 的強(qiáng)度低于所述預(yù)定閾值，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，e)對步驟C)中 測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器編譯平均強(qiáng)度數(shù)值，
f)對步驟c)中測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器進(jìn)行檢驗，如果所述強(qiáng) 度落在步驟e)中編譯的所述平均強(qiáng)度數(shù)值周圍的預(yù)定范圍之內(nèi)，其中如果步驟c)中測量 的強(qiáng)度未落在所述范圍之內(nèi)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及g)對步驟c)中測量的強(qiáng)度落在步驟f)中的所述預(yù)定范圍之內(nèi)的所有容器宣布為 正確的流體轉(zhuǎn)移。本發(fā)明通篇的“溶液”被用作需要被轉(zhuǎn)移至容器用于在所述容器中的隨后反應(yīng)的 所有種類液體組分的總稱，其中所述反應(yīng)可能需要向所述容器中加入額外的組分。當(dāng)然，依 照本發(fā)明的方法可應(yīng)用于需要在所述反應(yīng)之前進(jìn)行的每一個轉(zhuǎn)移步驟。如果超過一種溶液 被轉(zhuǎn)移至一個反應(yīng)容器，每一種所述溶液可與不同的、有區(qū)別的染料混合。備選地，每一種 溶液可含有相同的染料，且每一步驟之后強(qiáng)度的變化可用于轉(zhuǎn)移控制。本發(fā)明通篇的控制染料被用作轉(zhuǎn)移控制?？刂迫玖系拇嬖诳墒褂眠m宜機(jī)械測量， 所述適宜機(jī)械取決于所使用的染料，例如用于光學(xué)染料的PMTs或CCD芯片或在放射性染料 情況中的閃爍計數(shù)器。所測量的強(qiáng)度通過軟件模塊進(jìn)行處理，所述軟件模塊將經(jīng)計算的數(shù)值與某些閾值 (例如，最小熒光，與平均數(shù)值的偏差的范圍)進(jìn)行比較。該軟件模塊生成輸出信號(a)提 示使用者某一容器未通過轉(zhuǎn)移控制檢查(“軟關(guān)閉”)或(b)抑制未通過轉(zhuǎn)移控制的容器的 結(jié)果計算(“硬關(guān)閉”)。此外，該軟件模塊可用于避免具有檢測到的轉(zhuǎn)移誤差的容器的進(jìn)
一步處理。本發(fā)明的優(yōu)點是，對自動化方式中某一應(yīng)用要求的所有組分的轉(zhuǎn)移體積正確性進(jìn) 行獨立檢查。特別是，當(dāng)自動的液體處理系統(tǒng)(吸液(pipetting)機(jī)器人)用于反應(yīng)裝置 時，沒有經(jīng)由眼睛的手動控制適用于該處理。此外，在低體積應(yīng)用(總反應(yīng)體積<3iU)中 控制轉(zhuǎn)移過程具有特殊的關(guān)聯(lián)性，因為(亞)微升體積的液體處理在準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性方面 是非?？量痰摹１景l(fā)明的另一方面是在實時PCR擴(kuò)增工作流程中的流體轉(zhuǎn)移控制方法，該方法包 括i)提供含控制染料的待轉(zhuǎn)移溶液，ii)將預(yù)定體積的包含一定濃度所述控制染料的所述溶液轉(zhuǎn)移至復(fù)數(shù)個容器中，iii)測量各個容器內(nèi)控制染料的強(qiáng)度，iv)將步驟iii)中對各個容器測量的強(qiáng)度與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，其中如果步驟 iii)中測量的強(qiáng)度低于所述預(yù)定閾值，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及v)在所述復(fù)數(shù)個容器中進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增，其中對在那些具有步驟iv)中檢測到 的流體轉(zhuǎn)移誤差的容器中所進(jìn)行的實時PCR擴(kuò)增結(jié)果相應(yīng)地進(jìn)行標(biāo)記。備選地，依照本發(fā)明的實時PCR擴(kuò)增工作流程中的流體轉(zhuǎn)移控制方法也可包含下 述步驟代替步驟v)而進(jìn)行v’)在那些不具有步驟iv)中中檢測到的流體轉(zhuǎn)移誤差的容器中進(jìn)行實時PCR擴(kuò)
+飽
+曰o因為實時PCR擴(kuò)增要求幾種組分，每一種組分可能含有相同的或不同的染料作為 轉(zhuǎn)移控制。在實時PCR反應(yīng)開始之前，使用實時PCR儀器測量每一種染料的強(qiáng)度。例如，一 種染料包含于qPCR主混合物中，第二控制染料包含于樣品材料中，第三控制染料包含于引物/探針混合物中。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個方面是流體轉(zhuǎn)移控制方法，該方法包括a)提供含控制染料的待轉(zhuǎn)移溶液，b)將預(yù)定體積的包含一定濃度所述控制染料的所述溶液轉(zhuǎn)移至復(fù)數(shù)個容器中，c)測量各個容器內(nèi)控制染料的強(qiáng)度，d)將步驟c)中對各個容器測量的強(qiáng)度與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，其中如果步驟c)中 測量的強(qiáng)度低于所述預(yù)定閾值，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，e)對步驟c)中測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器編譯平均強(qiáng)度數(shù)值，f)對步驟c)中測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器進(jìn)行檢驗，如果所述強(qiáng) 度落在步驟e)中編譯的所述平均強(qiáng)度數(shù)值周圍的預(yù)定范圍之內(nèi)，其中如果步驟c)中測量 的強(qiáng)度未落在所述范圍之內(nèi)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及g)對步驟c)中測量的強(qiáng)度落在步驟f)中的所述預(yù)定范圍之內(nèi)的所有容器宣布為 正確的流體轉(zhuǎn)移。在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述復(fù)數(shù)個容器是作為多孔板 排列的，所述多孔板具有至少8孔，優(yōu)選至少96孔，更優(yōu)選至少384孔，最優(yōu)選至少1536孔。備選地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，分開的容器排列于支持架上同樣適用于本發(fā) 明。當(dāng)然，本發(fā)明通篇有可能多孔板的一些孔是空的，并且不是復(fù)數(shù)個容器中的各個容器均 接收流體轉(zhuǎn)移。在依照本發(fā)明的再一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟d)中所述閾值是基于使 用參照溶液所測量的強(qiáng)度數(shù)值而預(yù)定的，所述參照溶液具有步驟b)中的體積和控制染料 濃度。使用閾值作為第一轉(zhuǎn)移控制是為了檢測沒有任何溶液和隨后沒有任何強(qiáng)度的容 器，以及只獲得較小部分預(yù)定體積的容器。為了計算合適的閾值，鑒于所測量的強(qiáng)度可用作 閾值，優(yōu)選采用具有預(yù)定流體轉(zhuǎn)移過程的體積和染料濃度的溶液進(jìn)行參照測量。備選地，空容器的背景強(qiáng)度可用于定義預(yù)定閾值，例如閾值可被定義為背景強(qiáng)度 的三倍。因為較小的轉(zhuǎn)移變動是可接受的，因此更優(yōu)選允許所測量強(qiáng)度的某一偏差，例如 約10%的偏差。在該實例中，10%的轉(zhuǎn)移誤差仍然是可接受的。取決于所測量的強(qiáng)度，容器 將被標(biāo)記為“轉(zhuǎn)移控制通過”或“轉(zhuǎn)移控制失敗”。除該第一轉(zhuǎn)移控制之外，進(jìn)行第二轉(zhuǎn)移控制以評價容器之間的偏差，因為所述偏 差提出了所述容器的有意義比較的問題。所述第二吸液控制是基于通過第一吸液控制的所 有容器平均強(qiáng)度數(shù)值周圍的預(yù)定范圍的。取決于所測量的強(qiáng)度，容器將被標(biāo)記為“范圍控制 通過”或“范圍控制失敗”。該第二吸液控制在方法的每次使用之間待轉(zhuǎn)移溶液存在高變動的情況中具有特 別的重要性。待轉(zhuǎn)移溶液的這種變動可能源于方法的隨后應(yīng)用之間的體積偏置或源于控制 染料濃度的移動。在這樣的情況中，不可能對平均值設(shè)定有意義的閾值以應(yīng)用于方法的每 次使用。因此，本發(fā)明提供了只基于實際轉(zhuǎn)移運(yùn)行而不需要另一預(yù)定閾值的自動化吸液控制的可能性，因為平均強(qiáng)度數(shù)值是對每一次運(yùn)行測定的，以鑒定可比較的容器。與第一轉(zhuǎn)移控制組合可保證沒有轉(zhuǎn)移體積遠(yuǎn)離預(yù)定量的容器被用于測定平均強(qiáng) 度數(shù)值，因為這些容器將嚴(yán)重地扭曲第二控制的數(shù)值。主要有兩種不同的適宜實施方式用于使用平均強(qiáng)度數(shù)值周圍的這種范圍。依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法是這樣一種方法，其中步驟f)中所 述預(yù)定范圍在步驟e)中編譯的所述平均強(qiáng)度數(shù)值周圍是對稱的。依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法是這樣一種方法，其中步驟f)中所 述預(yù)定范圍在步驟e)中編譯的所述平均強(qiáng)度數(shù)值周圍是不對稱的。這兩種實施方式反映了可接受變動的不同情況。在朝向較低和較高轉(zhuǎn)移體積的旋 進(jìn)(precession)具有相等重要性的情況中，鑒于所述范圍的寬度是基于可接受的轉(zhuǎn)移變 動預(yù)定的，應(yīng)該使用對稱的范圍。在變動例如朝向較高體積的變動不具關(guān)鍵性的情況中，優(yōu) 選使用對較小體積具有小的亞范圍且對較高體積具有較大亞范圍的不對稱范圍。如果需將超過一種溶液轉(zhuǎn)移至各個容器，同樣對其他溶液而言，可在本發(fā)明的范 圍之內(nèi)使用控制。對一個實施方式而言，其他溶液也將與控制染料混合。本發(fā)明通篇有可 能對每一種溶液使用相同的控制染料，如果這些溶液是一個接著一個地加入到容器中的， 且如果在加入每一種溶液后測量強(qiáng)度。因此，該實施方式中的轉(zhuǎn)移控制是基于加入某一溶 液后控制染料的強(qiáng)度增加的。備選地，每一種溶液可與不同的控制染料混合，如此，所述染 料在光譜上是可區(qū)別的。當(dāng)然，在該實施方式中，溶液可一次全部或一個接著一個地加入到 容器中，因為所有染料的強(qiáng)度可被獨立地測量。如果需將兩種溶液需要加入到容器中，依照本發(fā)明的優(yōu)選方法對第一溶液使用控 制染料，對第二溶液使用猝滅劑分子。這種裝置具有這樣的優(yōu)點，即兩種轉(zhuǎn)移控制可只采用 一種染料來建立，如此，與要求兩種染料的裝置相比，這種測量強(qiáng)度的機(jī)械較簡單。依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法是這樣一種方法，其中將預(yù)定體積的 包含一定濃度猝滅劑分子的第二溶液加入到容器中，且其中所述猝滅劑分子猝滅步驟a) 中使用的所述控制染料的強(qiáng)度，所述方法包括額外的步驟h)測量各個容器內(nèi)控制染料經(jīng)猝滅強(qiáng)度(quenched intensity),i)基于步驟h)中對各個容器測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度，計算猝滅參數(shù)值，其中如果所述 猝滅參數(shù)值未達(dá)到預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，j)對步驟i)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的所有容器編譯平 均猝滅參數(shù)值，k)對步驟i)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的所有容器進(jìn)行檢 驗，如果所述猝滅參數(shù)值落在步驟j)中編譯的所述平均猝滅參數(shù)值周圍的預(yù)定第二范圍 之內(nèi)，然而如果步驟i)中測量的所述猝滅參數(shù)值未落在所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)，則對某一 容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及1)對步驟i)中測量的猝滅參數(shù)值落在步驟k)中所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)的所有容 器宣布為正確的第二流體轉(zhuǎn)移。在該實施方式中，第二流體轉(zhuǎn)移控制是再一次基于兩個控制步驟的，S卩如上所述 的“轉(zhuǎn)移控制”和“范圍控制”。因為步驟h)_l)是在步驟a)_g)之后的，因此有兩種不同的 實施方式可能落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟h)_l)只對在步驟d)中未 檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差的容器進(jìn)行。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟h)_l)只對在步驟g)中宣 布為具有正確流體轉(zhuǎn)移的容器進(jìn)行。取決于依照本發(fā)明的方法的應(yīng)用，只有在第一流體轉(zhuǎn)移通過了一種或兩種轉(zhuǎn)移控 制的時候，它可優(yōu)選進(jìn)行第二流體轉(zhuǎn)移。另一方面，如果甚至對失敗的容器運(yùn)行整個工作 流程也比只對某一量的容器停止工作流程更合理，則這些容器至少應(yīng)被標(biāo)記為具有個別誤差。對第二流體轉(zhuǎn)移的第一轉(zhuǎn)移控制而言，計算猝滅參數(shù)值以便與預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)行比較。猝滅參數(shù)是基于步驟h)中測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度的，且所述猝滅參數(shù)主要有兩種主 要的實施方式，即所述參數(shù)是所測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度本身，或所述參數(shù)是使用控制染料強(qiáng)度 和經(jīng)猝滅強(qiáng)度編譯的比值。在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，各個容器的所述猝滅參數(shù)值是 步驟h)中測量的控制染料的經(jīng)猝滅強(qiáng)度。在依照本發(fā)明的一種更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，某一容器的流體轉(zhuǎn)移誤差是 在步驟i)中檢測的，如果步驟h)中測量的控制染料的經(jīng)猝滅強(qiáng)度高于預(yù)定經(jīng)猝滅的閾值。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟i)中所述經(jīng)計算的猝滅 參數(shù)是步驟c)中測量的強(qiáng)度與步驟h)中測量的控制染料經(jīng)猝滅強(qiáng)度的比值。在依照本發(fā)明的另一更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，某一容器的流體轉(zhuǎn)移誤差是 在步驟i)中測量的，如果所述比值低于或高于預(yù)定經(jīng)猝滅的閾值比。第二溶液的轉(zhuǎn)移誤差等于容器中的小量猝滅劑分子，當(dāng)然，所測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度 將高于所預(yù)期的。因此，在吸液誤差的情況中，步驟c)中測量的控制染料強(qiáng)度除以步驟h) 中測量的控制染料經(jīng)猝滅強(qiáng)度的比值將小于預(yù)定經(jīng)猝滅的閾值比。另一方面，步驟h)中測 量的控制染料經(jīng)猝滅強(qiáng)度除以步驟c)中測量的控制染料強(qiáng)度的比值必須大于預(yù)定經(jīng)猝滅 的閾值比以便檢測吸液誤差。如關(guān)于第一流體轉(zhuǎn)移的閾值和范圍所討論的，同樣預(yù)定的猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)是基于使 用參照溶液的測量的，當(dāng)然對該實施方式而言要求兩種參照溶液。再一次，同樣所述預(yù)定的猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)可使用空容器的強(qiáng)度和不含猝滅劑分子的 容器的強(qiáng)度而被經(jīng)驗地定義。在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述預(yù)定的猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)是基 于使用兩種參照溶液的測量的，第一參照溶液具有步驟b)中的體積和控制染料濃度，且第 二參照溶液具有將在所述第二溶液的流體轉(zhuǎn)移中使用的體積和猝滅劑染料濃度。同樣關(guān)于所述第二范圍，有兩種不同的實施方式也用于其裝置以及上面關(guān)于第一 范圍在此應(yīng)用的討論。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟k)中所述預(yù)定的第二范 圍在步驟j)中所述平均猝滅參數(shù)值周圍是對稱的，且所述第二范圍的寬度是基于可接受 的轉(zhuǎn)移變動而預(yù)定的。在依照本發(fā)明的再一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟k)中所述預(yù)定的第二范 圍在步驟j)中所述平均猝滅參數(shù)值周圍是不對稱的，且所述第二范圍的寬度是基于朝向較低或較高轉(zhuǎn)移體積的不同可接受轉(zhuǎn)移變動而預(yù)定的。關(guān)于依照本發(fā)明的方法不同步驟的連續(xù)性，對加入第二溶液而言有兩種不同的備 選方式。在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，將所述預(yù)定體積的包含猝滅劑 分子的第二溶液在步驟g)之后且步驟h)之前加入到容器中。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，將所述預(yù)定體積的包含猝滅劑 分子的第二溶液在步驟c)之前加入到容器中。因此，對于第一備選方式即在第一流體轉(zhuǎn)移的控制結(jié)束之后加入第二溶液而言， 控制染料的強(qiáng)度測量是在猝滅劑分子存在之前進(jìn)行的。對于第二備選方式而言，將兩種溶液在進(jìn)行兩種流體轉(zhuǎn)移控制之前混合，因而控 制染料和猝滅劑分子存在于容器中用于兩次控制測量。依照本發(fā)明方法的裝置是可能的， 如果控制染料的猝滅可在所述容器內(nèi)打開和關(guān)閉。在依照本發(fā)明的一種更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，步驟c)所述控制染料的強(qiáng) 度和步驟h)中所述控制染料的經(jīng)猝滅強(qiáng)度是在所述容器內(nèi)基于在控制染料的經(jīng)猝滅狀態(tài) 和非經(jīng)猝滅狀態(tài)之間切換而連續(xù)測量的。如此，猝滅分子能夠猝滅控制染料的強(qiáng)度，猝滅劑分子需要緊密靠近控制染料，因 而猝滅劑分子必須具有結(jié)合于控制染料的親和力。因此，為了避免猝滅劑分子與控制染料 的結(jié)合，它必須可能克服容器中溶液內(nèi)的所述親和力。取決于猝滅劑分子和控制染料之間 相互作用的類型，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道避免所述相互作用的操作。在依照本發(fā)明的另一更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述溶液參數(shù)為溶液溫度。在依照本發(fā)明的再一更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述溶液參數(shù)為溶液摩爾濃 度或溶液PH。除上述猝滅劑分子和控制染料的親和力之外，重要的是控制染料的發(fā)射和猝滅劑 分子的吸光度在光譜上是相互適應(yīng)的。如果發(fā)射光譜和吸收光譜之間的重疊不是徹底地充 足，則猝滅將變得不充分。在依照本發(fā)明的又一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述猝滅劑分子和所述控制染 料在光譜上是適應(yīng)的，如此，控制染料的強(qiáng)度可被所述猝滅劑分子有效地猝滅。另一方面，可能使用其吸收光譜只能猝滅控制染料一部分發(fā)射光譜的猝滅劑分 子，因而控制染料強(qiáng)度以及經(jīng)猝滅強(qiáng)度的測量只在相應(yīng)于猝滅劑分子的吸收光譜的頻譜之 內(nèi)進(jìn)行。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述控制染料為熒光染料。不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的方法特別適用于為了準(zhǔn)備實時PCR擴(kuò)增的流體轉(zhuǎn) 移過程。對于這種實時PCR而言，需混合幾種組分，即待擴(kuò)增的樣品、包含聚合酶和核苷酸 類的主混合物以及包含引物和探針的檢測混合物。作為依照本發(fā)明的適宜流體轉(zhuǎn)移方案的 實例，將包含控制染料的主混合物與檢測混合物混合，并將所述混合物轉(zhuǎn)移至進(jìn)行第一流 體轉(zhuǎn)移控制的容器中。然后，將包含猝滅劑分子的樣品加入到進(jìn)行第二流體轉(zhuǎn)移控制的所 述容器中。備選地，當(dāng)然可能使用包含控制染料的樣品和包含猝滅劑分子的主混合物。此 外，也可能通過使用加入到檢測混合物中的第二控制染料從而控制主混合物和檢測混合物 的混合。
在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，依照步驟a) _g)轉(zhuǎn)移所述溶液 用于隨后的含有檢測染料的實時PCR擴(kuò)增。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，依照步驟a)_l)轉(zhuǎn)移所述溶液 用于隨后的含有檢測染料的實時PCR擴(kuò)增。如果將依照本發(fā)明的方法應(yīng)用于實時PCR準(zhǔn)備過程中的流體轉(zhuǎn)移控制，則考慮到 PCR擴(kuò)增在線監(jiān)測所要求的檢測染料的發(fā)射光譜不受控制染料的影響是重要的。在依照本發(fā)明的一種更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述控制染料與所述檢測染 料在光譜上是分離的。在依照本發(fā)明的另一更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述控制染料和所述檢測染 料為熒光染料。不限制本發(fā)明的范圍，依照本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方式是基于寡核苷酸類作 為控制染料以及猝滅劑分子的親和標(biāo)記物的。在依照本發(fā)明的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述控制染料連接于寡核苷酸。在依照本發(fā)明的另一優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述猝滅劑分子連接于第二寡 核苷酸。如果連接于控制染料和猝滅劑分子的寡核苷酸類應(yīng)該互相具有親和力，則它們的 序列必須是至少部分互補(bǔ)的。在依照本發(fā)明的一種更優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法中，所述寡核苷酸和所述第二寡 核苷酸具有互補(bǔ)的序列。寡核苷酸類用作親和標(biāo)記物具有額外的優(yōu)點，即控制染料的猝滅可分別通過增加 或降低溶液溫度高于或低于寡核苷酸和第二寡核苷酸的雜化解鏈溫度而輕易地關(guān)閉和打 開。本發(fā)明的另一方面為實時PCR擴(kuò)增工作流程中的流體轉(zhuǎn)移控制方法，該方法包括i)提供含控制染料的待轉(zhuǎn)移溶液，ii)將預(yù)定體積的包含一定濃度所述控制染料的所述溶液轉(zhuǎn)移至復(fù)數(shù)個容器中，iii)測量各個容器內(nèi)控制染料的強(qiáng)度，iv)將步驟iii)中對各個容器測量的強(qiáng)度與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，其中如果步驟 iii)中測量的強(qiáng)度低于所述預(yù)定閾值，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及v)在所述復(fù)數(shù)個容器中進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增，其中對在那些具有步驟iv)中檢測到 的流體轉(zhuǎn)移誤差的容器中所進(jìn)行的實時PCR擴(kuò)增結(jié)果相應(yīng)地進(jìn)行標(biāo)記。在依照本發(fā)明的實時PCR擴(kuò)增工作流程中流體轉(zhuǎn)移控制方法的另一實施方式中， 步驟v)可被下述步驟代替v’)在那些不具有步驟iv)中檢測到的流體轉(zhuǎn)移誤差的容器中進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增。依照本發(fā)明的實時PCR擴(kuò)增工作流程中的一種優(yōu)選的流體轉(zhuǎn)移控制方法是這樣 一種方法，其中將預(yù)定體積的包含一定濃度猝滅劑分子的第二溶液在步驟v)之前加入到 容器中，且其中所述猝滅劑分子猝滅步驟i)中使用的所述控制染料的強(qiáng)度，所述方法包括在步驟v)之前進(jìn)行的額外的步 驟
Α)測量各個容器內(nèi)控制染料的經(jīng)猝滅強(qiáng)度，B)基于步驟A)中對各個容器測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度，計算猝滅參數(shù)值，其中如果所述 猝滅參數(shù)值未達(dá)到預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，C)對步驟B)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的所有容器編譯平 均猝滅參數(shù)值，D)對步驟B)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的 所有容器進(jìn)行檢 驗，如果所述猝滅參數(shù)值落在步驟C)中編譯的所述平均猝滅參數(shù)值周圍的預(yù)定第二范圍 之內(nèi)，其中如果步驟B)中測量的所述猝滅參數(shù)值未落在所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)，則對某一 容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及E)對步驟B)中測量的猝滅參數(shù)值落在步驟D)的所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)的所有容 器宣布為正確的第二流體轉(zhuǎn)移。


圖1執(zhí)行依照本發(fā)明方法的軟件屏幕快照，說明復(fù)數(shù)個容器的轉(zhuǎn)移控制結(jié)果。圖2執(zhí)行依照本發(fā)明方法的PCR實施方式的軟件屏幕快照，說明復(fù)數(shù)個容器的PCR 擴(kuò)增曲線的輸出。實施例1主混合物和含有吸液控制組分的靶DNA混合物的配制A)用于來自人cDNA的GAPDH基因?qū)崟rPCR擴(kuò)增的2-倍主混合物被配制為含有下 列組分-1 μ M 依照 Seq ID No. 1 和 2 的人 GAPDH 引物-800ηΜ 人 GAPDH UPL 探針(通用探針實驗室(Universal ProbeLibrary)，探針 #60，羅氏應(yīng)用科學(xué)部(Roche Applied Science)，分類號(cat. No.) 04688589001)-使用PCR組分實時就緒的(Realtimeready) DNA Master、探針(羅氏應(yīng)用科學(xué) 部)。該主混合物含有4 μ M依照Seq ID No. 3在5’-端末端標(biāo)記有長波熒光染料(JA286， 羅氏應(yīng)用科學(xué)部；最大激發(fā)波長686nm，最大發(fā)射波長703nm)的寡核苷酸。B)用于實時擴(kuò)增的2-倍靶DNA混合物被配制為含有下列組分-Ing 人 cDNA(qPCR 人參照 cDNA，Clontech，分類號 639654)-4μΜ依照Seq ID No. 4在3’ -端標(biāo)記有非熒光猝滅劑(Dabsyl，羅氏應(yīng)用科學(xué) 部，WO 2007/059816)的寡核苷酸。依照Seq ID No. 3和4的兩種寡核苷酸是互補(bǔ)的。實施例2含有不同量主混合物和靶DNA混合物的多孔實時PCR板的配制使用Nanodrop快速液體處理機(jī)器人(Innovadyne，部分編號12043 (射流模塊 (Fluidics Module))和11245(階段模塊(Stage Module)))將主混合物和靶DNA混合物的 八種不同組合填充至1536孔實時PCR板(羅氏應(yīng)用科學(xué)部)中。 將每一種組合填充于代表技術(shù)復(fù)制的1536孔板的96個位置中。實施例3包括吸液控制測量步驟的實時PCR在配有分析軟件(羅氏應(yīng)用科學(xué)部)的LightCycler 1536儀器上進(jìn)行實時擴(kuò)增 和吸液控制測量。該軟件是以編程語言Microsoft. Net 0#寫入的。依照下列方案在進(jìn)行擴(kuò)增之前進(jìn)行吸液控制測量。A)吸液控制測量使用過濾器組合618 (激發(fā))/660 (發(fā)射)進(jìn)行兩次單個的采集。 使用過濾器組合465(激發(fā))/510(發(fā)射)進(jìn)行實時擴(kuò)增。 實施例4用于單獨的實時PCR反應(yīng)孔的流體轉(zhuǎn)移狀態(tài)將每一孔在55°C的熒光強(qiáng)度與軟件配置文件中保存的預(yù)定最小熒光閾值進(jìn)行比 較。該預(yù)定閾值是通過分析1536孔實時PCR板空孔的自體熒光而經(jīng)驗測定的。該閾值被 設(shè)定得顯著高于空孔的最大測量值。該閾值被設(shè)定為由原型軟件定義的5個熒光單位。熒光值低于閾值的所有板位置被設(shè)定為流體轉(zhuǎn)移誤差狀態(tài)“M-失敗”(主混合物 流體轉(zhuǎn)移失敗)。組合4和8 (參見實施例2中的表)樣品的結(jié)果在圖1中顯示。對高于熒光閾值的所有板位置，計算在55°C的熒光除以在37°C的熒光的比值。將 所計算的比值與軟件配置文件中保存的預(yù)定最小比值閾值進(jìn)行比較。該預(yù)定比值閾值是通 過分析1536孔實時PCR板的空孔和不含猝滅劑寡核苷酸(Seq ID No. 4)的孔而經(jīng)驗測定 的。該比值閾值被設(shè)定得顯著高于不含猝滅劑寡核苷酸的孔的最大測量的比值。該比值閾 值被設(shè)定為1.5。比值低于最小比值閾值的所有板位置被設(shè)定為流體轉(zhuǎn)移誤差狀態(tài)“S-失敗”(裝 置失敗，即靶DNA流體轉(zhuǎn)移失敗)。組合6和7 (參見實施例2中的表)樣品的結(jié)果在圖1 中顯示。對高于最小比值閾值的所有板位置，計算平均比值，并將其與軟件配置文件中保 存的預(yù)定比值范圍進(jìn)行比較。該預(yù)定比值范圍是通過比較流體轉(zhuǎn)移方法的PCR性能而經(jīng) 驗測定的，并被設(shè)定為在平均比值周圍是不對稱的。該可接受范圍被設(shè)定為高于平均比值 100 %和低于平均比值50 %。比值落在所述范圍之外的所有板位置被設(shè)定為流體轉(zhuǎn)移誤差狀態(tài)“S-失敗”(裝 置失敗，即靶DNA流體轉(zhuǎn)移失敗)。熒光數(shù)值高于預(yù)定最小熒光閾值、高于預(yù)定最小比值閾值和落在預(yù)定比值范圍之 內(nèi)的所有板位置被設(shè)定為流體轉(zhuǎn)移狀態(tài)“通過”。組合1、2、3和5樣品的結(jié)果在圖1中顯實施例5流體轉(zhuǎn)移控制結(jié)果與實時PCR結(jié)果組合的顯示流體轉(zhuǎn)移控制的狀態(tài)在實時PCR結(jié)果表中顯示(圖1)。分類和過濾允許使用者選 擇某一流體轉(zhuǎn)移控制狀態(tài)并識別有效的和無效的實時PCR反應(yīng)。從圖1中可看出，顯示流 體轉(zhuǎn)移控制狀態(tài)“通過”的樣品確實也顯示正調(diào)入(positive call)和有效的Cp數(shù)值。顯 示流體轉(zhuǎn)移控制狀態(tài)“失敗”(M-失敗或S-失敗)的樣品確實顯示負(fù)調(diào)入(negative call)和由主混合物和靶DNA混合物組合的預(yù)期裝置造成的無Cp數(shù)值。
結(jié)果表是與實時擴(kuò)增曲線組合的(圖2)。從圖2中可看出，顯示流體轉(zhuǎn)移控制狀 態(tài)“通過”的樣品確實也顯示正擴(kuò)增曲線。顯示流體轉(zhuǎn) 移控制狀態(tài)“失敗”(M-失敗或S-失 敗)的樣品確實顯示由主混合物和靶DNA混合物組合的預(yù)期裝置造成的負(fù)擴(kuò)增(negtive amplication)曲線。
權(quán)利要求
一種流體轉(zhuǎn)移控制方法，該方法包括a)提供含控制染料的待轉(zhuǎn)移溶液，b)將預(yù)定體積的包含一定濃度所述控制染料的所述溶液轉(zhuǎn)移至復(fù)數(shù)個容器中，c)測量各個容器內(nèi)控制染料的強(qiáng)度，d)將步驟c)中對各個容器測量的強(qiáng)度與預(yù)定閾值進(jìn)行比較，如果步驟c)中測量的強(qiáng)度低于所述預(yù)定閾值，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，e)對步驟c)中測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器編譯平均強(qiáng)度數(shù)值，f)對步驟c)中測量的強(qiáng)度高于所述預(yù)定閾值的所有容器進(jìn)行檢驗，如果所述強(qiáng)度落在步驟e)中編譯的所述平均強(qiáng)度數(shù)值周圍的預(yù)定范圍之內(nèi)，其中如果步驟c)中測量的強(qiáng)度未落在所述范圍之內(nèi)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及g)對步驟c)中測量的強(qiáng)度落在步驟f)中所述預(yù)定范圍之內(nèi)的所有容器宣布為正確的流體轉(zhuǎn)移。
2.依照權(quán)利要求1的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述復(fù)數(shù)個容器是作為多孔板排列的， 所述多孔板具有至少8孔，優(yōu)選至少96孔，更優(yōu)選至少384孔，最優(yōu)選至少1536孔。
3.依照權(quán)利要求1或2的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中步驟d)中所述閾值是基于使用參照 溶液測量的強(qiáng)度而預(yù)定的，所述參照溶液具有步驟b)中的體積和控制染料濃度。
4.依照權(quán)利要求1-3任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中將預(yù)定體積的包含一定濃度猝 滅劑分子的第二溶液加入到容器中，其中所述猝滅劑分子猝滅步驟a)中使用的所述控制 染料的強(qiáng)度，所述方法包括額外的步驟h)測量各個容器內(nèi)控制染料經(jīng)猝滅強(qiáng)度，i)基于步驟h)中對各個容器測量的經(jīng)猝滅強(qiáng)度，計算猝滅參數(shù)值，其中如果所述猝滅 參數(shù)值未達(dá)到預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)，則對某一容器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，j)對步驟i)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的所有容器編譯平均猝 滅參數(shù)值，k)對步驟i)中計算的猝滅參數(shù)值達(dá)到所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)的所有容器進(jìn)行檢驗， 如果所述猝滅參數(shù)值落在步驟j)中編譯的所述平均猝滅參數(shù)值周圍的預(yù)定第二范圍之 內(nèi)，然而如果步驟i)中測量的所述猝滅參數(shù)值未落在所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)，則對某一容 器檢測到流體轉(zhuǎn)移誤差，以及1)對步驟i)中測量的猝滅參數(shù)值落在步驟k)中所述預(yù)定第二范圍之內(nèi)的所有容器宣 布為正確的第二流體轉(zhuǎn)移。
5.依照權(quán)利要求4的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中步驟i)中所述經(jīng)計算的猝滅參數(shù)值為步 驟c)中測量的控制染料的強(qiáng)度和步驟h)中測量的控制染料的經(jīng)猝滅強(qiáng)度的比值。
6.依照權(quán)利要求4或5的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述預(yù)定猝滅閾值標(biāo)準(zhǔn)是基于使用 兩種參照溶液的測量的，第一參照溶液具有步驟b)中的體積和控制染料濃度，第二參照溶 液具有權(quán)利要求4中的體積和猝滅劑染料濃度。
7.依照權(quán)利要求4-6任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中將所述預(yù)定體積的包含猝滅劑 分子的第二溶液在步驟g)之后且步驟h)之前加入到容器中。
8.依照權(quán)利要求4-6任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中將所述預(yù)定體積的包含猝滅劑 分子的第二溶液在步驟c)之前加入到容器中。
9.依照權(quán)利要求8的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中步驟c)中控制染料的所述強(qiáng)度和步驟 h)中控制染料的所述經(jīng)猝滅強(qiáng)度是在所述容器內(nèi)、基于調(diào)節(jié)溶液參數(shù)以便在控制染料的經(jīng) 猝滅狀態(tài)和非經(jīng)猝滅狀態(tài)之間切換而連續(xù)測量的。
10.依照權(quán)利要求1-9任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述溶液是依照步驟a)_g)轉(zhuǎn) 移的，用于隨后的含有檢測染料的實時PCR擴(kuò)增。
11.依照權(quán)利要求1-9任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述溶液是依照步驟a)_l)轉(zhuǎn) 移的，用于隨后的含有檢測染料的實時PCR擴(kuò)增。
12.依照權(quán)利要求10-11任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述控制染料和所述檢測 染料為熒光染料。
13.依照權(quán)利要求1-12任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述控制染料連接于寡核苷酸。
14.依照權(quán)利要求4-13任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述猝滅劑分子連接于第二寡核苷酸。
15.依照權(quán)利要求13-14任一項的流體轉(zhuǎn)移控制方法，其中所述寡核苷酸和所述第二 寡核苷酸具有互補(bǔ)序列。
全文摘要
流體轉(zhuǎn)移控制。本發(fā)明提供了流體轉(zhuǎn)移控制方法，所述方法基于對待轉(zhuǎn)移流體內(nèi)染料強(qiáng)度的測量。更具體而言，本發(fā)明利用控制染料和猝滅劑分子用于流體轉(zhuǎn)移控制。
文檔編號C12Q1/68GK101857898SQ201010161878
公開日2010年10月13日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
發(fā)明者G·薩格納, M·霍拉特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司