專利名稱：一種黃牛klf7基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛KLF7基因外顯子2及其側(cè)翼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替 換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝 數(shù)的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn) 換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們在 基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間 SNPs(iSNPs)等三類?？偟恼f來，cSNP比較少，因為在外顯子內(nèi)的變異率僅占周圍序列的 1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響， cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的 蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿 基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋 白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要 影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響 它的功能發(fā)揮，對個體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作 為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見， 故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn) SNPs 即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法， 但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非 常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢 測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費用，但是， PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非 理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具 有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時， 檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；而引物延伸法和寡核苷 酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測 平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。
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RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后引入限制性內(nèi)切酶 進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方 法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢 測的序列位點無特殊性要求。脂肪組織在維持能量穩(wěn)態(tài)具有重要的作用，脂肪代謝對于維持正常的生理活動具 有重要的作用。脂肪組織分泌的脂肪激酶，在許多生理過程如采食、葡萄糖代謝、繁殖、胰島 素易感性、和血管發(fā)生等方面發(fā)揮重要功能；而這些都與動物的生長密切相關(guān)。Krupple-Iike factor (KLF)轉(zhuǎn)錄因子家族在C端具有的三個連續(xù)的C2H2鋅指能 特異結(jié)合在富含GC的靶基因的啟動子上，從而活化或抑制靶基因的表達(dá)，具有廣泛的生物 學(xué)作用，包括細(xì)胞增殖，分化和發(fā)育，并參與脂肪代謝。KLF7屬于KLF家族，廣泛表達(dá)于脂肪細(xì)胞和各種人類組織包括胰臟、骨骼肌和肝 臟。在脂肪細(xì)胞中過表達(dá)KLF7會抑制脂肪形成，尤其抑制adiponectin基因在脂肪細(xì)胞中 的表達(dá)，但綠茶中的多酚-兒茶素能明顯增強adiponectin基因的表達(dá)和增加3T3-L1脂肪 細(xì)胞的葡萄糖攝取量，并伴隨KLF7的表達(dá)下調(diào)。嗎啡被發(fā)現(xiàn)能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào) KLF7的表達(dá)。人類KLF7基因位于染色體2q32，被報道是一個與糖尿病或代謝相關(guān)的位點， 而且KLF7能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞、胰臟β細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的功能，另外它被確定含有一個可以 判定二型糖尿病易感性的等位基因。最近，KLF7基因的A等位基因(rs2302870)在一個日 本人群體中被確定與二型糖尿病相關(guān)，它的另一個A等位基因(rs7568369)被確定與肥胖 有關(guān)。以上研究提示KLF7在能量代謝的調(diào)控中具有重要作用。截至2010年1月，國內(nèi)外尚無黃牛KLF7基因遺傳變異及其與經(jīng)濟性狀關(guān)系的研 究報道。由于目前中國黃牛KLF7基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究 及該基因遺傳變異與生長發(fā)育等性狀關(guān)聯(lián)，以及將其應(yīng)用于分子遺傳標(biāo)記和分子育種的研 究還處于空白狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，該 方法能夠檢測黃牛KLF7基因外顯子2及其側(cè)翼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性，將其多態(tài)性分析與性 質(zhì)關(guān)聯(lián)后用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下步驟以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對PI、P2、P3等摩爾比 的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內(nèi)切酶TaqI消化PCR擴增產(chǎn)物之后， 再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛KLF7基 因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對Pl為上游引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c ；下游弓I物 Rl :aggaaacagt ccaagtcctc ate ；所述的引物對P2為上游弓丨物 F2 :acggcacagt gacgttgaa ；
下游弓丨物 R2 :gaacagagag aagcccttcc cccctc ；所述的引物對P3為Jni^KlJFS=CtgttCCgag aagtggcatc catgccatc ；下游弓I物 R3 :actacaccaa ggctggcact。所述的PCR擴增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，57. 0°C退火35s， 72°C延伸35s，30 35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性為第41401位的多態(tài)性為=C1C1基因型表現(xiàn)為104和24bp條帶，C1T1基因型表現(xiàn)為 128、104和24bp條帶，T1T1基因型表現(xiàn)為128bp條帶；第42025位的多態(tài)性為=T2T2基因型表現(xiàn)為337bp條帶，T2C2基因型表現(xiàn)為337、 310和27bp條帶，C2C2基因型表現(xiàn)為310和27bp條帶；第42075位的多態(tài)性為=A3A3基因型表現(xiàn)為182bp條帶，A3G3基因型表現(xiàn)為182、 154和28bp條帶，G3G3基因型表現(xiàn)為154和28bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明公開了與黃牛生長性狀相關(guān)的功能基因KLF7外顯子2及其側(cè)翼區(qū)的3個位 點的單核苷酸多態(tài)性，這3個單核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。針對上述位點的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其檢測方法，通過設(shè)計特定的PCR引 物擴增片段，能夠用RFLP方法簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對KLF7基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與南陽牛不同生 長階段的生長性狀之間進行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明KLF7基因尤其是P2檢測SNP位點 可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測方法為KLF7基因的SNP與黃牛的生長性狀關(guān)系的建立奠定了 基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。


圖”乾牛KLF7基因第二外顯子及其側(cè)翼區(qū)擴增電泳圖2 j乾牛KLF7基因Pl檢測SNP位點擴增序列圖3 j乾牛KLF7基因Pl檢測SNP位點酶切結(jié)果電泳圖4 j乾牛KLF7基因P2檢測SNP位點擴增序列圖5 j乾牛KLF7基因P2檢測SNP位點酶切結(jié)果電泳圖6 j乾牛KLF7基因P3檢測SNP位點擴增序列圖”乾牛KLF7基因P3檢測SNP位點酶切結(jié)果電泳圖8 j乾牛KLF7基因PI、P2和P3檢測SNP位點酶切結(jié)果電泳圖
圖9 j乾牛KLF7基因PI、P2和P3檢測SNP位點測序圖。
具體實施例方式
以下通過對黃牛樣本采集及基因組DNA提取、檢測、純化與濃度分析、黃牛KLF7基因外顯子2及其側(cè)翼區(qū)的PCR擴增、黃牛KLF7基因外顯子2及其側(cè)翼區(qū)DNA片段的TaqI CRS-PCR-RFLP分析實施例來進一步說明本發(fā)明技術(shù)及其效果。所述是對本發(fā)明的解釋而不 是限定。a、黃牛KLF7基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測1、黃牛血樣的采集及處理取黃牛血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-80°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明采用了 4個黃牛品種共計1002個無血緣關(guān)系的母牛血樣，具體為(1)南陽牛血樣分別從251頭6 24月齡的純種南陽牛采集，采自河南省南陽 市；(2)秦川牛血樣分別從228頭4月齡的純種秦川牛采集，采自陜西大荔縣；(3)郟縣紅牛血樣分別從439頭成年郟縣紅牛采集，采自河南省郟縣；(4)中國荷斯坦奶牛血樣分別從84頭成年中國荷斯坦奶牛采集，采自陜西草灘 農(nóng)場奶牛場。2、血樣基因組DNA的提取、純化(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩 沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、
沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管 壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌，調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中。(6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70 %的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。(10) 500μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終 濃度達(dá)到50 μ g/mL。(11) 5°C保溫 IOh 左右。(12)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)和氯仿分別抽提一次。(13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。
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(14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA。(15)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。3、DNA池的構(gòu)建(1) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降 解的樣品進行DNA池的構(gòu)建。(2) OD 值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260歷、280歷處的OD值，并計算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進行純 化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(μ g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)(3)品種DNA池的構(gòu)建DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μ L，然后從秦川牛品種100個個體、 濃度為50ng/ μ L DNA的樣品中取10 μ L混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法也構(gòu)建南陽牛、郟縣紅牛和中國荷斯坦奶牛DNA池。4、PCR擴增引物設(shè)計根據(jù)GenBank公開的?；蚪M序列為參考，具體根據(jù)No. NC_007300序列設(shè)計引物 擴增KLF7基因的外顯子2及其側(cè)翼區(qū)的序列，其引物對序列P如下上游引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c 21;下游弓丨物 R3 :actacaccaa ggctggcact20;該對引物能夠擴增KLF7基因第41297bp到第42227bp的931bp的基因片段。5、PCR克隆黃牛KLF7基因分別以4個黃牛品種的DNA池為模版，以引物對P為引物進行PCR擴增，PCR總反 應(yīng)體系為25 μ L，見表1 ；PCR總反應(yīng)程序，見表2。表IPCR反應(yīng)體系
體系成分體積(UL)10 X PCR 緩沖液(MBI)2. 50MgCl2 (25mmol/L)1. 50dNTPs(2. 5mmol/L)2. 50上游引物(lOpmol/L)0. 25下游引物(lOpmol/L)0. 25Taq DNA 聚合酶(0. 5U/ μ L)2. 00
7DNA 模板(50ng/ μ L)1. 00滅菌超純水(H2O)15. 00總體積25. 00表2 PCR反應(yīng)程序
克隆測序PCR程序RFLP-PCR 程序循環(huán)次數(shù)95 °C預(yù)變性5 min95 °C預(yù)變性5 min94 變性30 s94 °C變性30 sJ> 35個循環(huán)57 退火30 s56.5 °C退火35 s72 延伸30 s72 °C延伸35 s72 °C延伸10 min72 °C延伸10 min6、PCR產(chǎn)物純化和測序PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示，可以清楚看到 931bp的條帶，說明目的基因克隆成功；然后進行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片 段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純 化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下 (1)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上 下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入70(^1^票洗液，1200017/1^11離心11^11，倒掉廢液，將吸附柱重 新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入50(^1^票洗液，1200017/1^11離心11^11，倒掉廢液，將離心吸附 柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C溫箱 數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫 緩沖液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步 馬聚7 ο
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把以上四個黃牛品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進行 雙向測序；黃牛KLF7基因的外顯子2及其側(cè)翼區(qū)931bp長度的片段的測序結(jié)果如SEQ ID NO. 1所示，序列當(dāng)中第1位的堿基相當(dāng)于KLF7基因第41297位。對測序峰圖進行分析，其中在同一位點有兩個不同峰是發(fā)生了單核苷酸突變；位 于黃牛的KLF7基因第41401、42025、42075位(分別相當(dāng)于SEQ IDN0. 1第105、729、779位) 出現(xiàn)單核苷酸突變，其多態(tài)性分別為C/T、T/C、A/G ；即篩查到黃牛KLF7基因的3個SNP多 態(tài)性。b、黃牛KLF7基因的外顯子2及其側(cè)翼區(qū)單核苷酸多態(tài)性的PCR-RFLP檢測(1)上述的3個SNP多態(tài)性的序列變化為當(dāng)?shù)?1401位點發(fā)生C > T突變時，即C突變?yōu)門，使原來的序列TCGG也相應(yīng)的突 變成TTGG ；當(dāng)?shù)?2025位點發(fā)生T > C突變時，即T突變?yōu)镃，使原來的序列TTGT也相應(yīng)的突 變成TCGT ；當(dāng)?shù)?2075位點發(fā)生A > G突變時，即A突變?yōu)镚，使原來的序列ACAA也相應(yīng)的突 變成ACGA ；(2)本發(fā)明對于上述3處SNP的檢測，通過PCR-RFLP檢測方法實現(xiàn)SNP的檢測，通 過定點錯配使得在3處SNP位點周圍的序列形成特定的序列TCGA，這樣就能夠通過限制性 內(nèi)切酶TaqI進行識別，具體為利用PCR克隆定點錯配技術(shù)，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第41403位由G 定點錯配為A，使原來的序列TCGG克隆為TCGA，成為限制性內(nèi)切酶TaqI能夠識別的序列， 當(dāng)?shù)?1401位點發(fā)生C > T突變時，克隆序列為TTGA，此時限制性內(nèi)切酶TaqI不能識別該 序列；如圖2所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上游引物、下游引物，通過下游引物的錯配 實現(xiàn)包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的tCgA為TaqI識別序列；本發(fā)明通過設(shè)計的引物對Pl來實現(xiàn)41403位的定點錯配，引物對Pl為上游引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c 21;下游弓丨物 Rl :aggaaacagt ccaagtcctc ate 23;以引物對Pl為引物，以黃?；蚪MDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增體系 和反應(yīng)條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切后的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成后EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果如圖3 所示泳道C1C1表示未突變的純合子，錯配克隆后的兩條染色體都能夠能被酶切識別，而切 除的24bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現(xiàn)為104bp的條帶；泳道C1T1表示發(fā)生突變的 雜合子，即錯配克隆后的其中的一條染色體發(fā)生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由于24bp 片段太小，所以表現(xiàn)為128bp、104bp的條帶；泳道T1T1表示發(fā)生突變的純合子，錯配克隆后 的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現(xiàn)為128bp的條帶。(3)利用PCR克隆定點錯配技術(shù)，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第42027位由 T定點錯配為A，使原來的序列TTGT克隆為TTGA，此時限制性內(nèi)切酶TaqI不能識別該序列， 而當(dāng)42025位點發(fā)生T > C突變時，克隆序列為TCGA，限制性內(nèi)切酶TaqI就能識別發(fā)生突 變的序列；如圖4所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上游引物、下游引物，通過下游引物的錯配實現(xiàn)包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的tTgA存在tCgA的多態(tài)性，當(dāng)發(fā)生突 變時，成為TaqI識別的序列；本發(fā)明通過設(shè)計的引物對P2來實現(xiàn)42027位的定點錯配，引物對P2為上游弓丨物 F2 :acggcacagt gacgttgaa19;下游弓丨物 R2 :gaacagagag aagcccttcc cccctc 26;以引物對P2為引物，以黃?；蚪MDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增體系 和反應(yīng)條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切后的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成后EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果如圖5 所示泳道C2C2表示突變的純合子，錯配克隆后的兩條染色體都不能夠能被酶切識別， 而切除的27bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現(xiàn)為310bp的條帶；泳道C2T2表示發(fā)生突 變的雜合子，即錯配克隆后的其中的一條染色體發(fā)生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由于 27bp片段太小，所以表現(xiàn)為337bp、310bp的條帶；泳道T2T2表示未發(fā)生突變的純合子，錯配 克隆后的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現(xiàn)為337bp的條帶。(4)利用PCR克隆定點錯配技術(shù)，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第42073位由 A定點錯配為T，使原來的序列ACAA克隆為TCAA，此時限制性內(nèi)切酶TaqI不能識別該序列， 當(dāng)?shù)?2075位點發(fā)生A > G突變時，克隆序列為TCGA，限制性內(nèi)切酶TaqI就能識別發(fā)生突 變的序列；如圖6所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上游引物、下游引物，通過上游引物的 錯配實現(xiàn)包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的TcAa為錯配的序列，存在TcGa的多 態(tài)性，當(dāng)發(fā)生突變時，成為TaqI識別的序列；本發(fā)明通過設(shè)計的引物對P3來實現(xiàn)42027位的定點錯配，引物對P3為上游弓丨物 F3 :ctgttccgag aagtggcatc catgccatc 29;下游弓I物 R3 :actacaccaa ggctggcact20。以引物對P3為引物，以黃牛基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增體系 和反應(yīng)條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切后的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成后EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果如圖7 所示泳道G3G3表示突變的純合子，錯配克隆后的兩條染色體都不能夠能被酶切識別， 而切除的28bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現(xiàn)為154bp的條帶。泳道A3G3表示發(fā)生突 變的雜合子，即錯配克隆后的其中的一條染色體發(fā)生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由于 28bp片段太小，所以表現(xiàn)為182bp、154bp的條帶；泳道A3A3表示未發(fā)生突變的純合子，錯配 克隆后的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現(xiàn)為182bp的條帶。(5)雖然931bp的克隆片段當(dāng)中在SEQ ID NO. 1的第151_154bp還存在一個TaqI 識別序列(TCGA)，但經(jīng)過對照試驗(同時檢測3個SNPs與分別檢測每個SNP之間對比分 析)，發(fā)現(xiàn)對照組與試驗組在SNP位點酶切后的電泳檢測片段大小結(jié)果完全一致。這樣就能 夠通過限制性內(nèi)切酶TaqI同時對3個SNPs進行識別，提高檢測效率；具體為以引物對P1、P2、P3等比例的混合物為引物，以黃?；蚪MDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增體系和反應(yīng)條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI 消化，將酶切后的擴增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ； 電泳完成后EB染色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 成像，顯示結(jié)果如圖8所示，根據(jù)電泳條帶的分布判定其基因型如表3所示表3根據(jù)電泳結(jié)果判定基因型
Pl檢測位點P2檢測位點P3檢測位點泳道^mml 電泳片段人小 基I大丨剛 ,、 (bp)基_電泳，段人小 (bp)電泳片段人小 (bp)泳道1C1C1 104/24T2T2337A3A3182泳道IIC1T1 128/104/24T2C2337/310/27A3G3182/154/28泳道IIIT1T1 128C2C2310/27G3G3154/28其中切除的24、27和28bp片段太小，電泳沒有顯示，所以泳道I表現(xiàn)為Pl檢測SNP 位點154bp (C1C1)的條帶，P2檢測SNP位點337bp (T2T2)的條帶，P3檢測SNP位點337bp (A3A3) 的條帶；泳道II表現(xiàn)為Pl檢測SNP位點128和ICMbp(C1T1)的條帶，P2檢測SNP位點337 和3IObp (T2C2)的條帶，P3檢測SNP位點182和154bp (A3G3)的條帶；泳道III表現(xiàn)為Pl 檢測SNP位點128bp (T1T1)的條帶，P2檢測SNP位點310bp (C2C2)的條帶，P3檢測SNP位點 154bp (G3G3)的條帶；根據(jù)條帶的數(shù)目和條帶的大小，圖8所示的凝膠電泳檢測結(jié)果能夠很清楚的判定 是否發(fā)生了點突變，將3個SNP位點的三種基因型區(qū)分開，從而檢測其SNP多態(tài)性。(6)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證利用ABI 377和ABI 3730測序儀對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進行正反雙向 測序，進行SNP位置分析；結(jié)果如圖9所示，在SNP位點處存在多態(tài)性，尤其是發(fā)生突變的雜 合子更為明顯，C1T1基因型Pl檢測SNP位點處、T2C2基因型P2檢測SNP處、A3G3基因型P3 檢測SNP位點處均為雙峰。c、黃牛KLF7基因的SNP作為分子標(biāo)記在不同黃牛群體中的應(yīng)用1、群體多態(tài)性中的診斷利用上述的SNP多態(tài)性檢測方法對秦川牛228份DNA樣品、南陽牛251份DNA樣 品、郟縣紅牛439份DNA樣品和中國荷斯坦奶牛84份DNA樣品分別進行SNP多態(tài)性的鑒定， 統(tǒng)計其SNP位點的基因型分布及其等位基因頻率，并對南陽牛的SNPs與生長性狀的進行關(guān) 聯(lián)分析。2、SNP位點的頻率統(tǒng)計分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位點的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式
可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群
體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基
11體不同多態(tài)位點的基因型分布、等位基因頻率的統(tǒng) 計分析結(jié)果如表4所示。3、群體平衡性檢驗?zāi)郴蛭稽c的Hardy-Weinberg平衡性檢測采用皮爾遜x 2統(tǒng)計量，其公式為 其中，m為某一遺傳位點基因型應(yīng)有個數(shù)；i為基因型序號A代表第i個基因型 的實際個體數(shù)量；η為樣本數(shù)量；Pi代表第i個基因型的理論頻率。等位基因在不同黃牛品種KLF7基因SNPs的基因型分布、等位基因頻率和連鎖不 平衡分析如表4所示，其中，除中國荷斯坦牛在Pl檢測SNP位點達(dá)到純合外，其它SNP位點 的等位基因頻率均大于1%，滿足SNP的要求。表4 四個牛群體不同多態(tài)位點的基因型分布、等位基因頻率利哈代溫伯格平衡
檢驗
位點(參考NCJ)07300)品種秦川牛南Pl I牛郟縣紅牛中國荷斯坦奶牛Pl檢測 SNP位點基閃型CC20315729884C41401TCT24821230TT112180等位基因C0.9430.7890.8191T0.0570.2110.1810平衡/檢驗P=O. 102/ =0.094尸=1.345--P2檢測 SNP位點基WMTTIU1192174T42025CTC1039917235CC14335045等位基閃T0.7130.6710.6900.256C0.2870.3290.3100.744平衡Z2檢驗/'=2.427尸=2.833/ =3.084P=O. 741P3檢測 SNP位點基閃項GG77941722A42075GGA13111520920AA20425862等位基閃G0.6250.6040.6300.143A0.3750.3960.3700.857平衡/檢驗P=\ 1.620P=0.455P=O. 194/ =0.063 由表4可以看出，在Pl檢測SNP位點只有中國荷斯坦奶牛處于哈代溫伯格不平衡 狀態(tài)，且只有C等位基因，說明中國荷斯坦奶牛在該位點已經(jīng)達(dá)到純合；在P2和P3位點， 4個牛群體均沒有偏離哈代溫伯格平衡狀態(tài)。這些結(jié)果表明也許由于長期對產(chǎn)奶性狀的選
12擇，中國荷斯坦奶牛在一些位點(如Pl位點)已經(jīng)達(dá)到純合狀態(tài)，而中國地方牛品種(如 秦川牛、南陽牛和郟縣紅牛)由于選育的程度低，雜合程度還比較高，也進一步說明中國地 方牛品種具有巨大的選種潛力。4、南陽?；蛐?yīng)的關(guān)聯(lián)分析生產(chǎn)數(shù)據(jù)南陽牛在不同生長階段(6、12、18和24月齡)的生長性狀初生重、體 重、日增重、體高、體長、胸圍和坐骨端寬關(guān)聯(lián)分析樣本有完整生長性狀記錄的南陽牛251個。關(guān)聯(lián)分析模型利用SPSS(13.0)軟件分析品種、年齡、場和基因位點等因素與經(jīng)濟性狀的相關(guān) 性。先對數(shù)據(jù)進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù) 數(shù)據(jù)特征，利用t分析、ANOVA或多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響初生重、成年體重等生長發(fā)育指標(biāo)的因素不同，考慮到場 效應(yīng)(Farm)、品種效應(yīng)(Breed)、種公畜效應(yīng)(S)、種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)(SD)、年齡(Age)和 性別效應(yīng)(Sex)、基因型效應(yīng)(Genotype)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用了以下固定模型進行分 析，同時，根據(jù)實際情況進行取舍。完整模型如下yiJklmnpq = μ +Farmi+Breedj+Sp+SD^Age.+SeXi+Genotype^+eij^p,其中yijklmnM 個體表型記錄；μ 總體均值；Farmi 場別效應(yīng)；Breedj 品種效應(yīng)； Sp 種公畜效應(yīng)；SDq 種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)；Agek 年齡效應(yīng)；Sex1 性別效應(yīng)；Genotypem 標(biāo)記基因型效應(yīng)；Χη為各種二級和二級以上互作效應(yīng)，如FarmXBreed，F(xiàn)armXAge, FarmX Sex, FarmXGenotype, BreedX Age, BreedX Sex, BreedXGenotype, Age X Sex, AgeXGenotype, SexXGenotype, BreedXAgeXGenogype 等；eiJkln]npq 隨機誤差；運用 SPSS (13. 0)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型間生產(chǎn)性狀 指標(biāo)進行差異顯著性檢驗。分析結(jié)果如表5所示表5 KLF7基因3個位點基因型與南陽牛生長性狀的相關(guān)分析 注BW=體重(kg) ；ADG =日增重(kg) ；BL =體長(cm) ；HG =胸圍(cm)；冊=坐 骨端寬(cm)。同一行的肩標(biāo)代表顯著水平P < 0. 01 (A，B)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，KLF7基因與南陽牛早期生長性狀(6月齡和12月齡)顯著相關(guān)。 特別是在6月齡，攜帶基因型T2T2的牛比基因型T2C2的牛具有更大的日增重(P = 0. 009) 和胸圍(P = 0. 009)。在12月齡，基因型C2C2的牛比基因型T2C2的牛具有更大的體重(P = 0. 008)、體長(P = 0. 001)和胸圍(P = 0. 003)；基因型A3A3的牛比基因型A3G3的牛具有更大的體長(P = 0.006)。其它生長性狀數(shù)據(jù)與基因型間無顯著相關(guān)。這表明所檢測的KLF7 基因SNPs中，雜合子(T2C2和A3G3)的生長性狀較純合子(T2T2、C2C2和A3A3)差，P2和P3尤 其是P2檢測SNP位點可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括以下步驟以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3等摩爾比的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內(nèi)切酶TaqI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛KLF7基因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P1為上游引物F1tgcttctgat ggctgtttct c；下游引物R1aggaaacagt ccaagtcctc atc；所述的引物對P2為上游引物F2acggcacagt gacgttgaa；下游引物R2gaacagagag aagcccttcc cccctc；所述的引物對P3為上游引物F3ctgttccgag aagtggcatc catgccatc；下游引物R3actacaccaa ggctggcact。
2.如權(quán)利要求1所述的一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于， 所述的PCR擴增反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s, 57. 0°C退火35s，72°C延伸 35s, 30 35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于， 所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，根 據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛KLF7基因的單核苷酸多態(tài)性為第41401位的多態(tài)性為=C1C1基因型表現(xiàn)為104和24bp條帶，C1T1基因型表現(xiàn)為128、 104和24bp條帶，T1T1基因型表現(xiàn)為128bp條帶；第42025位的多態(tài)性為=T2T2基因型表現(xiàn)為337bp條帶，T2C2基因型表現(xiàn)為337、310和 27bp條帶，C2C2基因型表現(xiàn)為310和27bp條帶；第42075位的多態(tài)性為=A3A3基因型表現(xiàn)為182bp條帶，A3G3基因型表現(xiàn)為182、154和 28bp條帶，G3G3基因型表現(xiàn)為154和28bp條帶。全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3等摩爾比的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內(nèi)切酶TaqI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛KLF7基因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明對KLF7基因的SNPs進行了基因分型和基因頻率分析，以及與南陽牛不同生長階段的生長性狀之間進行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明KLF7基因尤其是P2檢測SNP位點可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101899500SQ201010108118
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者李轉(zhuǎn)見, 淮永濤, 王景, 胡沈榮, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 雷初朝, 馬亮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)