專利名稱：鑒別小麥紅粒和白粒的分子標(biāo)記技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種利用SSR分子標(biāo)記，區(qū)分小麥紅粒和白粒的技術(shù)，屬于農(nóng)業(yè)生物技 術(shù)工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥籽粒顏色是影響面粉質(zhì)量和產(chǎn)量的重要性狀，在磨粉過程中，紅粒小麥影響 面粉的亮度(Flintham，2000 ;Warner et al. ， 2000 ;Himi et al. ， 2002)，世界上各個(gè)國家 的農(nóng)民都喜歡種植白粒小麥品種。小麥籽粒顏色分別被小麥3A、3B、3D染色體長臂的紅粒 基因(R-A1、R-B1、R-D1)控制，紅?；蚨际秋@性遺傳，具有加性效應(yīng)，3個(gè)隱性位點(diǎn)純和才 能表現(xiàn)白粒，且粒色的表現(xiàn)受環(huán)境影響，這就使用肉眼選擇白粒具有一定難度，而且白粒選 擇只能在種子收獲后進(jìn)行，周期長。 人工合成小麥由四倍體小麥和二倍體節(jié)節(jié)麥人工合成，蘊(yùn)藏著豐富的優(yōu)良基因， 也攜帶一些不利基因，紅粒性狀就是限制育種家利用人工合成小麥的重要因素。人工合 成小麥衍生品種川麥42高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗條銹，已經(jīng)成為小麥高產(chǎn)、抗條銹育種的重要基因 源。然而，由于紅粒性狀的影響，限制了川麥42的使用。因此，利用容易選擇的、快速有效 的方法，使川麥42由紅粒到白粒的轉(zhuǎn)變是非常有意義的。分子標(biāo)記輔助選擇白粒基因，可 以在苗期的時(shí)候進(jìn)行選擇，且不受環(huán)境影響，更快速、更容易、更準(zhǔn)確。到目前為止，R-A1、 R-B1、 R-D1基因已經(jīng)利用普通小麥通過RFLP、 STS、 EST和SSR分子標(biāo)記作圖(Flintham andH卿hrey， 1993 ;Gale et al. ， 1995 ;Nalam et al. ， 2006 ;Kuraparthy et al. ，2008， Sherman et al. ，2008)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)白粒小麥品種使用肉眼選擇難度大，且只能在種子收獲后進(jìn)行，周期長的問 題，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別小麥紅粒和白粒的分子標(biāo)記技術(shù)，利用SSR分子標(biāo)記， 對(duì)人工合成小麥衍生品種川麥42攜帶的紅?；蜻M(jìn)行作圖，以期為用人工合成小麥和川 麥42作為基因資源的白粒小麥品種的選育提供快速、有效的分子標(biāo)記。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案 本發(fā)明利用人工合成小麥衍生品種紅粒小麥川麥42和四川栽培白粒小麥川W565 雜交，構(gòu)建&群體用于紅?；虻倪z傳分析。川麥42、川W565、巳、&單株種植在成都試驗(yàn) 田。1015個(gè)&植株被收獲用于鑒定籽粒顏色和川麥42紅?；虻倪z傳分析，其中，&群體 中241個(gè)白粒單株被選出，構(gòu)建F2—3家系，用于驗(yàn)證&的結(jié)果。 (l)DNA提取和SSR標(biāo)記苗期取雙親、F2和F2-3幼嫩葉片，利用CTAB法提取DNA ; 選用小麥3D長臂上SSR引物篩選雙親川麥42和川W565的遺傳差異；
PCR反應(yīng)條件、擴(kuò)增體系如下15ul體系 1XPCR緩沖液，模板1.5ul，鎂離子濃度1.5mM， dNTP濃度0. 2mM，引物濃度為 0. 2uM， rTaq酶1U，加無菌去離子水或ddH20水至15ul。
PCR程序?yàn)?br> 1)94"預(yù)變性5min 2)降落PCR程序共11個(gè)循環(huán)每一循環(huán)降低1°C 94。C，45秒 65。C，45秒 72。C，45秒 3)常規(guī)PCR程序30個(gè)循環(huán) 94。C，45秒 55。C，45秒 72。C，45秒 4)最后一部擴(kuò)增72°C ， 10min 電泳檢測聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%，其中，丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺=39 : l，每個(gè)點(diǎn)樣孔內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為5-8ul。 220V恒壓條件下預(yù)電泳20min后400V恒壓條件下電泳lh后O. 1%硝酸銀染色10分鐘，2%的化011和1.5%甲醛顯影至條帶出現(xiàn)，最后照相保存； (2)性狀鑒定小麥完全成熟時(shí)，收獲Fl種子、F2單株和F2-3家系，每一株系取
30-40粒種子放在5% NaOH溶液里浸泡過夜，肉眼鑒定籽粒顏色，種子為黑紅色的是紅粒，
為稻草黃色的是白粒； (3)遺傳距離計(jì)算和連鎖圖構(gòu)建 利用雙親具有多態(tài)性的引物掃描F2群體中白粒單株，結(jié)合鑒定籽粒顏色的結(jié)果，通過卡方檢驗(yàn)估算&群體觀察值和預(yù)期值間分離比的適合度。遺傳距離的估算用M即maker3. 0計(jì)算標(biāo)記與抗病基因之間的遺傳距離(Lincoln etal， 1992)，用Kosambi功能計(jì)算圖距(Kosambi， 1944) ， LOD值為3. O，用M即draw繪制遺傳圖譜(Liu， Meng，2003)。
(4)結(jié)果 1)根據(jù)籽粒顏色鑒定，川麥42紅?；騌-D1是顯性遺傳的，1015個(gè)F2植株中有774株紅粒、241株白粒，分離比為3 : 1，表明川麥42攜帶的紅?；蚴軉位蚩刂?；
2)8個(gè)3D染色體長臂上的SSR引物被用于掃描F2群體中241個(gè)隱性單株，根據(jù)241個(gè)隱性單株SSR基因型和籽粒顏色的表型，構(gòu)建連鎖圖，5個(gè)SSR引物和紅?；騌-D1緊密連鎖，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314兩個(gè)SSR標(biāo)記之間，遺傳距離分別是2. 1、2. 5CM。
本發(fā)明使用的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)體系為常規(guī)PCR體系，電泳和染色都用普通儀器和試劑，不需要任何特殊的儀器和特殊的試劑，任何公司的生產(chǎn)的PCR反應(yīng)儀、電泳槽和電泳儀，任何生物試劑公司生產(chǎn)的試劑均可使用而達(dá)到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明篩選出兩個(gè)SSR引物Xgwm3和Xgwm314，位于紅?；騌-D1的兩側(cè)，遺傳距離分別是2. 1、2.5CM。本發(fā)明試驗(yàn)過程中不需要任何特殊的儀器和試劑，試驗(yàn)方便、價(jià)格便宜。用這兩個(gè)引物輔助選擇紅?；?，從而更快速、準(zhǔn)確、有效的選擇白粒品種、淘汰紅粒品種，加快了白粒小麥育種進(jìn)程。


圖1是本發(fā)明技術(shù)路線圖
圖2是SSR引物Xgwm3，Xgwm314，Xwmc552，Xbarc270檢測川麥42、川W565和川麥42親本即人工合成小麥Syn769多態(tài)性差異的電泳圖。 圖2中1為川麥42親本即人工合成小麥Syn769，2為川麥42，3為川W565。 圖3是SSR引物Xgwm3掃描川麥42/川W565 F2群體的電泳圖。 圖4是SSR引物Xgwm314掃描川麥42/川W565F2群體的電泳圖。 圖5是川麥42紅粒基因R-D1的連鎖圖。圖的右邊是引物名稱，圖的左邊是遺傳
足巨離(Kosambi， CM)。
具體實(shí)施例方式( — )試驗(yàn)材料 人工合成小麥衍生品種紅粒小麥川麥42和四川栽培白粒小麥川W565，及其川麥
42/川W565F2群體(1015個(gè))和F2-3家系。川麥42、川W565、 Fl、 F2群體和F2-3家系種
植于成都試驗(yàn)田。
( 二 )性狀鑒定 小麥完全成熟時(shí)，收獲Fl種子、F2單株和F2-3家系，每一株系取30_40粒種子放在5% NaOH溶液里浸泡過夜，肉眼鑒定籽粒顏色，種子為黑紅色的是紅粒，為稻草黃色的是白粒。 (三)DNA提取和SSR標(biāo)記 苗期取雙親、F2和F2-3幼嫩葉片，利用CTAB法提取DNA。選用小麥3D染色體長臂上SSR引物篩選雙親川麥42和川W565的遺傳差異。
PCR反應(yīng)條件、擴(kuò)增體系如下(15ul體系) 1XPCR緩沖液，模板1.5ul，鎂離子濃度1.5mM， dNTP濃度0. 2mM，引物濃度為0. 2uM， rTaq酶1U，加無菌去離子水或ddH20水至15ul。
PCR程序?yàn)?br> 1)94。C預(yù)變性5min 2)降落PCR程序共11個(gè)循環(huán)每一循環(huán)降低1°C 94。C，45秒 65。C，45秒 72。C，45秒 3)常規(guī)PCR程序30個(gè)循環(huán) 94。C，45秒 55。C，45秒 72。C，45秒 4)最后一步擴(kuò)增72。C，10min 電泳檢測聚丙烯酰胺凝膠濃度為6% (丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺=39 : 1)，每個(gè)點(diǎn)樣孔內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為5-8ul。 220V恒壓條件下預(yù)電泳20min后400V恒壓條件下電泳lh后O. 1%硝酸銀染色10分鐘，2X的NaOH和1. 5%甲醛顯影至條帶出現(xiàn)，最后照相保存。(四)遺傳距離計(jì)算和連鎖圖構(gòu)建
利用雙親具有多態(tài)性的引物掃描F2群體中白粒單株，結(jié)合鑒定籽粒顏色的結(jié)果，通過卡方檢驗(yàn)估算F2群體觀察值和預(yù)期值間分離比的適合度。用M即maker3. 0計(jì)算標(biāo)記與抗病基因之間的遺傳距離(Lincoln et al， 1992)，用Kosambi功能計(jì)算圖距(Kosambi，1944) ， L0D值為3. O，用M即draw繪制遺傳圖譜(Liu， Meng，2003)。
(五)結(jié)果 1、根據(jù)籽粒顏色鑒定，川麥42紅?；騌-D1是顯性遺傳的，1015個(gè)F2植株中有774株紅粒、241株白粒，分離比為3 : 1，表明川麥42攜帶的紅?；蚴軉位蚩刂啤?br> 2、8個(gè)3D長臂上的SSR引物被用于掃描F2群體中241個(gè)隱性單株(白粒)，根據(jù)241個(gè)隱性單株SSR基因型(如表1)和籽粒顏色的表型，構(gòu)建連鎖圖。5個(gè)SSR引物和紅?；騌-D1緊密連鎖，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314兩個(gè)SSR標(biāo)記之間，遺傳距離分別是2. 1、2. 5CM(如圖5所示)。 表1.用5個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)F2群體的241個(gè)隱性單株的紅?；騌-D1連鎖分析結(jié)果
SSR makerNo. of plantsABHC
Xgwm3-3D241123280
Xgwm314-3D241323260
Xwmc552匿3D2418216170
Xgwm664-3D2419201301
Xbarc270-3D2415226100 注A.川麥42純和基因型；B.川W565純和基因型；H.雜合類型；C.變異類型。
3、川麥42紅?；騺碓从谌斯ず铣尚←湺扼w親本節(jié)節(jié)麥。
權(quán)利要求
一種鑒別川麥42紅粒和白粒的分子標(biāo)記技術(shù)，利用人工合成小麥衍生品種紅粒小麥川麥42和四川栽培白粒小麥川W565雜交，構(gòu)建F2群體用于紅?；虻倪z傳分析，1015個(gè)F2植株被收獲用于鑒定籽粒顏色和川麥42紅?；虻倪z傳分析與分子標(biāo)記，其中，F(xiàn)2群體中241個(gè)白粒單株被選出，構(gòu)建F2-3家系，用于驗(yàn)證F2的結(jié)果；其特征在于該分子標(biāo)記技術(shù)具體步驟如下(1)DNA提取和SSR標(biāo)記苗期取雙親、F2和F2-3幼嫩葉片，利用CTAB法提取DNA；選用小麥3D染色體長臂上SSR引物篩選雙親川麥42和川W565的遺傳差異；PCR反應(yīng)條件、擴(kuò)增體系如下15ul體系1×PCR緩沖液，模板1.5ul，鎂離子濃度1.5mM，dNTP濃度0.2mM，引物濃度為0.2uM，rTaq酶1U，加無菌去離子水或ddH2O水至15ul；PCR程序?yàn)?)94℃預(yù)變性5min2)降落PCR程序共11個(gè)循環(huán)每一循環(huán)降低1℃94℃，45秒65℃，45秒72℃，45秒3)常規(guī)PCR程序30個(gè)循環(huán)94℃，45秒55℃，45秒72℃，45秒4)最后一步擴(kuò)增72℃，10min電泳檢測聚丙烯酰胺凝膠濃度為6％，其中，丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺＝39∶1，每個(gè)點(diǎn)樣孔內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為5-8ul，220V恒壓條件下預(yù)電泳20min后400V恒壓條件下電泳1h后0.1％硝酸銀染色10分鐘，2％的NaOH和1.5％甲醛顯影至條帶出現(xiàn)，最后照相保存；(2)性狀鑒定小麥完全成熟時(shí)，收獲F1種子、F2單株和F2-3家系種子，每一株系取30-40粒種子放在5％NaOH溶液里浸泡過夜，肉眼鑒定籽粒顏色，種子為黑紅色的是紅粒，為稻草黃色的是白粒；(3)遺傳距離計(jì)算和連鎖圖構(gòu)建利用雙親具有多態(tài)性的引物掃描F2群體中白粒單株，結(jié)合鑒定籽粒顏色的結(jié)果，通過卡方檢驗(yàn)估算F2群體觀察值和預(yù)期值間分離比的適合度，用Mapmaker3.0計(jì)算標(biāo)記與抗病基因之間的遺傳距離，用Kosambi功能計(jì)算圖距，LOD值為3.0，用Mapdraw繪制遺傳圖譜；(4)結(jié)果1)根據(jù)籽粒顏色鑒定，川麥42紅?；騌-D1是顯性遺傳的，1015個(gè)F2植株中有774株紅粒、241株白粒，分離比為3∶1，表明川麥42攜帶的紅粒基因受單基因控制；2)8個(gè)3D染色體長臂上的SSR引物被用于掃描F2群體中241個(gè)隱性單株，根據(jù)241個(gè)隱性單株SSR基因型和籽粒顏色的表型，構(gòu)建連鎖圖，5個(gè)SSR引物和紅?；騌-D1緊密連鎖，R-D1基因位于Xgwm3和Xgwm314兩個(gè)SSR標(biāo)記之間，遺傳距離分別是2.1、2.5CM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別小麥紅粒和白粒的分子標(biāo)記技術(shù)，利用人工合成小麥衍生品種紅粒小麥川麥42和四川栽培白粒小麥川W565雜交，構(gòu)建F2群體用于紅?；虻倪z傳分析，1015個(gè)F2植株被收獲用于鑒定籽粒顏色和川麥42紅?；虻倪z傳分析與分子標(biāo)記，其中，F(xiàn)2群體中241個(gè)白粒單株被選出，構(gòu)建F2-3家系，用于驗(yàn)證F2的結(jié)果；本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記，對(duì)人工合成小麥衍生品種川麥42攜帶的紅粒基因進(jìn)行作圖，從而更快速、準(zhǔn)確、有效的選擇白粒品種、淘汰紅粒品種，加快了白粒小麥育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760556SQ20101010786
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者李俊, 楊武云, 胡曉蓉 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所