專利名稱：：乙酰乙酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(s)-3-羥基丁酸乙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種乙酰乙酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法，尤其是一種以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266為生物催化劑、轉(zhuǎn)化乙酰乙酸乙酯制備(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法。
背景技術(shù)：
：3-羥基丁酸乙酯(ethyl-3-hydroxybutyrate，EHB)是一種重要的藥物中間體，其手性單一對映異構(gòu)體(S)-EHB是薰衣草醇、食菌甲誘醇、核球殼菌、格哈菌素、卡包霉素和灰綠霉素前體等天然產(chǎn)物的手性源，是非常有應(yīng)用前景的手性砌塊。(S)-3-羥基丁酸乙酯分子式C6H12O3，分子量132.16，CAS號56816-01_4，可通過還原乙酰乙酸乙酯制得。由于乙酰乙酸乙酯易于合成且價格低廉，對其進(jìn)行還原制備(S)-3-羥基丁酸乙酯是非常經(jīng)濟(jì)有效的方法。通過還原乙酰乙酸乙酯制備(S)-3_羥基丁酸乙酯主要有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法兩種。采用化學(xué)法不對稱還原乙酰乙酸乙酯需要在手性催化劑的催化下才能完成，化學(xué)還原過程中手性催化劑價格昂貴、制備過程繁瑣。生物轉(zhuǎn)化法主要有兩種方式，一種是直接利用醇脫氫酶催化乙酰乙酸乙酯，這種方法不僅要有酶蛋白參加反應(yīng)，而且還要添加價格昂貴的輔酶因子，在實際應(yīng)用中受到一定的限制。而微生物細(xì)胞中含有完整的酶系，如酵母細(xì)胞中含有醇脫氫酶系，可以實現(xiàn)輔酶的原位再生，不需要添加輔酶因子，是一種經(jīng)濟(jì)有效的制備(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法。采用微生物轉(zhuǎn)化法還原乙酰乙酸乙酯制備(S)-3_羥基丁酸乙酯未見專利報道，只有少數(shù)文章公開報道，且產(chǎn)物的對映體過剩值及轉(zhuǎn)化率均不理想，需要找到一種催化效率更高的菌株，并選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，最大限度地提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率及對映體過剩值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用催化效率高的釀酒酵母菌株轉(zhuǎn)化乙酰乙酸乙酯合成(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種乙酰乙酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-3_羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期2007年11月26日，保藏編號CGMCCNo.2266，已于在先申請CN200810059686.6中作為新菌株予以保護(hù)。菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCCNo.2266是從杭州市西湖啤酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用于轉(zhuǎn)化乙酰乙酸乙酯，得到釀酒酵母CGMCCNo.2266具有良好的轉(zhuǎn)化乙酰乙酸乙酯生產(chǎn)(S)-3-羥基丁酸乙酯的能力。所述釀酒酵母CGMCCNo.2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊、濕潤、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。進(jìn)一步，所述方法包括在pH5.08.0的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸乙酯為底物、以釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于2545°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)840小時，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。所述乙酰乙酸乙酯在磷酸鹽緩沖液中的初始濃度為0.050.25mol/L。所述含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計為150g/g底物。為提高轉(zhuǎn)化效率，所述磷酸鹽緩沖液中還可添加有50150g/L的葡萄糖作為輔助底物。所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min，培養(yǎng)1830h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L,KH2PO4O.61.5g/L,自然pH值，溶劑為水。通常，菌株需要先用斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)獲得斜面活化菌種，活化菌種再經(jīng)種子培養(yǎng)獲得種子液再接入發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。本發(fā)明中，該釀酒酵母菌株的斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，亦可參照CN200810059686.6中的培養(yǎng)方法。所述分離純化方法如下將轉(zhuǎn)化液離心分離棄去菌體細(xì)胞，取上清液5070°C水浴12小時棄去沉淀，取清液用等體積正己烷萃取，萃余液減壓蒸餾蒸出水分，殘余物(殘余物為產(chǎn)物和緩沖液中的磷酸鹽)用正己烷溶解，所得混合液抽濾除去磷酸鹽，正己烷層加入無水硫酸鈉脫水，抽濾后，得到的正己烷溶液蒸餾除去正己烷即得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。具體的，所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種到斜面培養(yǎng)基，2635°C培養(yǎng)46天得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，瓊脂1525g/L，自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)從斜面培養(yǎng)基取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min，培養(yǎng)1826h得種子液；所述的種子培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO4O.61.5g/L，自然pH值，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積比1020%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min，培養(yǎng)1830h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO4O.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO4O.61.5g/L，自然pH值，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH5.08.0的磷酸鹽緩沖液中，加入0.050.25mol/L的乙酰乙酸乙酯和50150g/L的葡萄糖，以及以細(xì)胞干重計為150g/g乙酰乙酸乙酯的含酶菌體細(xì)胞，于2545°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)840小時；(5)分離純化轉(zhuǎn)化液離心分離棄去菌體細(xì)胞，取上清液5070°C水浴12小時棄去沉淀，取清液用等體積正己烷萃取，萃余液減壓蒸餾蒸出水分，殘余物用正己烷溶解，所得混合液抽濾除去磷酸鹽，正己烷層加入無水硫酸鈉脫水，抽濾后，得到的正己烷溶液蒸餾除去正己烷即得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。得到的(S)-3-羥基丁酸乙酯純品可用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測確定產(chǎn)物的純度和分子量。摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值(ee%)采用日本島津氣相色譜儀GC-2014分析檢測。色譜柱為CP-Chirasil-DexCB(25mX0.25mmX0.25μm)手性色譜柱，分析條件為進(jìn)樣器溫度250°C，檢測器溫度250°C，柱溫80°C，載氣為氮氣，分流比125。手性柱可以檢測到(R)_3-羥基丁酸乙酯和(S)-3-羥基丁酸乙酯兩種對映體的含量，進(jìn)一步計算出反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和(S)-3-羥基丁酸乙酯的對映體過剩值(ee%)。本發(fā)明中采用微生物細(xì)胞不對稱還原乙酰乙酸乙酯來制備(S)-3_羥基丁酸乙酯，可以獲得高對映體過剩值的產(chǎn)品，摩爾轉(zhuǎn)化率較高，重要的是，反應(yīng)中伴有輔酶再生過程有利于提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化法制備(S)-3_羥基丁酸乙酯與化學(xué)合成法、酶催化法相比具有以下優(yōu)點①生物催化劑為微生物菌體，比化學(xué)催化劑成本低廉；②環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和，常溫常壓下即可順利進(jìn)行轉(zhuǎn)化；③生產(chǎn)所用的菌株安全無毒；④不受季節(jié)影響，易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；⑤生產(chǎn)操作簡便，生物轉(zhuǎn)化率較高；⑥整個反應(yīng)過程中不需要添加輔酶。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例1斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)46天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C滅菌20min。用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以體積比10%的接種量接種于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得菌體。在含有100mlpH7.0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得菌體5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯，使其濃度分別為0.05mol/L、0.Imol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L，置于30°C，200r/min的搖床中反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，離心棄去菌體，上清液60°C水浴1小時棄去沉淀后取清液用等體積正己烷萃取，水相混合物(萃余液)采用減壓蒸餾除去水分后有鹽析出，加入正己烷溶解產(chǎn)物，抽濾除鹽后得到的樣品蒸去正己烷即可獲得(S)-3-羥基丁酸乙酯。氣相色譜分析摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過剩值(見表1)。表1底物初始濃度對轉(zhuǎn)化率及(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)46天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C滅菌20min。用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以10%的接種量接種于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得菌體。在含有100mlpH7.0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得菌體5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯濃度為0.15mol/L，加入輔助底物葡萄糖濃度分別為10g/L、30g/L、50g/L、70g/L、100g/L、150g/L，置于30°C，200r/min的搖床中反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，離心棄去菌體，上清液60°C水浴1小時棄去沉淀后取清液用等體積正己烷萃取，取水相混合物采用減壓蒸餾除去水分后有鹽析出，加入正己烷溶解產(chǎn)物，抽濾除鹽后得到的樣品蒸去正己烷即可獲得(S)-3-羥基丁酸乙酯。氣相色譜分析其摩爾轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物對映體過剩值。表2添加葡萄糖對轉(zhuǎn)化率及(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)46天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4Ig/L,121°C滅菌20min。調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以10%的接種量接種于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得菌體。在含有100mlpH7.0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得菌體5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯濃度為0.15mol/L，加入輔助底物葡萄糖100g/L，在200r/min的搖床中分別于25°C、30°C、35°C、40°C、45°C下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，離心棄去菌體，上清液60V水浴1小時棄去沉淀后取清液用等體積正己烷萃取，取水相混合物采用減壓蒸餾除去水分后有鹽析出，加入正己烷溶解產(chǎn)物，抽濾除鹽后得到的樣品蒸去正己烷即可獲得(S)-3-羥基丁酸乙酯。氣相色譜分析其摩爾轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物對映體過剩值。表3反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率及(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4:斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)46天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C滅菌20min。調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以10%的接種量接種于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得菌體。在含有100mlpH7.0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得菌體5g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯濃度為0.15mol/L，加入輔助底物葡萄糖濃度為100g/L，置于30°C，200r/min的搖床中分別反應(yīng)8h、16h、24h、32h、40h。反應(yīng)結(jié)束后，離心棄去菌體，上清液60°C水浴1小時棄去沉淀后取清液用等體積正己烷萃取，取水相混合物采用減壓蒸餾除去水分后有鹽析出，加入正己烷溶解產(chǎn)物，抽濾除鹽后得到的樣品蒸去正己烷即可獲得(S)-3-羥基丁酸乙酯。氣相色譜分析其摩爾轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物對映體過剩值。表4反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率及(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)46天。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水MgSO4O.25g/L，K2HPO4·3H20lg/L，KH2PO4lg/L,121°C滅菌20min。調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以10%的接種量接種于含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得菌體。在含有100mlpH7.0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中分別加入上述所得菌體分別為5g、10g、15g、20g、25g(干重)，加入乙酰乙酸乙酯0.15mol/L，加入輔助底物葡萄糖濃度為100g/L，置于30°C，200r/min的搖床中反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，離心棄去菌體，上清液60°C水浴1小時棄去沉淀后取清液用等體積正己烷萃取，取水相混合物采用減壓蒸餾除去水分后有鹽析出，加入正己烷溶解產(chǎn)物，抽濾除鹽后得到的樣品蒸去正己烷即可獲得(S)-3-羥基丁酸乙酯。氣相色譜分析摩爾轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物對映體過剩值。表5菌體量對轉(zhuǎn)化率及(S)-3-羥基丁酸乙酯對映體過剩值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>菌體細(xì)胞濃度(g/L)~~(S)-3-羥基丁酸乙酯的對映(干重/緩沖液體積)轉(zhuǎn)化率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種乙酰乙酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括在pH5.O8.O的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸乙酯為底物、以釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于2545°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)840小時，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述乙酰乙酸乙酯在磷酸鹽緩沖液中的初始濃度為0.050.25mol/L。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計為150g/g底物。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液中還添加有50150g/L的葡萄糖作為輔助底物。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞由如下方法制備得到將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min,培養(yǎng)1830h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO40.20.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L，KH2PO40·61.5g/L，自然pH值，溶劑為水。7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下將轉(zhuǎn)化液離心分離棄去菌體細(xì)胞，取上清液5070°C水浴12小時棄去沉淀，取清液用等體積正己烷萃取，萃余液減壓蒸餾蒸出水分，殘余物用正己烷溶解，所得混合液抽濾除去磷酸鹽，取正己烷層加入無水硫酸鈉脫水，抽濾后，得到的正己烷溶液蒸餾除去正己烷即得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種到斜面培養(yǎng)基，2635°C培養(yǎng)46天得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，瓊脂1525g/L，自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min,滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)從斜面培養(yǎng)基取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min，培養(yǎng)1826h得種子液；所述的種子培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO40.20.4g/L，K2HPO4·3H200.51.5g/L，KH2PO40.61.5g/L，自然pH值，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積比1020%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為2635°C，搖床轉(zhuǎn)速為150200r/min，培養(yǎng)1830h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖2632g/L,酵母粉24g/L，硫酸銨36g/L，無水MgSO40.2-0.4g/L，K2HPO4·3Η200·51.5g/L，KH2PO40·61.5g/L，自然pH值，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH5.08.0的磷酸鹽緩沖液中，加入0.050.25mol/L的乙酰乙酸乙酯和50150g/L的葡萄糖，以及以細(xì)胞干重計為150g/g乙酰乙酸乙酯的含酶菌體細(xì)胞，于2545°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)840小時；(5)分離純化轉(zhuǎn)化液離心分離棄去菌體細(xì)胞，取上清液5070°C水浴12小時棄去沉淀，取清液用等體積正己烷萃取，取萃余液減壓蒸餾蒸出水分，殘余物用正己烷溶解，所得混合液抽濾除去磷酸鹽，取正己烷層加入無水硫酸鈉脫水，抽濾后，得到的正己烷溶液蒸餾除去正己烷即得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。全文摘要本發(fā)明提供了一種乙酰乙酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述(S)-3-羥基丁酸乙酯。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在①生物催化劑為微生物菌體，比化學(xué)催化劑成本低廉；②環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和，常溫常壓下即可順利進(jìn)行轉(zhuǎn)化；③生產(chǎn)所用的菌株安全無毒；④不受季節(jié)影響，易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；⑤生產(chǎn)操作簡便，生物轉(zhuǎn)化率較高；⑥整個反應(yīng)過程中不需要添加輔酶。文檔編號C12P7/04GK101824438SQ20101010861公開日2010年9月8日申請日期2010年2月9日優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日發(fā)明者歐志敏,陳慶美,陳曉彥申請人:浙江工業(yè)大學(xué)