專利名稱：一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，尤其涉及一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制
備高鹽稀態(tài)醬油的方法。
背景技術(shù)：
醬油是一種歷史悠久的調(diào)味品，目前國內(nèi)的醬油的釀造方法主要有高鹽稀態(tài)發(fā)酵 法和低鹽固態(tài)發(fā)酵法兩種。低鹽固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵周期短，但是產(chǎn)品風(fēng)味遠(yuǎn)不如高鹽稀態(tài)發(fā) 酵法。高鹽稀態(tài)釀造法是以黃豆和面粉為主料，經(jīng)米曲霉等微生物發(fā)酵制曲，利用高鹽稀態(tài) 天然曬露的發(fā)酵方法釀造而成。高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝的發(fā)酵過程主要有兩個(gè)階段的生物化學(xué) 變化第一階段是在發(fā)酵初期，即發(fā)酵的前60 90天，主要是由米曲霉在大曲制備過程中 所產(chǎn)生的蛋白酶、糖化酶將原料中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸(醬油中的主要成分)和還原糖， 形成醬油的鮮味物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生少量具有醬香風(fēng)味的成分；第二階段是在發(fā)酵后期，主 要由一些酵母菌、乳酸菌等微生物在發(fā)酵過程中不斷產(chǎn)生乙醇、乳酸等有機(jī)化合物，通過復(fù) 雜的生物化學(xué)變化生成醬油中主要風(fēng)味物質(zhì)，形成高鹽稀態(tài)醬油獨(dú)有的醇厚醬香風(fēng)味，如 乙醇、乳酸、4_乙烯基愈創(chuàng)酚等。因此，高鹽稀態(tài)發(fā)酵需要4-6個(gè)月的時(shí)間才能形成醬油醇 厚的醬香風(fēng)味，但具有發(fā)酵時(shí)間長，設(shè)備利用率低的缺點(diǎn)。 傳統(tǒng)方法對提升醬油風(fēng)味的研究主要針對于原料配比、原料特殊處理、菌種改造、 添加物及發(fā)酵過程中控制關(guān)鍵工藝參數(shù)等。醬油發(fā)酵技術(shù)幾千年的發(fā)展，雖然使得傳統(tǒng)方 法的研究對提升醬油的風(fēng)味有一定的幫助，但隨著工藝技術(shù)的不斷升級，醬油發(fā)酵中傳統(tǒng) 的工藝參數(shù)已經(jīng)基本確定，變化幅度較小，對提升醬油風(fēng)味的空間非常有限；適當(dāng)延長發(fā)酵 周期雖然可以提高其產(chǎn)品風(fēng)味，但發(fā)酵周期超過120-150天后，風(fēng)味改善的效果不明顯，且 延長發(fā)酵周期限制了設(shè)備的周轉(zhuǎn)利用，無形中提高了生產(chǎn)成本；其次，在醬油發(fā)酵的長期過 程中，其產(chǎn)品風(fēng)味受原料的差異、各地自然條件、氣候因素的變化等多方面因素影響，產(chǎn)品 風(fēng)味的穩(wěn)定性較難控制。 固定化細(xì)胞發(fā)酵是近年來飛速發(fā)展的生物工程技術(shù)，它是把微生物細(xì)胞附著固定 在一定載體上，反應(yīng)器中單位體積含菌量大大超過常規(guī)發(fā)酵含菌量，因而能提高發(fā)酵速率 并縮短發(fā)酵周期。 日本于1982年開始研究把固定化細(xì)胞發(fā)酵用于醬油釀造，其后研究人員作了大 量固定化耐鹽酵母菌和乳酸菌的試驗(yàn)。但都是采用低鹽發(fā)酵液為底物，用海藻酸鈉、聚乙稀 醇或陶瓷制品為載體，分別固定耐鹽酵母菌和乳酸菌。據(jù)國外研究表明通過固定化細(xì)胞工 藝，固定化細(xì)胞濃度和代謝產(chǎn)物均比自由細(xì)胞提高，固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)品的理化分析值符 合傳統(tǒng)釀造醬油標(biāo)準(zhǔn)，但感官品評仍然達(dá)不到傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)釀造醬油的水平。目前還沒有 生產(chǎn)企業(yè)能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固定化技術(shù)在高鹽稀態(tài)釀造醬油的實(shí)際生產(chǎn)過程中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，該方法不僅能提升高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味并縮短了醬油發(fā)酵的周期，而且還能 克服高鹽稀態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵周期長、設(shè)備利用率低、生產(chǎn)成本偏高的缺點(diǎn)。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽 稀態(tài)醬油的方法，其包括以下步驟 (1)用傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制備醬油，制得經(jīng)60-90天發(fā)酵的醬油原液備用；
(2)取經(jīng)活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種 分別制成固定化細(xì)胞粒子； (3)取步驟(2)中制得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌
四種菌種的固定化細(xì)胞粒子按照質(zhì)量比o 3 : o 3 : 3 5 : o. 1 l進(jìn)行復(fù)配得到
混合固定化細(xì)胞粒子；然后以接種量為10-30% (W/V)將混合固定化細(xì)胞粒子接種至步驟
(1)所得的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液中，在溫度28-33t:連續(xù)發(fā)酵15-24小時(shí)； (4)發(fā)酵結(jié)束后，將該發(fā)酵成熟的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油與固定化細(xì)胞粒子分離后得
高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油成品。 本發(fā)明的步驟(2)中球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四 種菌種的活化及它們的固定化細(xì)胞粒子的制備采用現(xiàn)有的方法都可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。而 作為其中一種實(shí)施方式，固定化細(xì)胞粒子可通過以下步驟制得 取經(jīng)活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的 菌液分別與海藻酸鈉膠液按1 : 15 25的體積比混合制備成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸 浮液滴注入質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、 生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒子。 所述的海藻酸鈉膠液的質(zhì)量百分比濃度為1. 5 3. 5% ;所述的質(zhì)量百分比濃度 為2% (W/W)的氯化鈣溶液的添加量與海藻酸鈉菌液的體積比為1. 5 3 : 1 (V/V)。
所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定 化細(xì)胞粒子均可要求固定化細(xì)胞粒子中的平均含菌量為106 108個(gè)/顆粒，可確保各菌種 在醬油發(fā)酵原料中具有適合的濃度，并保證醬油發(fā)酵原料能夠充分發(fā)酵，提高了發(fā)酵速度， 得到良好的發(fā)酵效果。 本發(fā)明可在步驟(3)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液中添加質(zhì)量百分比濃度為5 10% (W/W)的液化糖漿，其添加量為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液總重量的5 20% (W/W)，為球擬酵 母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌的發(fā)酵提供足夠的養(yǎng)分，以促進(jìn)各菌種的 繁殖生長，有利于產(chǎn)生有效的風(fēng)味物質(zhì)，使最終得到的醬油的感官風(fēng)味獨(dú)特、醬香醇厚。
本發(fā)明可做以下改進(jìn)在步驟(3)中所述的連續(xù)發(fā)酵過程中每隔30 60min進(jìn)行 一次攪拌；每次攪拌的時(shí)間為2 5min，攪拌速度可以是在80 150r/min范圍內(nèi)。在發(fā) 酵過程中進(jìn)行攪拌，發(fā)酵物料中的菌種和養(yǎng)分均勻分布并能與發(fā)酵原液充分接觸，并提高 溶解氧的效率，提高發(fā)酵效率及效果。 在本發(fā)明步驟(4)中發(fā)酵成熟的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油與固定化細(xì)胞粒子分離采用
現(xiàn)有技術(shù)中行之有效的分離方法均可，包括離心分離、過濾等。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果 (1)本發(fā)明是在傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)醬油的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，利用固定化細(xì)胞技術(shù)，用 混合的菌種對發(fā)酵時(shí)間為60-90天的醬油原液進(jìn)行發(fā)酵，改善醬油中醇類、酚類、酯類及雜環(huán)類化合物等風(fēng)味物質(zhì)的含量及其比例。經(jīng)檢測，利用該工藝發(fā)酵的醬油與需發(fā)酵120-150 天的傳統(tǒng)工藝得到的醬油相比，其l-辛烯-3-醇、乙醇、4-乙烯基愈創(chuàng)酚等幾種主要風(fēng)味物 質(zhì)的含量都有明顯提高，從而提升高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油風(fēng)味，得到感官風(fēng)味獨(dú)特、醬香醇厚的 醬油。 (2)本發(fā)明的生產(chǎn)周期在60 90天左右，大大縮短了高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的生產(chǎn)周 期，提高了發(fā)酵設(shè)備的利用率，降低了生產(chǎn)成本。 (3)本發(fā)明中的各菌種進(jìn)行細(xì)胞固定化后，可以回收重復(fù)使用，在發(fā)酵過程中對風(fēng) 味的控制較為穩(wěn)定。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例一 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 5(w/v)。
(2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 20(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵60天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備用。 (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的球擬酵母、魯氏酵 母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)海藻酸 鈉膠液按l : 20(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百分比 濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體積比為
2 : 1(v/v)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的珠狀固
定化海藻酸鈣粒子。按上述方法制備得到相應(yīng)的固定化細(xì)胞粒子。要求各固定化細(xì)胞粒子
的平均含菌量為106個(gè)/顆粒，然后將球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)
球菌四種固定化細(xì)胞粒子的按i :i:3: o.s的質(zhì)量比復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加10kg質(zhì)量百分比濃度為 10%的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為20% (W混合菌稲定化細(xì)鵬子/V高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度^C下連續(xù)發(fā)酵24小時(shí)，每 隔30min進(jìn)行攪拌2min，攪拌速度120r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油?；厥蘸蟮墓潭ɑ?xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 20%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 30%，總酯提高了 8%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬 油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng)味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實(shí)施例二 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 4(w/v)。
(2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : i5(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵70天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備 用。 (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的球擬酵母、魯氏 酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為3% (W/W)的海藻 酸鈉膠液按l : 15(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百 分比濃度為2% (W/W)的氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體
積比為i.5 : 1(v/v)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球
菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求各固定化細(xì)胞粒子的平均含菌量為107個(gè)/顆粒， 然后將球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種固定化細(xì)胞粒子的按
l:2:4: 0.3的質(zhì)量比復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加13kg質(zhì)量百分比濃度為8X (W/W)的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為15%
(w混合菌稲定化細(xì)鵬子/v高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度;3(rc下連續(xù)發(fā)酵1S小時(shí)，每
隔60min進(jìn)行攪拌5min，攪拌速度100r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油。回收后的固定化細(xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 23%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 28. 74%，總酯提高了 10%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬 油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng) 味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實(shí)施例三 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為 2% (W/W)的蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離
心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 6(w/v)。 (2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵90天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備用。 (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的球擬酵母、魯氏酵 母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)的海藻酸 鈉膠液按l : 25(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百分比 濃度為2%氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體積比為2 : 1(V/ V)，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的珠狀固定化海藻 酸鈣粒子。要求各固定化細(xì)胞粒子的平均含菌量為107個(gè)/顆粒，然后將球擬酵母、魯氏酵
母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種固定化細(xì)胞粒子的按i:3:3:i的質(zhì)量比 復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加20kg質(zhì)量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為25%
(w混合菌稲定化細(xì)鵬子/v高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度rc下連續(xù)發(fā)酵is小時(shí)，每
隔30min進(jìn)行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油?；厥蘸蟮墓潭ɑ?xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 20%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 33. 5%，總酯提高了 8%，乙酸乙酯提高了 3%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬 油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng) 味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有明顯改善，醬香更為醇厚。
實(shí)施例四 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 5謂。 (2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 20(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵80天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的魯氏酵母、生香 賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)海藻酸鈉膠液按 1 : 20(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體積比為3 : 1(V/V)， 即分別得到魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要 求各固定化細(xì)胞粒子的平均含菌量為io8個(gè)/顆粒，然后將魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及 醬油四聯(lián)球菌三種固定化細(xì)胞粒子的按2 : 3 : 0.5的質(zhì)量比復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加10kg質(zhì)量百分比濃度為10%的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為30% (W混合菌稲定化細(xì)鵬子/V高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度^C下連續(xù)發(fā)酵24小時(shí)，每 隔30min進(jìn)行攪拌2min，攪拌速度120r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油?；厥蘸蟮墓潭ɑ?xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 18%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 22.8%，總酯提高了 9%，乙酸乙酯提高了 3%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬 油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng) 味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。
實(shí)施例五 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取魯氏酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 6謂。
(2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵75天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的魯氏酵母、生香賽 特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為1.5% (W/W)的海藻酸鈉膠液按 1 : 23(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百分比濃度為2% 氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體積比為2.5 : 1(V/V)，即分 別得到魯氏酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求各 固定化細(xì)胞粒子的平均含菌量為107個(gè)/顆粒，然后將魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油
四聯(lián)球菌三種固定化細(xì)胞粒子的按3:4:i的質(zhì)量比復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加20kg質(zhì)量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為10%
(w混合菌稲定化細(xì)鵬子/v高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度rc下連續(xù)發(fā)酵is小時(shí)，每
隔30min進(jìn)行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油?；厥蘸蟮墓潭ɑ?xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 18. 6%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 20. 7%，總酯提高了 6%，乙酸乙酯提高了 2%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng) 味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。
實(shí)施例六 采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法 (1)分別取球擬酵母、生香賽特假絲酵母，分別用質(zhì)量百分比濃度為2% (W/W)的 蔗糖溶液在3(TC恒溫條件下活化，使各酵母菌種活力充分恢復(fù)，然后擴(kuò)培、離心，用無菌水
稀釋待用，菌種:無菌水=i : 6謂。
(2)將醬油四聯(lián)球菌菌種接種到脫脂乳培養(yǎng)基中活化3次以上，使菌種活力充分
恢復(fù)，然后擴(kuò)培離心，用無菌水稀釋待用，菌種無菌水=i : 25(w/v)。 (3)采用傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵法制備得到經(jīng)發(fā)酵90天的高鹽稀態(tài)醬油原液，備 用； (4)菌種固定化粒子的制備方法將步驟(1)和步驟(2)制備的球擬酵母、生香賽 特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌菌液分別與質(zhì)量百分比濃度為2.5% (W/W)的海藻酸鈉膠液按 1 : 18(V/V)的體積比混合成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液滴注入質(zhì)量百分比濃度為2% 氯化鈣溶液中，其中2%氯化鈣溶液與海藻酸鈉細(xì)胞懸浮液的體積比為2 : 1(V/V)，即分別 得到球擬酵母、生香賽特假絲酵母和醬油四聯(lián)球菌的珠狀固定化海藻酸鈣粒子。要求固定 化細(xì)胞粒子的平均含菌量為107個(gè)/顆粒，然后將球擬酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)
球菌三種固定化細(xì)胞粒子的按3:3:i的質(zhì)量比復(fù)配混合。 (5)取100kg步驟(3)所得的高鹽稀態(tài)醬油原液，添加20kg質(zhì)量百分比濃度 為5%的液化糖漿，將制備好的混合菌種固定化細(xì)胞粒子接種到醬油原液，接種量為25%
(w混合菌稲定化細(xì)鵬子/v高鹽稀態(tài)醫(yī)油原液)，然后進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度;3(rc下連續(xù)發(fā)酵加小時(shí)，每
隔30min進(jìn)行攪拌3min，攪拌速度100r/min。 (6)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵成熟的醬油與固定化細(xì)胞粒子過濾分離，得到高鹽稀態(tài)醬 油?；厥蘸蟮墓潭ɑ?xì)胞粒子可進(jìn)行下一次發(fā)酵。 成分比較分析利用固相微萃取一氣質(zhì)聯(lián)用的方法對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油 樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析。檢測結(jié)果表明 利用固定化細(xì)胞發(fā)酵的醬油樣本比120天發(fā)酵的醬油樣本中的l-辛烯-3-醇的含量提高 15%，4-乙烯基愈創(chuàng)酚含量提高了 13%，總酯提高了 10%，乙酸乙酯提高了 5%。
感官比較對120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵成熟醬油樣本和利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬 油樣本進(jìn)行感官評定。感官評定結(jié)果表明利用固定化細(xì)胞技術(shù)發(fā)酵的醬油樣本的醬油風(fēng) 味比120天傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的醬油樣本有改善，醬香較為醇厚。 本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。本發(fā)明的 上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明而不是限制，因此在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相 當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是，其包括以下步驟(1)用傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制備醬油，制得經(jīng)60-90天發(fā)酵的醬油原液備用；(2)取經(jīng)活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種分別制成固定化細(xì)胞粒子；(3)取步驟(2)中制得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒子按照質(zhì)量比例0～1∶0～3∶3～5∶0.1～1進(jìn)行復(fù)配得到混合固定化細(xì)胞粒子；然后以接種量為10-30％(W/V)將混合固定化細(xì)胞粒子接種至步驟(1)所得的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液中，在溫度28-33℃連續(xù)發(fā)酵15-24小時(shí)；(4)發(fā)酵結(jié)束后，將該發(fā)酵成熟的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油與固定化細(xì)胞粒子分離后得高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒 子通過以下步驟制得取經(jīng)活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的菌液 分別與海藻酸鈉膠液按l : 15 25的體積比混合制備成細(xì)胞懸浮液，然后將細(xì)胞懸浮液 滴注入質(zhì)量百分比濃度為2%的氯化鈣溶液中，即分別得到球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特 假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征 是，所述的海藻酸鈉膠液的質(zhì)量百分比濃度為1. 5 3. 5%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 所述的質(zhì)量百分比濃度為2%的氯化鈣溶液的添加量與海藻酸鈉菌液的體積比為1. 5 3 ! 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 所述的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒 子均要求固定化細(xì)胞粒子中的平均含菌量為106 108個(gè)/顆粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 在所述的步驟(2)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液中添加質(zhì)量百分比濃度為5 10%的液化糖 漿，其添加量為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液總重量的5 20%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 在步驟(2)中所述的連續(xù)發(fā)酵過程中每隔30 60min進(jìn)行一次攪拌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其特征是， 所述的攪拌的時(shí)間為2 5min，攪拌的速度在80 150r/min范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用固定化細(xì)胞發(fā)酵制備高鹽稀態(tài)醬油的方法，其包括以下步驟(1)用傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制備醬油，制得經(jīng)60～90天發(fā)酵的醬油原液備用；(2)取經(jīng)活化的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種分別制成固定化細(xì)胞粒子；(3)取步驟(2)中制得的球擬酵母、魯氏酵母、生香賽特假絲酵母及醬油四聯(lián)球菌四種菌種的固定化細(xì)胞粒子進(jìn)行復(fù)配得到混合固定化細(xì)胞粒子；然后將混合固定化細(xì)胞粒子接種至步驟(1)所得的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油原液中進(jìn)行發(fā)酵；(4)發(fā)酵結(jié)束后，將該發(fā)酵成熟的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油與固定化細(xì)胞粒子分離后得高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油成品。該方法不僅能提升高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味，而且縮短了醬油發(fā)酵的周期，克服了高鹽稀態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵周期長、設(shè)備利用率低、生產(chǎn)成本偏高的缺點(diǎn)。
文檔編號A23L1/238GK101731568SQ20101001930
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者劉占, 吳廣泉, 張慶宇, 曾亞麗, 楊明泉, 胡鋒, 賈愛娟, 陳穗, 高聽明 申請人:廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司