專利名稱：從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)獲取生物質轉化相關基因的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和微生物領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種從厭氧發(fā)酵系統(tǒng) 獲取生物質轉化相關基因的方法。
背景技術：
在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的生物質轉化過程中，主要存在著四個階段第一階段為水解階 段，發(fā)酵原料中以木質纖維素為主的大分子有機物被水解為各自的單體物質；第二階段為 酸化階段，單體物質再進一步降解為揮發(fā)性脂肪酸；第三階段為產乙酸階段，第四階段為產 甲烷階段。這四個不同的階段需要不同微生物類群的參與，這些微生物類群分別具有與其 功能相對應的從纖維素分解到甲烷產生過程中關鍵酶的基因，包括與木質纖維素水解、產 氫產酸及甲烷形成相關的基因資源。這些基因和酶在生物能源、食品、造紙、飼料、紡織、發(fā) 酵、環(huán)境和醫(yī)藥等多個領域具有廣泛的應用價值，將成為一種豐富的尚待挖掘的基因資源。獲得環(huán)境微生物的酶或其功能基因的傳統(tǒng)方法，首先需要從環(huán)境中分離純化目標 微生物。但是，由于目前自然界中大部分的微生物的分離培養(yǎng)條件尚不清楚，分離培養(yǎng)純菌 既耗時而且有多數情況下并不能獲得目標微生物。所以，對大多數環(huán)境微生物而言，盡管知 道它們的存在，也了解它們的部分生理功能，但卻無法獲得它們的純培養(yǎng)物，特別是厭氧發(fā) 酵體系中，有90%以上的微生物不僅沒有純培養(yǎng)物，而且對它們的系統(tǒng)進化或分類地位也 缺少相應的信息。對這些未培養(yǎng)微生物酶資源或基因資源的挖掘，已經無法采用傳統(tǒng)的依 賴于純培養(yǎng)的微生物學技術。近幾年發(fā)展起來的元基因組學(metagenomics)技術，繞開分離培養(yǎng)，通過直接從 環(huán)境中抽提微生物核酸并構建元基因組文庫(BAC，R)smid、C0smid或者質粒文庫)，通過功 能篩選或同源序列篩選，獲得具有某種表型或序列的陽性克隆，經過對陽性克隆的序列分 析，獲得功能基因或基因簇，從而有可能獲得大量的新基因。但是，如何選擇適當的環(huán)境微 生物系統(tǒng)來滿足不同目的功能基因的篩選，如何高效率地從復雜體系中分離提純DNA，如何 建立高通量的篩選體系以及對陽性克隆的低成本、高效的序列分析方法，仍是利用元基因 組技術開發(fā)新基因資源需要解決的關鍵問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種從厭氧微生物群落篩選生物質轉化相關基因的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種從厭氧微生物群落篩選生物質轉化相關基因的方 法，所述方法包括(1)從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉 染入細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克??；(2)從步驟(1)獲得的細胞克隆中篩選具有生物質轉化性狀的細胞克隆，所述克 隆中攜帶生物質轉化相關基因；和(3)鑒定或分離步驟( 獲得的具有生物質轉化性狀的克隆中生物質轉化相關基因。在一個優(yōu)選例中，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物質的工農業(yè)生產廢 棄物(如秸稈、玉米芯等)或畜牧養(yǎng)殖產生的家畜糞便經過產氫、產甲烷或堆肥產生的微生 物群落。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的載體選自Josmid載體或者Cosmid載體；或在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，收集的DNA片段的長度是30_551Λ(較佳地 36-48kb)。在另一優(yōu)選例中，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15_40 分鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質，獲得 上清；和(b)從上清提取DNA。在另一優(yōu)選例中，蛋白酶K的終濃度是1 士0. 2mg/ml ；SDS的終濃度是1 士0. 2mg/ ml ο在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，在55 士 1°C孵育18-22分鐘，接著在70 士 1°C孵育 9-11分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質的方法是將裂解液 于17000 士 2000g (優(yōu)選17000 士 IOOOg ；更優(yōu)選17000g)下離心8-12分鐘(優(yōu)選10分鐘)。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比 25 24 1)抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比M 1)抽提上清；接著 用異丙醇(優(yōu)選0. 6倍體積)在MOO 士 500g下離心沉淀DNA。在另一優(yōu)選例中，在裂解微生物細胞前，還包括采用差速離心法去除厭氧微生物 群落中的粗顆?；蚍羌毎镔|。在另一優(yōu)選例中，所述的生物質轉化相關基因選自(但不限于)內切葡聚糖酶基 因，內切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或所述的生物質轉化性狀選自(但不限于)對應于內切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現黃色水 解圈；對應于內切木聚糖酶水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經剛果紅染色呈現黃色水解圈；對應于葡萄糖苷酶水解培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈 現黑色水解圈；對應于外切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮-β -D-纖維二糖，在紫外光 激發(fā)下呈現熒光水解圈。在另一優(yōu)選例中，步驟C3)包括對生物質轉化相關基因進行測序，測序的方法包 括(i)選取2-100個(如3個、5個、10個、20個、50個)具有生物質轉化性狀的細胞
克隆分別進行培養(yǎng)，將獲得的細胞培養(yǎng)物混合，獲得混合的細胞體系；和(ii)從所述混合的細胞體系中提取DNA，測序。在另一優(yōu)選例中，步驟(i)中，分別進行培養(yǎng)時，將細胞克隆培養(yǎng)到基本上相同的細胞數(0D值)，再將各細胞培養(yǎng)物混合。在另一優(yōu)選例中，采用4M高通量測序法進行測序。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(iii)將DNA測序結果與現有的基因序列數據庫進 行比對，找出新的生物質轉化相關基因。更優(yōu)選地，所述DNA編碼的蛋白序列與現有的DNA編碼的蛋白相似性小于90% (更佳地小于85% )，則所述生物質轉化相關基因為新基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種從厭氧微生物群落提取DNA的方法，所述方法包 括(al)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15_40 分鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質，獲得 上清；和(bl)從上清提取DNA。在一個優(yōu)選例中，步驟(al)中，在55士 1°C孵育18_22分鐘，接著在70士 1°C孵育 9-11分鐘。在另一優(yōu)選例中，步驟(al)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質的方法是將裂解 液于17000士2000g (優(yōu)選17000士 IOOOg ；更優(yōu)選17000g)下離心8_12分鐘(優(yōu)選10分 鐘)。在另一優(yōu)選例中，步驟(bl)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比 25 24 1)抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇(優(yōu)選按照體積比M 1)抽提上清；接著 用異丙醇(優(yōu)選0. 6倍體積)在MOO 士 500g下離心沉淀DNA。在另一優(yōu)選例中，在裂解微生物細胞前，還包括采用差速離心法去除厭氧微生物 群落中的粗顆粒或非細胞物質。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了篩選到的呈現黃色水解圈(箭頭所示)的內切葡聚糖酶陽性克隆。圖2顯示了篩選到的呈現黃色水解圈(箭頭所示)的內切木聚糖酶陽性克隆。圖3顯示了篩選到的呈現黑色水解圈(箭頭所示)的β -葡萄糖苷酶。圖4顯示了篩選到的紫外光激發(fā)下呈現熒光水解圈(箭頭所示)的外切葡聚糖酶 陽性克隆。圖5顯示了本發(fā)明的方法(泳道1)和現有技術方法(泳道2)提取的基因組DNA 的脈沖場凝膠電泳的結果，其中泳道M為Lamda mix DNA Marker。
具體實施例方式本發(fā)明人經過深入的研究，首次優(yōu)化了一種從厭氧微生物群落篩選生物質轉化相 關基因的方法。本發(fā)明建立了從厭氧發(fā)酵群落的未培養(yǎng)微生物中直接篩選與能源轉化相關 酶的基因資源的方法，并且針對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落復雜的特點，優(yōu)化了 DNA提取 技術和序列測定技術。本發(fā)明可以從厭氧發(fā)酵微生物群落中高通量、高效率地篩選獲得大量的與生物轉化相關的新基因，解決了厭氧發(fā)酵群落中多數微生物不能被培養(yǎng)，而難以對 其基因資源進行挖掘利用的難題，還有效地提高了篩選效率和準確性。微生物群落本領域人員均了解，由于環(huán)境微生物的共生性和復雜性，在非純培養(yǎng)的條件下， 不一定存在100%均為厭氧微生物的微生物群落，因此本發(fā)明中所述的“厭氧微生物群 落”的概念是相對的。本發(fā)明人將所述的“厭氧微生物群落”定義為厭氧微生物占微 生物總數的70%以上，較佳地為80%以上的微生物群落。所述的厭氧微生物群落是由 多種菌群構成的集合體，其中含有的厭氧微生物沒有特別的限制，代表性的微生物例如 (但不限于)熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)，解纖維素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)，溶纖維素擬桿菌 (Bacteroides cellulosolvens)(Cytophaga hutchinsonii),^
胞菌(Syntrophomonas wolfei), Methanoculleus bourgensis 等。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物質的工 農業(yè)生產廢棄物或畜牧養(yǎng)殖產生的家畜糞便經過產氫、產甲烷或堆肥產生的微生物群落。 所述的工農業(yè)生產廢棄物如秸稈、玉米芯等。DNA的提取本發(fā)明的方法中，直接從厭氧微生物群落中提取基因組DNA，而不是從微生物的純 培養(yǎng)物中提取基因組DNA，如何獲得盡可能完整的、有利于后續(xù)連接、轉染的基因組DNA是 較為關鍵的。因此，本發(fā)明人進行了深入的研究，優(yōu)化了 DNA提取的技術。DNA提取的常規(guī)步驟通常包括分離細胞，細胞破碎(或裂解)，離心獲取含有DNA 的上清，有機溶劑抽提DNA。本發(fā)明人對于這些步驟進行了優(yōu)化，特別是對于細胞裂解以及 粗裂解液的處理進行了優(yōu)化。微生物細胞的裂解直接關系到最終得到的DNA的多少以及完整性，如果裂解條件 太劇烈則無法得到完整的大片段，而如果裂解條件太溫和又不能完全裂解細胞從而影響后 續(xù)提取結果。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細 胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C、更佳地為55士 1°C孵育15-40分鐘、更 佳地為18-22分鐘；接著在70士2°C、更佳地為70士 1°C孵育8_12分鐘、更佳地為9_11分 鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質，獲得上清；和(b)從上清提取DNA。本發(fā) 明優(yōu)化后的條件實現了在有效裂解的基礎上得到較為完整的DNA大片段，從而有利于高效 地、準確地篩選得到目的基因。并且，本發(fā)明分別在兩種溫度(在55士2°C，70士2°C)條件 下分別進行孵育，在裂解時間上比現有技術中的常規(guī)裂解時間(一般需要2小時以上)大 大縮短。蛋白酶K和SDS的濃度優(yōu)選1 士0. 3mg/ml ；更佳地為1 士0. lmg/ml。進一步優(yōu)選地，以上步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質的方法是將裂解 液于17000士2000g，較佳地17000士 lOOOg，更佳地17000g下離心8_12分鐘，更佳地為10 分鐘?；蛘?，以上步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇抽提上清；接著采用氯仿、異戊醇 抽提上清；接著用異丙醇在M00士500g下離心沉淀DNA。所述離心的條件有利于盡可能地 去除雜質而保留下完整的DNA。提取DNA的其它方面的技術是本領域人員已知的，在未特殊說明的情況下，可以 參照現有技術的常規(guī)方法。例如，在裂解微生物細胞前，通常還會包括去除非細胞物質或粗
7顆粒的步驟；在獲得DNA沉淀后，通常還包括將DNA溶解的步驟，溶解DNA通常采用TE溶 液。優(yōu)選地，本發(fā)明采用差速離心法去除厭氧微生物群落中的粗顆粒或非細胞物質。文庫的構建在獲得了基因組DNA后，對基因組DNA進行切割，從而獲得適當大小的DNA片段。 將DNA片段連接到適當的噬菌體載體上，進行包裝和轉染，從而構建獲得供篩選的文庫。除 非另外說明，文庫的構建采用本領域人員已知的材料和技術。所述的克隆載體可以選自 Fosmid載體或者Cosmid載體等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用R)smid載體構建R)smid文庫。構建方法主要包括 將基因組DNA進行切割處理，對DNA片段進行末端平滑磷酸化處理；電泳回收長度適合于 連接到R)smid載體的DNA片段；將回收的片段連接到R)smid載體上；包裝；轉染感受態(tài)細 胞；獲得攜帶所述各DNA片段的細胞克隆，形成R)smid文庫。連接、包裝、轉染的方法均是 本領域技術人員已知的，并且可以采用商品化的材料。功能鑒定獲得了攜帶所述DNA片段的細胞克隆后，根據所需篩選的基因所編碼的蛋白的生 物質轉化特性來篩選具有特定性狀的細胞克隆。所述的基因例如(但不限于)內切葡聚糖 酶基因，內切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因。這些基因所編碼的 酶蛋白均有明確的水解特性，水解特定的底物并在特定的染色劑存在下發(fā)生顯色反應。其 中，內切葡聚糖酶可水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現黃色水解圈；內切木 聚糖酶可水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經剛果紅染色呈現黃色水解圈；β -葡萄糖苷酶可水解 培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈現黑色水解圈；外切葡聚糖酶可水解培 養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮- β -D-纖維二糖，在紫外光激發(fā)下呈現熒光水解圈。對于篩選獲得的具有特定性狀的細胞克隆，提取其中的DNA進行測序，從而獲得 功能基因相關的序列信息。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，選取2-100個具有生物質轉化性狀的細胞克隆分別進行 培養(yǎng)，將獲得的培養(yǎng)物混合，獲得混合的細胞體系；從所述混合的細胞體系中提取DNA，測 序。為了獲得更好的測序結果，提取的混合DNA中來自每個細胞克隆的DNA的比例需要保 持基本上一致，現有技術中為了達到這個目的通常是將每個克隆分開來抽提DNA，然后再等 比例混合DNA，但是這樣的做需要同時提取多個克隆的DNA，非常繁瑣而且大幅增加DNA提 取消耗的試劑盒成本。而如果將所有的陽性克隆先混合培養(yǎng)再抽提DNA，那個因為每個陽性 克隆的生長速度不一致，那么那些生長緩慢的克隆的DNA在混合DNA中的比例就會偏低，這 樣對于測序來說是不利的。因此本發(fā)明進行了優(yōu)化，通過先分別培養(yǎng)細胞克隆，然后按照相 同或相近的細胞數量(數目)來混合不同的細胞克隆，最后再抽提混合DNA，這樣做可以保 證提取的混合DNA中來自每個細胞克隆的DNA的比例盡可能地保持了一致，而且通量高成 本低。對多個細胞克隆進行混合測序，有利于提高檢測的效率，實現高通量測序，從而降低 檢測成本。優(yōu)選地，采用4Μ高通量測序法進行測序。如本文所用，“基本上相同”的細胞數目是指各個細胞克隆在被分別培養(yǎng)后，達到 屬于相同或接近的細胞數目，例如細胞克隆1的細胞數目是ι χ IO9,細胞克隆2的細胞數目 是1.2Χ109，也可以認為達到了數目的基本上相同。本領域人員均了解，細胞個體是細微的 且動態(tài)的，無法控制不同細胞培養(yǎng)物中細胞數目達到絕對的相同。可以通過一些現有的檢測手段來控制細胞數目基本上相同，較佳地是測量細胞培養(yǎng)物的OD值，調節(jié)細胞培養(yǎng)物的 OD值相同或相近?？蓪NA測序結果與現有的基因序列數據庫進行比對，從而鑒定出新的生物質轉 化相關基因。作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明所述的方法包括(1)從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)出發(fā)， 特別是從秸桿厭氧發(fā)酵系統(tǒng)出發(fā)，提取并純化30-481Λ的元基因組DNA，經過連接、包裝和 轉染建立R)smid元基因組文庫；( 利用水解圈顯色法篩選該R)smid文庫中具有生物質 轉化相關的酶如內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和內切木聚糖酶等的陽性克 ??；(3)篩選到的陽性克隆等比例混合后提取R)Smid DNA后采用妨4測序法測序，將編碼 相應的酶的基因與現有的數據庫進行比對，鑒定是否為與已報道基因編碼蛋白質序列的相 似性小于85%的新基因，同時可獲得該新基因的(上下游)調控序列。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明不需要對厭氧發(fā)酵群落中的微生物進行培養(yǎng)，而直接將厭氧發(fā)酵群落 的元基因組DNA用于生物質轉化相關酶的基因資源的篩選，該方法同時針對厭氧發(fā)酵群落 中所有的微生物，具有免培養(yǎng)和高通量的優(yōu)點。(2)本發(fā)明優(yōu)選地建立了 R)smid文庫，對其中具有生物質轉化相關的酶如內切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和內切木聚糖酶等活性的陽性克隆的篩選使用水解 圈顯色法，對10萬個克隆進行篩選后得到了 1000多個陽性克隆，具有高通量、高效率的優(yōu)
點O(3)本發(fā)明優(yōu)選地將獲得的陽性克隆等比例混合后進行高通量測序，可以同時獲 得多個陽性克隆的功能基因的編碼序列和上下游調控序列的信息，具有高通量、高效率和 低成本的特點。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。實施例1、沼氣發(fā)酵系統(tǒng)R)smid元基因組文庫的構建1、基因組DNA的提取取SmL沼液(取自以秸桿和豬糞為原料進行40°C厭氧發(fā)酵的沼氣池)，SOOOg 離心 5min 后，取沉淀并用 20mL PBS 緩沖液(137mM NaCl, 2. 7mMKCl, 1. 5mM KH2PO4,8. ImM Na2HPO4, pH 7.4)洗 3 次。沉淀用 7. 68mL DNA 抽提緩沖液重懸(IOOmM Tris-HCl(pH 8.0)， IOOmM EDTA, IOOmM Na3PO4,1. 5M NaCl, 1 % (w/v)CTAB) 加入蛋白酶 K(終濃度 lmg/mL) 和SDS(終濃度(w/v))后在55°C孵育20min，然后再在70°C孵育lOmin。粗裂解液于 17，OOOg離心IOmin后，收集上清。用苯酚氯仿異戊醇Q5 24 1)抽提上清兩次后 再用氯仿異戊醇04 1)抽提上清一次。用0. 6倍體積的異丙醇在5，400g離心5min沉 淀DNA，用 200μL TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8.0)溶解 DNA 沉淀。使用 Epicentre 公司的DNA End-Repair Kit試劑盒對5 μ g元基因組DNA進行補平和磷酸化，操作按照試 劑盒說明書進行。將經過補平和磷酸化的基因組DNA樣品，進行脈沖場凝膠電泳(緩沖液0. 5XTBE,電壓6V/cm，電泳時間18h，轉換時間7s，轉角120度，溫度14°C )，電泳結果見圖 5泳道1 ο對比例在提取元基因組DNA時，其它步驟同上，不同點在于在加入蛋白酶K(終濃度Img/ mL)和SDS (終濃度1 % (w/v))后在55 °C孵育3小時。對獲得的基因組DNA進行脈沖場凝膠 電泳(緩沖液0. 5 X TBE,電壓6V/cm,電泳時間18h，轉換時間7s，轉角120度，溫度14°C )， 電泳結果見圖5泳道2。因此，從脈沖場凝膠電泳的結果(圖5)可以看到，用本發(fā)明優(yōu)化的方法提取的 DNA,其片段大小集中在38-481Λ之間，而用一般方法提取的DNA其片段長度集中在23-301Λ 之間，所以本發(fā)明優(yōu)化的方法提取的DNA片段要大于一般方法提取的DNA，更加適合文庫構 建的要求。同時，用本專利優(yōu)化的方法提取的DNA，其A260/A280和A260/A230的值均高于一 般方法提取的DNA (見表1)，這表明用本發(fā)明的方法提取的DNA比用一般方法提取的DNA純 度更高。高純度大片段DNA的獲取是成功構建高質量R)Smid文庫的關鍵。表1、不同方法獲得DNA的吸光度檢測
權利要求
1.一種從厭氧微生物群落篩選生物質轉化相關基因的方法，其特征在于，所述方法包括(1)從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉染入 宿主細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克?。?2)從步驟(1)獲得的細胞克隆中篩選具有生物質轉化性狀的細胞克隆，所述克隆中 攜帶生物質轉化相關基因；和(3)鑒定或分離步驟( 獲得的具有生物質轉化性狀的克隆中生物質轉化相關基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的厭氧微生物群落選自含有纖維素物 質的工農業(yè)生產廢棄物或畜牧養(yǎng)殖產生的家畜糞便經過產氫、產甲烷或堆肥產生的微生物 群落。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的載體選自Josmid載體 或者Cosmid載體；或收集的DNA片段的長度是30-551Λ。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，提取元基因組DNA時，包括(a)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15-40分鐘， 接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質，獲得上清； 和(b)從上清提取DNA。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，去除裂解液中細胞碎片和雜質 的方法是將裂解液于17000 士 2000g下離心8-12分鐘。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，首先采用苯酚、氯仿、異戊醇抽 提上清；接著采用氯仿、異戊醇抽提上清；接著用異丙醇在MOO士500g下離心沉淀DNA。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物質轉化相關基因選白內切葡聚 糖酶基因，內切木聚糖酶基因，葡萄糖苷酶基因，外切葡聚糖酶基因；或所述的生物質轉化性狀選自對應于內切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，剛果紅染色呈現黃色水解圈；對應于內切木聚糖酶水解培養(yǎng)基中的木聚糖，經剛果紅染色呈現黃色水解圈； 對應于葡萄糖苷酶水解培養(yǎng)基中的七葉苷，與檸檬酸鐵銨形成黑色沉淀，呈現黑 色水解圈；對應于外切葡聚糖酶水解培養(yǎng)基上的4-甲基傘形酮-β -D-纖維二糖，在紫外光激發(fā) 下呈現熒光水解圈。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)包括對生物質轉化相關基因進行 測序，測序的方法包括(i)選取2-100個具有生物質轉化性狀的細胞克隆分別進行培養(yǎng)，將獲得的細胞培養(yǎng) 物混合，獲得混合的細胞體系；和( )從所述混合的細胞體系中提取DNA，測序。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(i)中，分別進行培養(yǎng)時，將細胞克隆培 養(yǎng)到基本上相同的細胞數，再將各細胞培養(yǎng)物混合。
10. 一種從厭氧微生物群落提取DNA的方法，其特征在于，所述方法包括 (al)裂解微生物細胞用蛋白酶K和SDS處理微生物細胞，在55士2°C孵育15-40分 鐘，接著在70士2°C孵育8-12分鐘，獲得裂解液，去除裂解液中的細胞碎片和雜質，獲得上 清 ’和(bl)從上清提取DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及從厭氧發(fā)酵系統(tǒng)獲取生物質轉化相關基因的方法，所述方法包括從厭氧微生物群落提取元基因組DNA，收集DNA片段，連接入載體中，包裝、轉染入細胞，獲得攜帶所述DNA片段的細胞克??；從獲得的細胞克隆中篩選具有生物質轉化性狀的細胞克隆，所述克隆中攜帶生物質轉化相關基因；鑒定或分離獲得的具有生物質轉化性狀的克隆中生物質轉化相關基因。本發(fā)明不需要對厭氧發(fā)酵群落中的微生物進行培養(yǎng)，而直接將厭氧發(fā)酵群落的元基因組DNA用于生物質轉化相關酶的基因資源的篩選，該方法同時針對厭氧發(fā)酵群落中所有的微生物，具有免培養(yǎng)、高通量和低成本的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102146368SQ20101010794
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者嚴興, 劉芳華, 周志華, 張珺, 程林, 耿阿蕾, 魏勇軍 申請人:中國科學院上海生命科學研究院