專利名稱：一種提高豬圓環(huán)病毒2型全病毒滅活疫苗抗原量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高豬圓環(huán)病毒2型全病毒滅活疫苗抗原量的方法，具體地說是將豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞培養(yǎng)滅活物經(jīng)初效過濾、中效過濾和高效過濾三個(gè)階段，達(dá)到濃縮提高全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(PCVD)的病原，包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎-腎病綜合征(PDNS)、豬增生性壞死性肺炎(PNP)、豬先天性腦震顫(CT)、豬的流產(chǎn)與繁殖障礙等。目前，PCVD在我國(guó)的陽(yáng)性率呈逐年上升的趨勢(shì)，具有流行范圍廣、各生長(zhǎng)階段豬感染嚴(yán)重、保育豬發(fā)病率最高、混合感染突出等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PCV2疫苗的免疫能夠提供很好的保護(hù)，而且效果明顯，得到普遍認(rèn)可，如明顯降低死亡率、減少死淘率、提高生產(chǎn)成績(jī)、降低藥物治療費(fèi)用等。然而，在PCV2疫苗的研制過程中，遇到的主要問題是該病毒體外增殖能力差，培養(yǎng)物病毒含量低，病毒接種細(xì)胞不產(chǎn)生病變，病毒含量不易測(cè)定，病毒感染動(dòng)物臨床反應(yīng)不一，免疫力評(píng)價(jià)困難。其中提高疫苗的抗原量是PCV2疫苗生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸，因此業(yè)內(nèi)人士提出，通過馴化和篩選適應(yīng)PCV2生長(zhǎng)的細(xì)胞系、建立高密度培養(yǎng)技術(shù)等可望解決此類問題。但迄今為止，尚未見到相關(guān)成功的報(bào)道。目前，已有二件PCV2全病毒滅活疫苗獲得中國(guó)專利(CN200810024423. 1和 CN200810079560. 5)。前者采用了 PCV2上海分離株SH，在PK-15細(xì)胞中大量增殖，經(jīng)甲醛滅活加入白油佐劑進(jìn)行乳化，制備常規(guī)的白油佐劑疫苗；故其疫苗抗原量提高受到限制。后者系從典型PCV2病豬體內(nèi)分離出臟器組織，經(jīng)研磨、過濾得到臟器組織提取物，加入甲醛滅活，以生理鹽水稀釋制成原始滅活疫苗，將該疫苗接種到健康豬體內(nèi)促其發(fā)病或死亡后，采集臟器組織，經(jīng)研磨、過濾，加入甲醛滅活，以生理鹽水稀釋制成PCV2滅活疫苗；故其疫苗抗原量確定困難、制備成本增高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種濃縮提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法。實(shí)現(xiàn)上述目的具體技術(shù)解決方案如下1、一種提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，包括H(-15細(xì)胞增殖PCV2 培養(yǎng)滅活液取得、初效過濾、中效過濾、高效過濾。2、根據(jù)上述1所述提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，具體步驟和條件如下(1) PK-15細(xì)胞增殖PCV2培養(yǎng)滅活液取得在利用間接免疫熒光檢測(cè)H(-15細(xì)胞增殖PCV2培養(yǎng)液TCID50之后，經(jīng)終濃度
30. 甲醛37°C滅活30h。( 初效過濾利用4層無菌紗布初步過濾PCV2細(xì)胞培養(yǎng)滅活液。其目的在于除去細(xì)胞培養(yǎng)物中大的顆粒雜質(zhì)。(3)中效過濾將初效過濾液通過100KD的中空纖維超濾膜組件。其目的在于除去大分子量的蛋白質(zhì)。(4)高效過濾將中效過濾液再通過6KD的中空纖維超濾膜組件。其目的在于濃縮全病毒抗原， 可達(dá)10倍濃縮。本發(fā)明的制作工藝簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定、易調(diào)控、成功率高。本發(fā)明方法的生產(chǎn)投資少， 且無三廢問題。本發(fā)明的制作方法適合工業(yè)化生產(chǎn)，不受時(shí)間、地點(diǎn)的局限，可為大中型獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)企業(yè)采用。本發(fā)明通過將PCV2細(xì)胞培養(yǎng)滅活物經(jīng)初效過濾一中效過濾一高效過濾三個(gè)階段，達(dá)到10倍濃縮全病毒滅活疫苗的抗原量，這在當(dāng)前尚未馴化篩選出適應(yīng)PCV2生長(zhǎng)的細(xì)胞系、實(shí)現(xiàn)建立高密度培養(yǎng)技術(shù)的情況下，本發(fā)明的制作方法無疑為PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的提高提供了條件，從而為PCV2全病毒滅活疫苗的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明方法濃縮提高PCV2全病毒滅活疫苗的抗原量具有獨(dú)特的先進(jìn)性一、所用材料易得，所需設(shè)施簡(jiǎn)便。二、制作程序簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉。三、濃縮比率高，且對(duì)經(jīng)濃縮的PCV2抗原特性無任何影響。四、增強(qiáng)了疫苗的免疫效力，且無三廢問題，具有社會(huì)和經(jīng)濟(jì)雙重效益。
具體實(shí)施例方式結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。實(shí)施例該濃縮提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，包括下述制作工序1、PK-15細(xì)胞增殖PCV2培養(yǎng)滅活液取得將PCV2按病毒液DMEMSl 5的比例接種于長(zhǎng)成70%的單層PK-15細(xì)胞，37°C 吸附2h，棄孵育液并加入適量的含2%胎牛血清(FBS)的DMEM，置37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)18 24h后，用300mmoL的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽處理細(xì)胞30min，繼續(xù)用含2% FBS的 DMEM于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)4 后收毒，反復(fù)凍融三次取樣進(jìn)行PCR檢測(cè)后收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物。利用間接免疫熒光檢測(cè)最終的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50后，取PCV2細(xì)胞培養(yǎng)物(舉例6000mL)經(jīng)終濃度0. 甲醛37°C滅活30h，即可。2、初效過濾利用經(jīng)115°C高壓滅菌15min的4層無菌紗布，對(duì)PCV2細(xì)胞培養(yǎng)物滅活液(舉例 6000mL)在無菌條件下進(jìn)行過濾，收集濾液，即得不含細(xì)胞碎片等大顆粒雜質(zhì)的初效過濾液。3、中效過濾中效過濾前先將超濾裝置調(diào)壓閥打開，使壓力為OMPa，然后將6000mL初效過濾液通過生物蠕動(dòng)泵泵入截留分子量為100KD的中空纖維超濾膜組件至充滿膜組件，穩(wěn)定生物蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速，逐漸調(diào)節(jié)調(diào)壓閥至工作壓力0. 05MPa，開始超濾，至濃縮回流液為500mL時(shí)暫停超濾，用等體積的0. 01mol/L pH為7. 6的無菌PBS稀釋后繼續(xù)超濾，收集超濾液6000mL， 即得不含大于100KD分子量蛋白質(zhì)的PCV2全病毒滅活抗原(中效過濾液)。4、高效過濾高效過濾前先將超濾裝置調(diào)壓閥打開，使壓力為OMPa，然后將6000mL中效過濾液通過生物蠕動(dòng)泵泵入截留分子量為6KD的中空纖維超濾膜組件至充滿膜組件，穩(wěn)定生物蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速，逐漸調(diào)節(jié)調(diào)壓閥至工作壓力0. 05MPa，開始超濾濃縮，至濃縮回流液為500mL時(shí)終止超濾濃縮，收集超濾濃縮液，即得不低于10倍濃縮的PCV2全病毒滅活抗原。
權(quán)利要求
1.一種提高豬圓環(huán)病毒2型(PCM)全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，包括ra-15細(xì)胞增殖PCV2培養(yǎng)滅活液取得、初效過濾、中效過濾、高效過濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，其特征在于 初效過濾系利用經(jīng)115°C高壓滅菌15min的4層無菌紗布，對(duì)PCV2細(xì)胞培養(yǎng)物滅活液在無菌條件下進(jìn)行過濾，獲取不含細(xì)胞碎片等大顆粒雜質(zhì)的初效過濾液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，其特征在于 中效過濾前先將超濾裝置調(diào)壓閥打開，使壓力為OMPa，然后將初效過濾液通過生物蠕動(dòng)泵泵入截留分子量為100KD的中空纖維超濾膜組件至充滿膜組件，穩(wěn)定生物蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速，逐漸調(diào)節(jié)調(diào)壓閥至工作壓力0. 05MPa，開始超濾，至濃縮回流液為一定量時(shí)暫停超濾，用等體積的0. 01mol/L pH為7. 6的無菌PBS稀釋后繼續(xù)超濾，收集超濾液，即為不含大于100KD 分子量蛋白質(zhì)的PCV2全病毒滅活抗原的中效過濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高PCV2全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法，其特征在于 高效過濾前先將超濾裝置調(diào)壓閥打開，使壓力為OMPa，然后將中效過濾液通過生物蠕動(dòng)泵泵入截留分子量為6KD的中空纖維超濾膜組件至充滿膜組件，穩(wěn)定生物蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速，逐漸調(diào)節(jié)調(diào)壓閥至工作壓力0. 05MPa，開始超濾濃縮，至濃縮回流液為一定量時(shí)終止超濾濃縮， 收集超濾濃縮液，即為不低于10倍濃縮的PCV2全病毒滅活抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全病毒滅活疫苗抗原量的制作方法。該方法的工藝過程主要包括細(xì)胞增殖PCV2培養(yǎng)滅活液的取得、4層無菌紗布的初效過濾、100KD中空纖維超濾膜組件的中效過濾和6KD中空纖維超濾膜組件的高效過濾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可使PCV2全病毒滅活疫苗抗原量濃縮提高10倍，且對(duì)經(jīng)濃縮的PCV2抗原特性無任何影響，增強(qiáng)了疫苗的免疫效力。因此，該方法具有制作簡(jiǎn)便、易生產(chǎn)、成本低廉、質(zhì)量可控、濃縮比率高、實(shí)際效果好、且無三廢問題等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102210857SQ20101013888
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者孫裴, 李郁, 王桂軍, 蘇金存, 魏建忠 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)