專利名稱：用于流體通道中生物分子和其它分析物的電壓感測(cè)的縱向移位納米級(jí)電極的使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及生物聚合物測(cè)序。更具體地講，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及確定生物聚合物的長度和結(jié)合到生物聚合物的探針的距離。
背景技術(shù)：
稱為Coulter計(jì)數(shù)的技術(shù)在二十世紀(jì)四十年代末首先由Wallace H. Coulter作為用于紅血球的高速計(jì)數(shù)的技術(shù)提出。Coulter計(jì)數(shù)還稱為電阻脈沖感測(cè)，可用于測(cè)量電解質(zhì)溶液中的分析物的物理參數(shù)，包括尺寸(體積)、電荷、電泳淌度和濃度。在這種技術(shù)中，兩個(gè)溶液的貯液器由已知尺寸的流體阻塞物分開。在這兩個(gè)貯液器之間施加恒定DC電壓導(dǎo)致測(cè)量的基線離子電流?；€電流的大小與電解質(zhì)的電導(dǎo)率、施加的電勢(shì)、通道的長度和通道的橫截面面積相關(guān)。如果分析物被引入到貯液器中，則它可以穿過流體通道并由于電解質(zhì)溶液和分析物之間的電導(dǎo)率的差異而減小觀測(cè)的電流。電流的減小的幅度取決于在分析物處于流體通道中的同時(shí)由分析物取代的電解質(zhì)的體積。
電阻脈沖感測(cè)技術(shù)的好處在于，它可以縮小比例以便通過使用納米級(jí)流體阻塞物能夠?qū)崿F(xiàn)納米級(jí)分析物的檢測(cè)。這種能力導(dǎo)致了用于檢測(cè)納米級(jí)分子(諸如，DNA)的固態(tài)納米孔的開發(fā)。
在通過納米孔的DNA移位的情況下，物理移位由所施加的DC電壓產(chǎn)生的電泳力驅(qū)動(dòng)。這種驅(qū)動(dòng)力和檢測(cè)的信號(hào)因此通常不可分離地耦合?？赡芟Ｍ麑?duì)這兩種效果去耦合， 因?yàn)橛糜谖锢硪莆坏淖罴央妱?shì)不同于最佳測(cè)量的電勢(shì)。
已提出橫向電極以便提供橫向電場(chǎng)和電流從而感測(cè)被限制在納米流體通道中的生物分子。參見 Liang and Chou 2008Liang，X ；Chou, S. Y.，Nanogap Detector Inside Nanofluidic Channel for Fast Real-Time Label-Free DNA Analysis. Nano Lett. 2008, 8，1472-1476，其內(nèi)容通過引用全部包含于此。分析物利用由位于納米通道的端部的載流電極產(chǎn)生的電泳力移動(dòng)穿過通道，因此對(duì)測(cè)量與移位速度去耦合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施例提供了這樣的裝置和方法使用電極感測(cè)電壓變化而非產(chǎn)生橫向電流，由此減小電極的退化。特別地，本文描述的裝置使用縱向移位電極以用于流體通道中的生物分子和其它納米級(jí)分析物的電子感測(cè)。實(shí)施例能夠?qū)崿F(xiàn)納米級(jí)分析物的表征，例如包括具有探針附接于其上的DNA鏈的分析。
更具體地講，本發(fā)明的實(shí)施例可使用感測(cè)電極以用于流體通道中的分析物(例如，DNA)的電子感測(cè)。流體通道中的感測(cè)電極可用于確定分析物的長度或者它們可用于確定雜交到DNA的目標(biāo)鏈的探針之間的距離。該裝置設(shè)計(jì)類似于用于光學(xué)檢測(cè)的納米通道裝置?？梢园凑?00到200 μ m的距離加工兩個(gè)微米級(jí)貯液器。一個(gè)或多個(gè)流體通道可連接這兩個(gè)貯液器。通過鉆出允許把流體引入到每個(gè)貯液器并為宏觀電極提供通路的孔可以加工蓋層。在使用中，電壓表可用于監(jiān)測(cè)兩個(gè)感測(cè)電極之間的電勢(shì)差。
待分析的DNA可以被引入到微流體貯液器之一。宏觀電極可連接到電源并用于在這兩個(gè)貯液器之間施加電勢(shì)。DNA片段可以被以電泳方式從微觀貯液器驅(qū)動(dòng)到納米通道。 當(dāng)每個(gè)DNA片段沿流體通道移動(dòng)時(shí)，它可以進(jìn)入和離開位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)。
在不存在DNA的情況下，流體通道僅包含離子溶液并且通常具有在兩個(gè)感測(cè)電極之間測(cè)量的基線電勢(shì)差。當(dāng)DNA進(jìn)入流體通道時(shí)，這兩個(gè)感測(cè)電極之間測(cè)量的電勢(shì)可變化， 因?yàn)镈NA具有與離子溶液的電導(dǎo)率不同的電導(dǎo)率。當(dāng)DNA進(jìn)入流體通道時(shí)，這兩個(gè)感測(cè)電極之間的通道的電導(dǎo)率通常減小，因?yàn)镈NA導(dǎo)電性差于緩沖溶液(參見de Pablo, P. J.； Moreno-Herrero, F ；CoIchero, J. ；Gomez-Herrero, J. ；Herrero, P. ；Baro, Α. M. ；Ordejon, P. ；Soler, J. M. ；Artacho, E. Absence of dc-Conductivity in Phys. Rev. Lett. 2000,85, 4992-4995，其全部內(nèi)容通過引用包含于此)。當(dāng)具有雜交到DNA的探針的DNA的部分進(jìn)入流體通道時(shí)，電勢(shì)可進(jìn)一步變化。可分析測(cè)量的信號(hào)以確定DNA的長度和/或探針之間的距離。
在一方面，本發(fā)明的實(shí)施例包括一種用于分析物的電壓感測(cè)的裝置。該裝置可包括限定在基片中的流體通道；和感測(cè)電極對(duì)，位于流體通道中以用于感測(cè)該流體通道中的電壓。所述感測(cè)電極對(duì)可包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極。電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)可位于流體通道的第一端和第二端，用于沿流體通道施加電勢(shì)。所述流體通道可包括或基本上包括納米通道或微米通道。
可包括一個(gè)或多個(gè)下面的特征。所述基片可包括或基本上包括硅、二氧化硅、熔融硅石和/或砷化鎵。所述感測(cè)電極對(duì)和電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)中的每個(gè)電極可包括或基本上包括鉬、金、鉻、鈦、氯化銀、銀和石墨烯。
第一感測(cè)電極可位于流體通道的第一側(cè)上，第二感測(cè)電極可位于流體通道的相對(duì)側(cè)上。第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極中的每個(gè)感測(cè)電極可位于流體通道的第一側(cè)上，或者第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極中的每個(gè)感測(cè)電極可橫跨流體通道。第一感測(cè)電極可橫跨流體通道，第二感測(cè)電極可位于流體通道的一側(cè)上。
所述電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)可包括宏觀電極，該宏觀電極在流體通道中產(chǎn)生恒定、變化或振蕩的電泳力以用于位于流體通道中的分析物的移位。
可提供測(cè)量工具(諸如，電壓表)以用于測(cè)量由感測(cè)電極對(duì)感測(cè)的電壓。該裝置可包括多個(gè)流體通道。電壓放大器可位于基片上。
所述流體通道可具有從Inm到5 μ m的范圍選擇的寬度，從Inm到5 μ m的范圍選擇的深度，和/或從1 μ m到IOcm的范圍選擇的長度。
本發(fā)明的其它方面的實(shí)施例的元素的描述也可以應(yīng)用于本發(fā)明的這個(gè)方面。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種用于檢測(cè)分析物的方法，該方法包括把分析物布置在流體通道中。沿流體通道施加電勢(shì)，并且使分析物從流體通道的第一端向流體通道的第二端移位。當(dāng)分析物移經(jīng)位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)時(shí)測(cè)量該感測(cè)電極對(duì)之間的電壓信號(hào)，該感測(cè)電極對(duì)包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一電極和第二電極。所述流體通道可包括或基本上包括納米通道或微米通道。
沿流體通道施加電勢(shì)的步驟可包括在流體通道中產(chǎn)生電泳力。使分析物移位的步驟可包括使用壓力差和/或化學(xué)梯度。
可包括一個(gè)或多個(gè)下面的特征。所述分析物可包括生物聚合物，諸如脫氧核糖核酸、核糖核酸和/或多肽。所述生物聚合物可包括或基本上包括單鏈分子。所述分析物可包括或基本上包括生物聚合物，該生物聚合物具有附接于它的至少一個(gè)探針。
所述電壓信號(hào)可在生物聚合物移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)變化，并且在生物聚合物的包括探針的部分移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)進(jìn)一步變化。可記錄電壓信號(hào)變化之間的時(shí)間。電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間可指示探針的存在，該電壓信號(hào)可用于確定生物聚合物上的兩個(gè)探針之間的距離。
電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間可用于確定分析物的長度。多個(gè)感測(cè)電極對(duì)可用于在單個(gè)分析物分子穿過流體通道時(shí)測(cè)量該分析物分子。
本發(fā)明的其它方面的實(shí)施例的元素的描述也可以應(yīng)用于本發(fā)明的這個(gè)方面。
在另一方面，一種用于確定生物聚合物的序列的方法可包括制備包括生物聚合物的分析物?？梢园逊治鑫锊贾迷诹黧w通道中。可以沿流體通道施加電勢(shì)，并且使分析物從流體通道的第一端向流體通道的第二端移位。當(dāng)分析物移經(jīng)位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)時(shí)可以測(cè)量該感測(cè)電極對(duì)之間的電壓信號(hào)，該電壓信號(hào)對(duì)應(yīng)于沿生物聚合物的位置，該感測(cè)電極對(duì)包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一電極和第二電極。所述流體通道可包括或基本上包括納米通道或微米通道。
沿流體通道施加電勢(shì)可包括在流體通道中產(chǎn)生電泳力。分析物可以通過使用壓力差和/或化學(xué)梯度移位。
可包括一個(gè)或多個(gè)下面的特征。制備分析物的步驟可包括使生物聚合物與探針雜交。電壓信號(hào)的變化可對(duì)應(yīng)于沿包含探針的雜交的生物聚合物的位置?？梢允褂糜?jì)算機(jī)算法處理電壓信號(hào)以重構(gòu)生物聚合物的序列。所述生物聚合物可包括或基本上包括雙鏈生物聚合物目標(biāo)分子。制備分析物的步驟可包括使目標(biāo)分子與具有用于目標(biāo)分子的識(shí)別部位的第一探針特異性的第一探針接觸以形成第一多個(gè)局部三元復(fù)合物，第一探針具有第一預(yù)測(cè)識(shí)別部位序列。所述電壓信號(hào)可用于確定第一多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息。所述位置信息可包括與兩個(gè)局部三元復(fù)合物之間的空間距離對(duì)應(yīng)的參數(shù)。
制備分析物的步驟還可包括使目標(biāo)分子與具有用于目標(biāo)分子的識(shí)別部位的第二探針特異性的第二探針接觸以形成第二多個(gè)局部三元復(fù)合物，第二探針具有第二預(yù)測(cè)識(shí)別部位序列。
電壓信號(hào)可用于確定第二多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息?？梢耘帕兄辽俚谝欢鄠€(gè)局部三元復(fù)合物和第二多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息以確定目標(biāo)的DNA序列。
所述生物聚合物可包括或基本上包括雙鏈核酸目標(biāo)分子，該雙鏈核酸目標(biāo)分子具有沿其序列布置的多個(gè)結(jié)合部位。制備分析物的步驟可包括把具有第一序列特異性的多個(gè)探針分子加入到雙鏈核酸目標(biāo)分子。
可以培養(yǎng)培養(yǎng)目標(biāo)分子和具有第一序列特異性的探針分子，以實(shí)現(xiàn)第一探針分子優(yōu)先結(jié)合到目標(biāo)分子的第一結(jié)合部位和第二結(jié)合部位。所述電壓信號(hào)可用于測(cè)量與第一結(jié)合部位和第二結(jié)合部位之間的距離相關(guān)的參數(shù)。
制備分析物的步驟可包括使生物聚合物與第一探針接觸以在第一探針針對(duì)其具有已知特異性的生物聚合物的識(shí)別部位產(chǎn)生至少一個(gè)探針目標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)剩下第一探針針對(duì)其不具有特異性的生物聚合物的未復(fù)合的區(qū)域。制備分析物的步驟還可包括使生物聚合物與第二探針接觸以在第二探針針對(duì)其具有已知特異性的生物聚合物的識(shí)別部位產(chǎn)生至少一個(gè)探針目標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)剩下第二探針針對(duì)其不具有特異性的未復(fù)合的區(qū)域。
所述電壓信號(hào)可用于檢測(cè)和記錄生物聚合物的復(fù)合和未復(fù)合的區(qū)域以創(chuàng)建第一探針的第一探針圖譜和第二探針的第二探針圖譜，第一探針圖譜和第二探針圖譜包括關(guān)于探針的雜交的相對(duì)位置的信息。通過使用位置信息或探針分子的交迭序列和位置信息的組合排列至少兩個(gè)探針序列，可以確定候選序列。第一探針圖譜和第二探針圖譜可包括關(guān)于每個(gè)探針的位置信息的誤差的信息。通過使用位置信息和與位置信息的誤差相關(guān)的參數(shù)或探針分子的交迭序列和位置信息以及位置信息的誤差的組合，可以確定候選序列。
本發(fā)明的其它方面的實(shí)施例的元素的描述也可以應(yīng)用于本發(fā)明的這個(gè)方面。


圖1是表示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的縱向移位橫向電極裝置結(jié)構(gòu)的示意圖； 圖2是表示根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的縱向移位橫向電極裝置結(jié)構(gòu)的示意圖； 圖3是表示根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的縱向移位連續(xù)橫向納米級(jí)電極裝置結(jié)構(gòu)的示意圖； 圖4是表示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的具有位于納米通道的同一側(cè)的電極的縱向移位納米級(jí)電極裝置結(jié)構(gòu)的示意圖； 圖5是DNA分子的示意圖； 圖6是RNA分子的示意圖； 圖7是雜交的寡核苷酸(或探針)的示意圖； 圖8是與探針雜交的單鏈DNA分子的示意圖； 圖9是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例確定的示例性電壓信號(hào)的曲線圖。
具體實(shí)施例方式流體通道和感測(cè)電極的加工 本發(fā)明的實(shí)施例包括用于執(zhí)行雜交測(cè)序分析(“SBH”)的裝置和方法。參照?qǐng)D1， 在實(shí)施例中，裝置100包括流體通道105，例如微米或納米通道。電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)110、110' 位于流體通道105的第一端和第二端以用于沿流體通道施加電勢(shì)。感測(cè)電極對(duì)115A、115B 位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置。感測(cè)電極可以與測(cè)量由感測(cè)電極感測(cè)的電壓的測(cè)量工具120保持電氣連通。流體通道105可以限定在基片(該基片包括硅、二氧化硅、熔融硅石或砷化鎵)中，并且可包含電解質(zhì)溶液。電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)110、110'可包括至少一個(gè)陽極110'和陰極110'，該至少一個(gè)陽極110'和陰極110'與電解質(zhì)溶液接觸以提供用于驅(qū)動(dòng)分析物125以使其穿過流體通道105的恒定或變化的電流。在替代實(shí)施例中，壓力差 (諸如，正壓)可用于驅(qū)動(dòng)分析物125以使其穿過流體通道105?？衫昧黧w泵或利用壓氣管線提供壓力。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想施加壓力的其它方法。在一些實(shí)施例中，化學(xué)勢(shì)梯度可用于移動(dòng)分子以使其穿過流體通道105。分析物也可以通過使用化學(xué)勢(shì)梯度移位?？梢岳脻舛忍荻犬a(chǎn)生化學(xué)勢(shì)梯度。例如，流體通道可以使一端浸入在鹽濃度比通道的另一端的流體更高的流體中。流體通道的端部的鹽濃度的差異引起滲透壓力，該滲透壓力能夠驅(qū)動(dòng)分析物以使其穿過通道。
當(dāng)分析物125 (可以是任何生物聚合物，包括但不限于多肽、DNA或RNA)穿過流體通道105時(shí)，它將會(huì)穿過感測(cè)電極對(duì)115A、115B(每個(gè)感測(cè)電極在本文中分別稱為“A”和 “B”)。與流體通道105接觸的感測(cè)電極115A、115B可用于測(cè)量它們之間的電解質(zhì)體積的電導(dǎo)率的變化。使用測(cè)量工具120(例如，電壓表)可以測(cè)量感測(cè)電極115A、115B之間的電導(dǎo)率的變化。
通過使感測(cè)電極115A、115B之間的縱向距離(例如，沿流體通道105的長度)較小，裝置100保持對(duì)從其穿過的分析物125的高靈敏度。感測(cè)電極對(duì)中的每個(gè)感測(cè)電極 115AU15B可位于流體通道105的相對(duì)側(cè)，如圖1中所示，其中感測(cè)電極115A、115B的末端與電解質(zhì)溶液接觸并且完全或者部分地彼此交叉，或者如圖2中所示，其中感測(cè)電極115A、 115B的末端彼此不交叉，而是相對(duì)于彼此縱向移位所選擇的距離。另一方面，感測(cè)電極對(duì)中的每個(gè)感測(cè)電極115A、115B可橫跨流體通道105，如圖3中所示。參照?qǐng)D4，在第三種排列中，感測(cè)電極對(duì)中的兩個(gè)感測(cè)電極115A、115B可以位于流體通道105的同一側(cè)。
本文描述的裝置100可通過加工用于限定具有納米級(jí)尺寸的流體通道105的溝槽以及加工納米級(jí)電極來形成。典型裝置100也可以具有用于引入緩沖溶液和樣本的微米級(jí)流體結(jié)構(gòu)。因此，本文描述的采用納米通道的技術(shù)也可適用于包括微米級(jí)通道的裝置。一些結(jié)構(gòu)或所有結(jié)構(gòu)也可以利用蓋層密封以便提供封閉的通道。
流體通道可以通過例如光刻和蝕刻步驟形成在基片中?；梢允抢缇哂欣?IOO)Si表面的絕緣體上硅晶片、Si晶片或熔融硅石基片。亞100納米(nm)體系中的光刻可以通過多種技術(shù)來執(zhí)行，包括電子束光刻(EBL)、納米壓印光刻(NIL)、深紫外光光亥Ij (DUVOL) 。 Liang, X. ；Morton, K. J, ；Austin, R. H. ；Chou, S. Y. ， Single sub-20nm wide, centimeter-long nanofluidic channel fabricated by novel nanoimprint mold fabrication and direct imprinting, Nano Lett. 2007,7,3774-3780 ；Austin, M. D.； Ge, H. :ffu, W, ；Li, Μ. ；Yu, Ζ. ；Wasserman, D. ；Lyon, S. Α. ；Chou, S. Y. , Fabrication of 5nm line width and 14nm pitch features by nanoimprint lithography, App. Phys. Lett.2004,84,5299-5301；禾口Guo,J. ,Recent progress in nanoimprint technology and its applications, J. Phys. D :Appl. Phys. 2004，37，R123-R141。這些參考文件中的每個(gè)文件的全部內(nèi)容通過引用包含于此。微米和納米加工的當(dāng)前工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是光刻技術(shù)，因?yàn)樗杀镜筒⑶耶a(chǎn)量高。當(dāng)前，光刻技術(shù)已成功用于臨界尺寸小至32nm的裝置的大規(guī)模生產(chǎn)。由于其通用性和可再生產(chǎn)亞IOnm特征的能力，EBL和NIL現(xiàn)在廣泛用于學(xué)術(shù)研究環(huán)境。這些方法中的任何方法可用于對(duì)本文描述的流體溝槽進(jìn)行圖案化。
可通過例如蝕刻來執(zhí)行用于形成流體溝槽的材料的去除。濕法蝕刻包括把材料浸入在能夠選擇性去除的溶液中。干法蝕刻(即，反應(yīng)離子蝕刻(RIE))包括把樣本暴露于帶電等離子體。對(duì)于納米級(jí)加工所需的分辨率和控制，RIE是優(yōu)選的，原因在于其一致性、可控制性和效率。通向納米級(jí)通道的微米流體通道或貯液器可使用濕法或干法來蝕刻。
所獲得的通道的寬度和深度的優(yōu)選尺寸為從Inm到5 μ m,更優(yōu)選地為從Inm到 1 μ m,更加優(yōu)選地為從IOnm到lOOnm。通道可具有從例如1微米(μ m)到10厘米(cm)的
9范圍選擇的長度。
可參照分析物的持續(xù)長度選擇通道的尺寸。例如，當(dāng)被引入到有限空間時(shí)隨機(jī)卷曲聚合物(例如，DNA)可被拉長，從而當(dāng)有限空間變得更小時(shí)拉長的程度變得更大。在一些實(shí)施例中，可以優(yōu)選地拉長分析物以測(cè)量探針之間的長度或距離。根據(jù)橫截面尺寸和持續(xù)長度，使通道的寬度和深度的幾何平均數(shù)處于分析物的持續(xù)長度的5%和500%之間可能會(huì)比較有用。例如，對(duì)于雙鏈DNA，在持續(xù)長度為50nm的條件下，可以優(yōu)選地使例如流體通道具有2.5nm到250nm之間的寬度和深度。在其它實(shí)施例中，對(duì)于更堅(jiān)硬的聚合物(諸如， 涂覆了 RecA的DNA)，在持續(xù)長度為950nm的條件下，可以優(yōu)選地使例如流體通道具有45nm 到4. 75 μ m之間的寬度和深度。
在形成通道之后，加工感測(cè)電極。類似于蝕刻和光刻，在常規(guī)微細(xì)加工工藝流程中存在很多適合加工感測(cè)電極的金屬沉積技術(shù)。每種技術(shù)具有正面屬性和負(fù)面屬性以及可使用該技術(shù)沉積的一系列材料。三種主要技術(shù)是電子束蒸發(fā)、熱蒸發(fā)和濺射法。感測(cè)電極在感測(cè)電極與流體通道相交的點(diǎn)處具有從5nm到IOOnm的厚度。感測(cè)電極在遠(yuǎn)離流體通道并且接近位于裝置的周邊的接觸墊的區(qū)域中可以更寬和/或更厚。
為了完成該裝置，可以引入蓋層以防止液體從流體通道蒸發(fā)。蓋層可以僅形成在納米級(jí)流體路徑上或者形成在全部流體通道上。在后者的情況下，蓋層結(jié)構(gòu)優(yōu)選地具有孔或出入口以允許把流體和樣本引入到流體路徑中。在另一實(shí)施例中，可以覆蓋整個(gè)基片 (即，晶片)。蓋層可以由玻璃板制成，諸如硼硅酸鹽玻璃、磷硅酸鹽玻璃、石英、熔融硅石、 熔融石英、硅晶片或其它合適的基片。多種技術(shù)適合完成這個(gè)步驟，包括陽極鍵合法。在陽極鍵合法中，把基礎(chǔ)硅晶片和玻璃基片壓在一起并加熱，同時(shí)在接合處施加大的電場(chǎng)。已經(jīng)證明陽極鍵合法在硅晶片和覆蓋基片之間形成強(qiáng)鍵。直接硅鍵合已用于接合兩個(gè)硅晶片。 后者的方法包括在水中把兩個(gè)硅晶片壓在一起。其它方法使用粘合層(諸如，光致抗蝕劑) 把蓋層結(jié)合到基片。
用于限定提出的感測(cè)元件的示例性加工工藝如下。合適的基片(諸如，常規(guī)(100) P型硅晶片)在含水的大氣中進(jìn)行熱氧化以生長厚(例如，> Ιμπι)的二氧化硅(SiO2)層。 這個(gè)S^2層可用作隨后形成的相鄰金屬感測(cè)電極之間的絕緣層，并且還可以減小總裝置電容。
通過使用常規(guī)高分辨率光刻，流體通道的圖案可以轉(zhuǎn)移到第一光致抗蝕劑掩模層。利用各向異性蝕刻劑種類(諸如，Cl2)的RIE可用于把圖案轉(zhuǎn)移到SiO2層中。根據(jù)對(duì)裝置靈敏度的要求可確定通道的優(yōu)選寬度和深度。兩個(gè)感測(cè)電極之間的通道的體積越小， 裝置越靈敏。通道尺寸、寬度和深度也可以根據(jù)分析物的尺寸或行為來確定。在一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的裝置用于檢測(cè)DNA的鏈?？赡芟Ｍ庸ぞ哂惺笵NA鏈在通道內(nèi)伸長的尺寸的通道。例如，對(duì)于雙鏈DNA，已發(fā)現(xiàn)使用具有IOOnm或更小的尺寸的通道能夠使生物聚合物伸長° 參見 Tegenfeldt，J. 0 等 The dynamics of genomic-length DNA molecules in 100-nm channels. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2004,101，10979-10983，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。當(dāng)完成干法蝕刻過程時(shí)，去除殘留抗蝕劑并且用力地清潔基片。
在流體通道的蝕刻之后，加工嵌入的金屬感測(cè)電極。常規(guī)高分辨率光刻可用于把金屬電極圖案轉(zhuǎn)移到第二光致抗蝕劑掩模層。利用各向異性蝕刻劑種類(諸如，Cl2)的RIE 將用于把圖案轉(zhuǎn)移到SiO2層中。優(yōu)選地，這些溝槽的深度超過或等于流體通道的深度。當(dāng)完成把圖案轉(zhuǎn)移到S^2層時(shí)，可沉積薄金屬粘合促進(jìn)層。適合的層是經(jīng)電子束蒸發(fā)沉積的厚度為30-50人的鉭。接下來，沉積感測(cè)電極材料而不使基片暴露于大氣。用于感測(cè)電極的塊體的優(yōu)選金屬是鉬，它也經(jīng)電子束蒸發(fā)沉積。合適金屬的其它例子包括金、鉻、鈦、氯化銀、銀和石墨烯。金屬的厚度由蝕刻的溝槽的深度決定，從而所獲得的金屬軌跡近似地與 SiO2層的頂表面處于同一平面。當(dāng)金屬沉積完成時(shí)，基片浸入在將會(huì)從表面溶脫過多的金屬的光致抗蝕劑溶劑中，并且用力地清潔基片。可執(zhí)行化學(xué)機(jī)械拋光(CMP)以去除在SiO2 頂表面上延伸的過多金屬，由此使金屬的頂表面平面化從而與SW2頂表面平齊。
為了完成傳感器的加工，蓋層優(yōu)選地粘合到傳感器表面以提供防漏密封，從而能夠?qū)崿F(xiàn)流體傳導(dǎo)。優(yōu)選的蓋層材料包括硼硅酸鹽玻璃、熔融硅石、熔融石英、石英或磷硅酸鹽玻璃。可以在蓋層中制作孔以提供到流體入口、流體出口和金屬感測(cè)電極的通路。用于在玻璃晶片中制作孔的典型方法是超聲波蝕刻，它允許向玻璃基片的高度可控的圖案轉(zhuǎn)移。 陽極鍵合法可隨后用于把玻璃蓋層鍵合到底層基片(例如，硅晶片)。兩層的陽極鍵合提供了牢固且防漏的密封。
具有這樣的感測(cè)電極對(duì)115A、115B的示例性裝置表示在圖1中，即電極A和B。電流在被限制在流體通道105(例如，納米通道)中的電解質(zhì)溶液中以離子流的形式轉(zhuǎn)移。電解質(zhì)的作用在于在流體通道中保持均勻分布的電場(chǎng)。典型電解質(zhì)溶液已被描述為把電泳應(yīng)用于DNA分子的分離。最常見的用于DNA的電泳分離的電解質(zhì)是Tris硼酸EDTA(TBE) 和 tris 醋酸鹽 EDTA(TAE)。參見例如 Sambrook，J. ；Russell, D. W. Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Press, 2001o 然而，可使用任 可導(dǎo)電介質(zhì)。
裝置的操作 在操作期間，通過把電勢(shì)施加于宏觀電極對(duì)(例如，位于流體通道105的相對(duì)端并與電解質(zhì)溶液接觸的電動(dòng)勢(shì)電極110、110')來提供恒定電流。電動(dòng)勢(shì)電極優(yōu)選地與圖1-4 中表示的通向流體通道105的端部的線保持電氣連通?？梢匝亓黧w通道105施加電勢(shì)以在其中產(chǎn)生電泳力，從而使分析物125從流體通道105的第一端移位至流體通道的第二端。電動(dòng)勢(shì)電極可在流體通道105中產(chǎn)生恒定或振蕩的電泳力以用于位于其中的分析物125的移位。電動(dòng)勢(shì)電極之間的電壓可以恒定，或者它可以在測(cè)量的過程中變化。例如，一旦DNA分子已進(jìn)入流體通道105并且在DNA分子進(jìn)入到感測(cè)電極之間的體積之前，可能希望減小電壓，以便使DNA分子緩慢穿過感測(cè)電極之間的體積。控制DNA分子穿過感測(cè)電極115Α、115Β 之間的體積的速度允許DNA的多方面檢測(cè)。
作為感測(cè)電極的放置的例子，可以假設(shè)圖1中的每個(gè)感測(cè)電極A和B寬度為20nm。 電極A可以相對(duì)于電極B沿流體通道105移位例如IOnm或30nm。從30nm到IOOnm或者從 30nm到500nm或者從30nm到5 μ m的感測(cè)電極之間的距離可被包括在單個(gè)裝置中。對(duì)于足夠長度的分析物，可以使用最多例如500 μ m的距離，例如可以使用最多300 μ m、200 μ m或 100 μ m的距離。雖然可以加工其間具有任何距離的電極，但由于DNA難以具有大于500 μ m 的長度，所以在DNA的長度不超過500 μ m的時(shí)候，任何大于500 μ m的電極距離就是過多的。電極A和B之間的更小位移是這樣的實(shí)施例的例子雖然電極A和B相對(duì)于彼此移位， 但存在電極的交迭。在一些實(shí)施例中，如圖2中所示，在感測(cè)電極115A、115B之間可以沒有交迭。
感測(cè)電極115A、115B之間的電壓與感測(cè)電極115A、115B之間的流體通道105中的局部阻抗成比例。電極的間隔由幾個(gè)因素確定。感測(cè)電極對(duì)中的電極之間的距離越小，假設(shè)所有其它因素不變，則能夠由感測(cè)電極對(duì)檢測(cè)的顆粒越小。然而，加工極限可能使得難以按照很小的距離一致地放置成對(duì)的電極。因此，選擇的距離是裝置100的加工再現(xiàn)性和靈敏度之間的折衷。分離距離的選擇以及由此電極是交迭還是不交迭取決于這些約束條件。
所獲得的感測(cè)電極115A、115B排列提供了用于分離電流和電壓探針的裝置并且能夠用于在流體通道中采用4點(diǎn)感測(cè)。在實(shí)施例中，位于流體通道105的端部的宏觀電動(dòng)勢(shì)電極110、110'提供電流，而位于流體通道105兩側(cè)的納米級(jí)感測(cè)電極115A、115B用于測(cè)量電壓。電壓電極優(yōu)選地具有比正被測(cè)量的體積的阻抗高的輸出阻抗。
下面的計(jì)算表明了這種裝置概念的可行性。流體通道可經(jīng)受等于沿通道的長度的電勢(shì)差除以通道的長度的恒定電場(chǎng)，即縱向施加于ΙΟμπι長的流體通道的IOOmV導(dǎo)致 IOOmV/10 μ m = IOmV/ μ m或0. 01mV/nm的電場(chǎng)。分開IOnm的電極A和B之間的電勢(shì)差則為電極之間的距離和該電場(chǎng)的乘積或者 IOnmXO. OlmV/nm = 0. lmV。
類似地，當(dāng)間隔為30nm時(shí)，0.3mV的電勢(shì)差存在于電極A和B之間。利用常規(guī)電子測(cè)量工具可容易地檢測(cè)到這些電勢(shì)中的每個(gè)電勢(shì)。當(dāng)DNA分子或任何其它分析物穿過感測(cè)電極對(duì)時(shí)，感測(cè)電極之間的阻抗由于分析物和分子之間的電阻率差異而變化。在保持恒定電流的同時(shí)，測(cè)量所獲得的電勢(shì)的瞬時(shí)變化。
對(duì)于圖1中顯示的例子，假設(shè)基本上恒定的速率，由感測(cè)電極115A、115B檢測(cè)的每個(gè)電壓脈沖的持續(xù)時(shí)間與穿過這兩個(gè)感測(cè)電極之間的DNA或其它分析物125的長度成比例。在確定流體通道中的分析物125的速度之后，測(cè)量的脈沖的持續(xù)時(shí)間可用于計(jì)算在穿過感測(cè)電極之間的體積的同時(shí)分析物125移動(dòng)的距離(速度X時(shí)間=距離)，該距離將會(huì)等于分析物125的長度。
很重要地，應(yīng)該注意的是，通過沿流體通道105使橫向電極之一移動(dòng)10-50nm的距離并且使用直徑大約IOnm的流體通道105，分離這兩個(gè)感測(cè)電極115A、115B的體積可視為具有與常規(guī)固態(tài)納米孔的靈敏度相同的靈敏度。
在使用中，感測(cè)電極對(duì)115A、115B之間的電壓(例如，Vab)可由配置為測(cè)量感測(cè)電極對(duì)115A、115B之間的電勢(shì)差的測(cè)量工具120(例如，電壓表)感測(cè)。在優(yōu)選實(shí)施例中，電壓表120可以經(jīng)由連接到通向感測(cè)電極的納米線的金屬接觸墊與感測(cè)電極對(duì)中的每個(gè)感測(cè)電極115A、115B保持電氣連通。
通常，可以如下在流體通道105中檢測(cè)分析物125。分析物(例如，生物聚合物鏈和探針)從室中轉(zhuǎn)移到電解質(zhì)溶液中的流體通道。典型地，可以由吸管、注射器或泵把電解質(zhì)加入到流體通道。分析物樣本尺寸可以根據(jù)實(shí)踐的情況盡可能小，因?yàn)檠b置允許單分子的檢測(cè)。流體可通過毛細(xì)管作用使流體通道變濕?？梢岳迷茧娊赓|(zhì)或者在通過吸入新溶液之后把分析物引入到微米級(jí)區(qū)域?？膳c一個(gè)或多個(gè)探針雜交的分析物(DNA)可以通過電勢(shì)被引導(dǎo)至流體通道中。對(duì)于小的分析物，能夠使用擴(kuò)散、流體流動(dòng)或電勢(shì)。
流體通道可具有不小于近似與分析物相同的寬度的寬度，并且可以足夠大從而結(jié)合到分析物的大分子可以穿過流體通道。例如，可以從Inm到200nm的范圍選擇流體通道的寬度。流體通道可以足夠深以允許結(jié)合到分析物的大分子穿過以及足夠淺從而近似與分析物的尺寸相同。例如，可以從Inm到200nm的范圍選擇流體通道深度?？梢赃x擇流體通道的長度從而整個(gè)分析物被包含在流體通道中。
在實(shí)施例中，感測(cè)電極和流體通道可以優(yōu)選地布置使得在分析物進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積之前整個(gè)分析物進(jìn)入流體通道。這種結(jié)構(gòu)提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)減小了分析物對(duì)流體通道的電導(dǎo)率的影響。例如，如果在整個(gè)流體通道的電導(dǎo)率由于更多分析物進(jìn)入流體通道而變化的同時(shí)開始測(cè)量感測(cè)電極之間的體積的電勢(shì)的變化，則分析變得更加復(fù)雜。在優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)分析物存在于感測(cè)電極之間的體積時(shí)，它可以被完全包含在通道中。因此， 流體通道的長度優(yōu)選地具有近似為分析物的長度三倍的最小長度(假設(shè)感測(cè)電極之間的體積僅與分析物一樣長，這是最小要求但不是最佳要求)。一條11Λ的DNA的長度為大約 330nm,因此流體通道的長度優(yōu)選地為至少1 μ m長。適合利用所述方法分析的最長條的DNA 可以為10巨堿基(Mb)，這對(duì)應(yīng)于至少IOmm的優(yōu)選流體通道。更優(yōu)選地，通道的長度為分析物的長度的十倍，因此，通道長度的更優(yōu)選的上限是IOOmm(IOcm)。因此，優(yōu)選地從1 μ m到 IOcm的范圍選擇流體通道長度。也可以采用更長和更短的流體通道長度。
在一些實(shí)施例中，流體通道的結(jié)構(gòu)可便于分析物進(jìn)入到通道中，例如流體通道可包括一系列柱(例如，美國專利No. 7，217，562，其全部內(nèi)容通過引用包含于此)和/或漏斗形狀。
通過經(jīng)把電勢(shì)施加于位于流體通道的相對(duì)端并與電解質(zhì)溶液接觸的兩個(gè)電動(dòng)勢(shì)電極提供的電流使分析物移過流體通道。電動(dòng)勢(shì)電極可在流體通道中產(chǎn)生恒定或振蕩的電泳力以用于位于其中的分析物的移位。宏觀電極之間的電壓可以恒定，或者它可以在測(cè)量的過程中變化。例如，一旦DNA分子已進(jìn)入流體通道并且在DNA分子進(jìn)入到感測(cè)電極之間的體積之前，可減小電壓，以便使DNA分子緩慢穿過感測(cè)電極之間的體積。
可以監(jiān)測(cè)反映感測(cè)電極對(duì)之間的電勢(shì)的變化的電壓信號(hào)。當(dāng)分析物移過感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電壓信號(hào)改變。該信號(hào)可以在反映分析物(例如，探針目標(biāo)復(fù)合物)的長度或沒有探針的中間區(qū)域的長度的時(shí)間段期間升高或降低。典型分析物是非傳導(dǎo)的并且將會(huì)阻礙電解質(zhì)中離子的流動(dòng)。因此，當(dāng)分析物流經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電勢(shì)和電壓信號(hào)通常增加。在一些實(shí)施例中，例如對(duì)于低鹽電解質(zhì)和攜帶電荷的分析物，當(dāng)分析物流經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電勢(shì)和電壓信號(hào)可減小。當(dāng)包含雜交探針的分析物的部分移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電壓信號(hào)進(jìn)一步改變。
分析物長度和探針位置的確定 在實(shí)施例中，提供了用于檢測(cè)與生物聚合物雜交的探針的相對(duì)位置和/或生物聚合物的長度的方法。納米孔可用作用于確定雜交部位之間的距離的探測(cè)器，如美國專利公開No. 2007/0190542 Al中所述，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。本文描述包括電壓探測(cè)器的納米通道裝置的構(gòu)造。在納米孔和流體通道(例如，納米通道)中，從當(dāng)生物聚合物移經(jīng)納米孔或流體通道時(shí)第一雜交位置和隨后雜交位置的檢測(cè)之間的時(shí)間可推斷目標(biāo)生物聚合物上的雜交部位之間的距離。本文公開的技術(shù)允許確定生物聚合物長度和雜交位置之間的距離。
特別地，如本文中所使用，“探針”是指能夠序列特異共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合到目標(biāo)分子的任何分子或分子的組合體。探針可以是但不限于DNA序列、RNA序列、抗體或抗體片段。 術(shù)語“核苷酸”和“堿基”可互換地使用并且指示由磷酸基團(tuán)、糖和能夠構(gòu)成DNA或RNA多核苷酸鏈或股的五種含氮堿基之一組成的分子。對(duì)于DNA，含氮堿基包括胞核嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)并且糖是2-脫氧核糖。對(duì)于RNA，脫氧核糖由替代脫氧核糖的核糖和替代胸腺嘧啶堿基(T)的尿嘧啶堿基(U)取代。
DNA探針“庫”是包括大量可能的置換序或者可能包括所有可能的置換序的固定長度的DNA探針的集合。多個(gè)探針可以由具有相同序列選擇性的同一探針的多個(gè)拷貝構(gòu)成或者由具有不同序列選擇性的兩個(gè)或多個(gè)探針構(gòu)成?！疤结槇D譜”是指包含與探針優(yōu)先結(jié)合的沿目標(biāo)序列的部位相關(guān)的信息的數(shù)據(jù)集。當(dāng)序列選擇探針的整個(gè)長度結(jié)合到目標(biāo)生物分子的長度的一部分時(shí)，產(chǎn)生部分雜交生物分子。該數(shù)據(jù)集可包括參考已知序列的絕度位置信息、與結(jié)合部位之間的距離相關(guān)的相對(duì)信息或者二者。該數(shù)據(jù)集可存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)介質(zhì)中。 在美國專利公開No. 2009-0099786 Al中可找到探針和光譜圖的特性的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。
“目標(biāo)”(即，分析物)是將要使用本發(fā)明的實(shí)施例確定其長度、特性或序列信息的生物聚合物。分析物可以是生物聚合物，諸如脫氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白質(zhì)或多肽。目標(biāo)DNA可以是單鏈或雙鏈的。在一些實(shí)施例中，分析物是已雜交了探針的生物聚合物。
DNA是包含生命過程中所需的所有基因組信息的基本分子。RNA分子在稱為轉(zhuǎn)錄的過程中形成為DNA鏈的互補(bǔ)拷貝。然后在稱為轉(zhuǎn)譯的過程中基于RNA模式由氨基酸形成蛋白質(zhì)。在這些分子中的每個(gè)分子中能夠找到的共同關(guān)系是它們都是使用基于所獲得的生物聚合物最終工作的最后目的按照各種序列串在一起的一小群構(gòu)件(諸如，堿基或氨基酸)構(gòu)造的。
例如，如美國專利公開No. 2007/0190542中所公開的那樣準(zhǔn)備用于分析的分析物，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。參照?qǐng)D5，示意性地描述了 DNA分子500，并且可看到DNA 分子500構(gòu)造為彼此反平行地定位的兩個(gè)鏈505、510。這兩個(gè)相對(duì)鏈505、510中的每個(gè)鏈順序地由重復(fù)的多組核苷酸515形成，其中每個(gè)核苷酸515包括磷酸基、2-脫氧核糖和四種含氮堿基之一。含氮堿基包括胞核嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。DNA 鏈505按照從所謂5'或“五撇”端到所謂3'或“三撇”端的特定方向被讀取。類似地，如圖6中示意性所述，RNA分子600是多核苷酸鏈，它與DNA 500的鏈的區(qū)別在于它具有替代脫氧核糖的核糖和替代胸腺嘧啶堿基(T)的尿嘧啶堿基(U)。
傳統(tǒng)上，當(dāng)在這些有機(jī)分子中確定堿基515的特定排列并由此確定分子的序列時(shí)，使用稱為雜交的過程。雜交過程是兩個(gè)遺傳序列彼此的會(huì)合或結(jié)合。這個(gè)過程是可預(yù)測(cè)的過程，因?yàn)榉肿又械膲A基515彼此不共享相同的親和性。T (或U)堿基喜好與A堿基結(jié)合，而C堿基喜好與G堿基結(jié)合。通過存在于相對(duì)堿基對(duì)之間的氫鍵促成這種結(jié)合。例如， 在A堿基和T (或U)堿基之間存在兩個(gè)氫鍵，而在C堿基和G堿基之間存在三個(gè)氫鍵。
隨后用于在關(guān)注的分子中確定和識(shí)別這些堿基515的序列的主要工具是雜交寡核苷酸，通常稱為探針700。如圖7中所示，DNA探針700是具有已知長度和序列構(gòu)成的DNA 序列。探針700可以具有取決于它們包括的堿基515的數(shù)量的任何長度。例如，包括六個(gè)堿基515的探針700稱為6-mer，其中探針700中的六個(gè)堿基515中的每個(gè)堿基可以是已知四種天然堿基類型A、T(U)、C或G中的任何一種，替代地可包括非天然堿基。在這個(gè)方面，庫中的探針700的總數(shù)取決于每個(gè)探針700內(nèi)包含的堿基515的數(shù)量并且由公式414 的η次冪)確定，其中η等于每個(gè)探針700中的堿基515的總數(shù)。因此，探針庫的尺寸的一般表達(dá)表示為4n n-mer探針700。為了說明的目的，在6-mer探針的情況下，可能的唯一可識(shí)別探針組合的總數(shù)包括4、4的6次冪)或4096個(gè)唯一 6-mer探針700。還應(yīng)該注意的是，包括非天然堿基允許產(chǎn)生按照擴(kuò)展探針識(shí)別的庫的范圍的通用性的方式在其中具有空格或通配符的探針。也可以使用包括與天然堿基組成模式的通用堿基的探針，例如美國專利No. 7，071，324,No. 7，034, 143和No. 6，689，563中描述的探針，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。
當(dāng)在適當(dāng)條件下利用序列選擇探針培養(yǎng)目標(biāo)生物分子(諸如，單鏈DNA)時(shí)，探針在特定部位雜交或結(jié)合到該生物分子。確定雜交部位的相對(duì)位置對(duì)于構(gòu)造目標(biāo)生物分子的圖譜和識(shí)別目標(biāo)分子而言很有用。
當(dāng)待分析的生物聚合物是雙鏈DNA 500時(shí)，如圖8中所述的使用探針700的雜交的過程首先要求在稱為變性的過程中準(zhǔn)備生物聚合物鏈。變性是通常通過應(yīng)用熱量或化學(xué)品完成的過程，其中原始雙鏈DNA的兩個(gè)鏈之間的氫鍵斷裂，留下單鏈DNA，該單鏈DNA的堿基可用于氫鍵結(jié)合。在生物聚合物800變性之后，把單鏈探針700引入到生物聚合物800 以定位生物聚合物800的具有與探針700中發(fā)現(xiàn)的序列互補(bǔ)的堿基序列的部分。為了使生物聚合物800與探針700雜交，變性的生物聚合物800和具有已知序列的多個(gè)探針700都被引入到溶液中。溶液優(yōu)選地是離子溶液，更優(yōu)選地是含鹽溶液。攪動(dòng)該混合物以促進(jìn)探針700沿其具有匹配的互補(bǔ)序列的部分結(jié)合到生物聚合物800。一旦生物聚合物鏈800和探針700已雜交，鏈800被引入到測(cè)序裝置的一個(gè)室內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，盡管可以在把生物聚合物鏈800所述室內(nèi)之前完成雜交，但也可以在這些室中的一個(gè)室中執(zhí)行雜交。在這種情況下，在把變性的生物聚合物加入到cis室之后，還把包含具有已知序列的探針700的一滴緩沖溶液加入到cis室并且在雜交的生物聚合物移位之前使其與生物聚合物800雜交。
作為分析物制備的特定例子，在存在探針的選擇的情況下并且在50mM氯化鉀和 IOmM Tris-HCl的緩沖溶液(pH 8.3)中，可以把核苷酸樣本(諸如，DNA或RNA)加熱到變性溫度，對(duì)于DNA而言通常大于90°C并且對(duì)于RNA而言通常在60_70°C之間?？梢栽赾is 室中或者在把分析物放入該室中之前完成雜交。核苷酸鏈和探針的混合物隨后冷卻以允許引物結(jié)合，溫度取決于探針的長度和構(gòu)成。例如，6-核苷酸探針將會(huì)冷卻到室溫或更低。在穿過流體通道以進(jìn)行分析之前，可以允許核苷酸鏈和探針在低溫退火達(dá)5分鐘。在沒有不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定精確的溫度。
參照?qǐng)D1，在一些實(shí)施例中，當(dāng)分析物125(例如，生物聚合物)位于流體通道中時(shí)， 與感測(cè)電極115A、115B之間的體積對(duì)應(yīng)的電信號(hào)由感測(cè)電極115A、115B檢測(cè)。當(dāng)生物聚合物進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，記錄電信號(hào)的變化。參照?qǐng)D10，當(dāng)分析物進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電信號(hào)在時(shí)間點(diǎn)T1線性增加。當(dāng)感測(cè)電極之間的體積被完全填滿時(shí)，該信號(hào)保持基本恒定。當(dāng)分析物離開感測(cè)電極之間的體積時(shí)，該信號(hào)在時(shí)間點(diǎn)T4返回到基線。感測(cè)電極構(gòu)造為連接到用于捕捉與感測(cè)電極之間的體積對(duì)應(yīng)的電信號(hào)的測(cè)量工具(例如，電壓表)。由測(cè)量工具捕捉的電信號(hào)可以由數(shù)據(jù)收集裝置(例如，斯坦福研究儀器SIM970電壓表)記錄為時(shí)間的函數(shù)?？捎涗涬妷盒盘?hào)變化之間的時(shí)間間隔?；€上方的電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間可指示分析物的存在。如圖9中時(shí)間點(diǎn)T2和T3之間所示的基線上方的另一增加可指示與分析物雜交的探針的存在。由于噪聲以及長的分析物(諸如，DNA)中通常具有小的彎曲部分的事實(shí)，電信號(hào)可具有波動(dòng)。當(dāng)具有彎曲的部分進(jìn)入到感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電信號(hào)可稍微增加，然后當(dāng)該彎曲部分離開感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電信號(hào)可稍微減小。因此可能需要電信號(hào)的校準(zhǔn)以確定長度。為了確定分析物的長度，可以利用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(例如，具有已知不同長度的生物聚合物)校準(zhǔn)該系統(tǒng)以確定每個(gè)生物聚合物長度的脈沖持續(xù)時(shí)間和速度。在一致的電壓和電解質(zhì)條件下，這種數(shù)據(jù)可用于產(chǎn)生使分析物的脈沖持續(xù)時(shí)間與其長度關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
類似地，電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間可用于確定第一多個(gè)探針的雜交的位置和生物聚合物上的兩個(gè)探針之間的距離。通過使用感測(cè)電極可以檢測(cè)與流體通道的感測(cè)電極之間的體積對(duì)應(yīng)的檢測(cè)的電信號(hào)。如圖9中時(shí)間點(diǎn)T1所示，電信號(hào)最初可在生物聚合物移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)變化，并且當(dāng)生物聚合物的包括雜交探針的部分移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)在T2進(jìn)一步變化。檢測(cè)的電信號(hào)可指示沿生物聚合物的雜交探針的位置?？煞治鲭娦盘?hào)的變化和變化的持續(xù)時(shí)間以確定沿生物聚合物的長度的具有已知序列特異性的探針的位置。探針之間的距離可基于代表雜交探針的電壓尖脈沖之間的持續(xù)時(shí)間，就如同尖脈沖的持續(xù)時(shí)間用于確定生物聚合物長度一樣。例如，當(dāng)確定雜交探針之間的距離時(shí)，可以考慮電壓信號(hào)的平均值。如果異常值在很大程度上偏離對(duì)于同一分子獲得的其它測(cè)量結(jié)果，則可以排除這些異常值?？梢砸砸曈X方式或者借助執(zhí)行本文描述的分析的計(jì)算機(jī)程序來完成這種分析。
探針之間的距離的計(jì)算可如下用于確定生物聚合物的序列?？梢酝ㄟ^使具有已知序列的第一多個(gè)探針與生物聚合物雜交來制備分析物，從而第一多個(gè)探針附接到生物分子的各部分以產(chǎn)生部分雜交的生物分子。分析物可布置在流體通道中?？裳亓黧w通道施加電勢(shì)以產(chǎn)生電泳力，從而分析物從流體通道的一端移位到流體通道的另一端。如上所述，電壓的變化用于檢測(cè)雜交的探針。
通過檢測(cè)第一多個(gè)探針的雜交，可以確定生物聚合物的序列的至少一部分。通過使用從生物聚合物的端部到探針的雜交部位的距離或者從探針的雜交部位到另一探針的雜交部位的距離，可以確定生物聚合物上的探針的位置。計(jì)算機(jī)算法可用于處理電信號(hào)以幫助確定生物聚合物的序列。
在一些實(shí)施例中，在第一探針之后或者與第一探針并行地，可以把具有用于目標(biāo)分子上的識(shí)別部位的特異性的第二多個(gè)探針與生物聚合物雜交以形成多個(gè)雜交，并且可以對(duì)隨后的多個(gè)探針重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)、分析和確定步驟。
生物聚合物可包括雙鏈生物聚合物目標(biāo)分子。通過使生物聚合物(即，目標(biāo)分子) 與具有用于目標(biāo)分子的識(shí)別部位的第一探針特異性的第一探針接觸以形成第一多個(gè)局部三元復(fù)合物，可以制備分析物。
電信號(hào)可用于檢測(cè)和記錄生物聚合物的復(fù)合和未復(fù)合的區(qū)域以創(chuàng)建第一多個(gè)探針的第一探針圖譜和針對(duì)隨后每組多個(gè)探針的隨后的探針圖譜，第一探針圖譜和隨后的探針圖譜中的每個(gè)探針圖譜包括關(guān)于雜交的第一多個(gè)探針和隨后每組多個(gè)探針的相對(duì)位置的信息。每個(gè)探針圖譜可包括指示探針之間的距離的一系列數(shù)字。這些數(shù)字可指示以堿基對(duì)計(jì)量的距離或以納米計(jì)量的距離。通過使用位置信息和/或交迭探針結(jié)合序列和位置信息的組合整理至少兩個(gè)探針序列，可以確定針對(duì)生物聚合物的至少一部分的候選序列。
第一探針圖譜和第二探針圖譜可包括關(guān)于每個(gè)探針的位置信息的誤差的信息。例如，每個(gè)指示的距離可具有關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)差，如IOOnm士 lOnm。另外，通過使用下面內(nèi)容的至少一項(xiàng)整理至少兩個(gè)探針序列可以確定候選序列(i)位置信息和與位置信息的誤差相關(guān)的參數(shù)或(ii)探針分子的交迭序列和位置信息以及位置信息的誤差的組合。
在序列號(hào)為12/243,451的美國專利申請(qǐng)中進(jìn)一步討論了通過探針的雜交形成三元復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)生物聚合物的測(cè)序，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。在Gracheva， Μ. Ε. ；Xiong, Α. ；Aksimentiev, Α. ；Schulten, K. ；Timp, G, Leburton, J. -P. Simulation of the electric response of DNA translocation through a semiconductor nanopore-capacitor, Nanotechnology 2006,17,622-633 ； 禾口 Zwolak, Μ· ；Di Ventra, Μ. Physical approaches to DNA sequencing and detection, Rev. Mod. Phy. 2008,80, 141-165中可找到關(guān)于檢測(cè)/測(cè)序的另外的背景信息，其全部內(nèi)容通過引用包含于此。
長度確定的例子 包括兩個(gè)微流體室、連接這兩個(gè)微流體室的一個(gè)或多個(gè)流體通道和沿每個(gè)流體通道的長度布置的感測(cè)電極對(duì)的感測(cè)裝置充滿了離子流體。通常，該流體可以是包含鹽的水。
未知長度的DNA的片段的多個(gè)拷貝可以被引入到連接到包含感測(cè)電極對(duì)的流體通道的微流體室之一。宏觀電極用于使DNA鏈以電泳方式從微流體室移動(dòng)到一個(gè)或多個(gè)流體通道。當(dāng)DNA進(jìn)入流體通道時(shí)，它呈現(xiàn)線性形態(tài)。它線性化的程度取決于許多因素。這些因素中的一些因素為例如DNA鏈的持續(xù)長度、溫度、離子條件以及流體通道的寬度和深度。
由電動(dòng)勢(shì)電極施加的電勢(shì)導(dǎo)致DNA鏈沿流體通道的長度移動(dòng)。當(dāng)片段沿流體通道移動(dòng)時(shí)，它穿過感測(cè)電極之間的體積。當(dāng)DNA的前緣進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，可記錄兩個(gè)感測(cè)電極之間的某一電氣特性(諸如，橫向通道電流或電勢(shì))的變化。記錄的信號(hào)包括時(shí)間戳和電勢(shì)或其它電氣性質(zhì)的變化的指示。也可以記錄該電氣性質(zhì)的值?？梢杂帽尘靶盘?hào)減去該值或者該值可以是絕對(duì)值?？梢杂捎?jì)算機(jī)產(chǎn)生列出感測(cè)電極之間的體積中發(fā)生的所有響應(yīng)和每個(gè)響應(yīng)的時(shí)間戳的表。計(jì)算機(jī)程序可隨后確定信號(hào)的持續(xù)時(shí)間。當(dāng)DNA鏈的后緣離開感測(cè)電極之間的體積時(shí)，電氣響應(yīng)通常返回到在DNA進(jìn)入該體積之前觀測(cè)到的值。電氣響應(yīng)的大小取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置；優(yōu)選地，電氣響應(yīng)等于系統(tǒng)的均方根噪聲的大小的至少3倍。
可以把校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用于測(cè)量的長度以便計(jì)算分析物的真實(shí)長度。例如，可以利用在與該分析物相同的條件下(例如，離子強(qiáng)度、溫度、PH)以電泳方式穿過流體通道的一系列已知長度的DNA片段校準(zhǔn)該裝置。這些片段優(yōu)選地跨越足夠的不同長度以覆蓋在實(shí)驗(yàn)中可能用于測(cè)量未知片段的長度的范圍。
DNA測(cè)序的例子 可以使已知或未知序列的目標(biāo)DNA變性。通常通過應(yīng)用熱量或化學(xué)品完成雙鏈體 DNA的變性，從而成對(duì)的鏈之間的氫鍵斷裂。利用已知序列和基線長度的探針培養(yǎng)變性的 DNA樣本，或者分割變性的DNA樣本以便利用多個(gè)探針進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)探針具有它們自己的在目標(biāo)DNA上的特異識(shí)別序列。為了把一個(gè)探針或多個(gè)探針雜交到它們的一個(gè)識(shí)別序列或多個(gè)識(shí)別序列，選擇培養(yǎng)的條件以使得一個(gè)探針或多個(gè)探針優(yōu)先于其它部位或不匹配部位結(jié)合到已知的特異識(shí)別部位。還選擇條件以使得與未結(jié)合的探針結(jié)合部位相比，變性的DNA 鏈上的探針結(jié)合部位中的更多的探針結(jié)合部位結(jié)合到探針。溶液可以是緩沖離子溶液?？梢詳噭?dòng)溶液以促進(jìn)探針的結(jié)合。溶液的溫度可以在培養(yǎng)期間變化。例如，培養(yǎng)的溫度可以在雜交過程期間緩慢冷卻。
一旦變性的目標(biāo)DNA已與一個(gè)探針或多個(gè)探針雜交，該樣本被引入到位于流體通道裝置一端的微流體室。流體通道裝置充滿了離子溶液，例如鹽溶液。該溶液也可以被緩沖。在把樣本引入到微流體室之前，可以去除過多的探針。凝膠過濾是用于從較長鏈的DNA 去除短探針的一種方法。替代地，可使用其它商業(yè)上可獲得的凈化方法。一旦具有雜交的探針的目標(biāo)DNA鏈已被引入到微流體室，經(jīng)由電動(dòng)勢(shì)電極施加電勢(shì)以將該DNA從微流體室驅(qū)動(dòng)到一個(gè)或多個(gè)流體通道。
當(dāng)進(jìn)入流體通道時(shí)，目標(biāo)DNA通常呈現(xiàn)線性化形態(tài)。流體通道越窄，迫使DNA線性化的程度越大。施加于宏觀電動(dòng)勢(shì)電極的電壓以電泳方式沿流體通道驅(qū)動(dòng)該DNA。當(dāng)DNA 和雜交的探針沿流體通道移動(dòng)時(shí)，它們進(jìn)入流體通道中的感測(cè)電極之間的體積。
在不存在DNA的情況下，感測(cè)電極之間的體積可僅包含離子溶液并且具有在兩個(gè)感測(cè)電極之間測(cè)量的基線電勢(shì)差。當(dāng)DNA進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，這兩個(gè)感測(cè)電極之間測(cè)量的電勢(shì)變化，因?yàn)镈NA具有與離子溶液的電導(dǎo)率不同的電導(dǎo)率。當(dāng)DNA進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，這兩個(gè)感測(cè)電極之間的通道的電導(dǎo)率通常相對(duì)于在感測(cè)電極之間僅存在離子流體時(shí)的電導(dǎo)率減小。當(dāng)還具有雜交到其上的探針的DNA的部分進(jìn)入感測(cè)電極之間的體積時(shí)，該電勢(shì)進(jìn)一步變化。
當(dāng)分子穿過感測(cè)電極之間時(shí)，監(jiān)測(cè)的電壓改變可檢測(cè)的并且可測(cè)量的量。電極檢測(cè)并記錄這種電壓的變化作為時(shí)間的函數(shù)。這些電壓的變化是在任何給定時(shí)間正在穿過感測(cè)電極之間的分子的相對(duì)直徑的結(jié)果。例如，具有雜交到其上的探針的生物分子的部分是未雜交并因此沒有探針的生物分子的部分的直徑的兩倍。
這種穿過感測(cè)電極之間的生物分子的體積的相對(duì)增加弓I起感測(cè)電極之間的電阻的臨時(shí)增加，從而導(dǎo)致可測(cè)量的電壓變化。當(dāng)生物分子的包括探針的部分穿過感測(cè)電極之間時(shí)，進(jìn)一步阻礙了電流，從而在結(jié)合部分穿過期間在記錄的電壓中形成相對(duì)尖脈沖，該尖脈沖在雜交部分穿過之后再次減小。感測(cè)電極檢測(cè)并反映監(jiān)測(cè)的電流的這些變化。另外， 測(cè)量電壓變化的測(cè)量結(jié)果并將其記錄為時(shí)間的函數(shù)。結(jié)果，電阻的周期性中斷或變化指示作為相對(duì)或絕對(duì)位置的函數(shù)已知探針序列在哪里附接于生物分子。
當(dāng)DNA或目標(biāo)DNA上的探針進(jìn)入流體通道時(shí)，記錄電信號(hào)。該電信號(hào)包括時(shí)間戳和變化的電氣性質(zhì)的值?？梢杂帽尘靶盘?hào)減去該電氣性質(zhì)值或者該電氣性質(zhì)值可以是絕對(duì)值?？梢杂捎?jì)算機(jī)產(chǎn)生列出感測(cè)電極之間發(fā)生的所有響應(yīng)和每個(gè)響應(yīng)的時(shí)間戳的表。計(jì)算機(jī)程序可隨后確定生物聚合物的長度和生物聚合物上的雜交探針的位置。生物聚合物上的探針的位置可以按照納米、堿基對(duì)或總的生物聚合物長度的百分比來確定。
生物聚合物上的探針的位置能夠根據(jù)它與生物聚合物的端部的距離來確定。通過使用校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)確定生物聚合物的總長度可以完成這一點(diǎn)?？梢园焉锞酆衔镄盘?hào)的持續(xù)時(shí)間與校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較以便計(jì)算分析物的真實(shí)長度。例如，可以利用在與分析物相同的條件下(例如，離子強(qiáng)度、溫度、pH)以電泳方式穿過流體通道的一系列已知長度的DNA片段校準(zhǔn)該裝置。這些片段優(yōu)選地跨越足夠的不同長度以校準(zhǔn)感測(cè)電極從而測(cè)量未知片段的長度。
通過利用第二多個(gè)探針的隨后或者并行的雜交能夠確定更多序列，并且可以對(duì)隨后的多個(gè)探針重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)、分析和確定步驟。本文描述的設(shè)計(jì)融合了納米孔和流體通道
18技術(shù)并且對(duì)驅(qū)動(dòng)電泳力和檢測(cè)的信號(hào)去耦。與先前幾何形狀的情況相比，通過使用電壓感測(cè)并且通過直接在放置感測(cè)電極的基片上加工電壓放大器，該裝置可工作于更高的頻率。
所描述的本發(fā)明的實(shí)施例僅是示例性的，許多變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會(huì)是清楚的。所有這些變化和修改落在所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于分析物的電壓感測(cè)的裝置，該裝置包括 限定在基片中的流體通道；感測(cè)電極對(duì)，位于通道中以用于感測(cè)該通道中的電壓，該感測(cè)電極對(duì)包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極；以及電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)，位于流體通道的第一端和第二端，用于沿流體通道施加電勢(shì)， 其中所述流體通道包括納米通道或微米通道。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述基片包括從硅、二氧化硅、熔融硅石和砷化鎵選擇的材料。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述感測(cè)電極對(duì)和電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)中的每個(gè)包括從鉬、金、鉻、鈦、氯化銀、銀和石墨烯選擇的材料。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中第一感測(cè)電極位于流體通道的第一側(cè)上，第二感測(cè)電極位于流體通道的相對(duì)側(cè)上。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極中的每個(gè)感測(cè)電極位于流體通道的第一側(cè)上。
6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極中的每個(gè)感測(cè)電極橫跨流體通道。
7.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中第一感測(cè)電極橫跨流體通道，第二感測(cè)電極位于流體通道的一側(cè)上。
8.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)包括宏觀電極，該宏觀電極在流體通道中產(chǎn)生恒定、變化或振蕩的電泳力以用于位于流體通道中的分析物的移位。
9.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括測(cè)量工具，用于測(cè)量通過感測(cè)電極對(duì)感測(cè)的電壓。
10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述測(cè)量工具包括電壓表。
11.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括多個(gè)流體通道。
12.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括位于基片上的電壓放大器。
13.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述流體通道具有從Inm到5μπι的范圍選擇的寬度。
14.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述流體通道具有從Inm到5μ m的范圍選擇的深度。
15.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述流體通道具有從1μ m到IOcm的范圍選擇的長度。
16.一種用于檢測(cè)分析物的方法，該方法包括下述步驟 把分析物布置在流體通道中；沿流體通道施加電勢(shì)；使分析物從流體通道的第一端向流體通道的第二端移位；當(dāng)分析物移經(jīng)位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)時(shí)測(cè)量該感測(cè)電極對(duì)之間的電壓信號(hào)，該感測(cè)電極對(duì)包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一電極和第二電極， 其中所述流體通道包括納米通道或微米通道。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中沿流體通道施加電勢(shì)的步驟包括在流體通道中產(chǎn)生電泳力。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中使分析物移位的步驟包括使用壓力差。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中使分析物移位的步驟包括使用化學(xué)梯度。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析物包括從脫氧核糖核酸、核糖核酸和多肽選擇的生物聚合物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述生物聚合物包括單鏈分子。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分析物包括生物聚合物，該生物聚合物具有附接于它的至少一個(gè)探針。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述電壓信號(hào)在生物聚合物移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)變化，并且在生物聚合物的包括探針的部分移經(jīng)感測(cè)電極之間的體積時(shí)進(jìn)一步變化。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，還包括記錄電壓信號(hào)變化之間的時(shí)間。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間指示探針的存在，還包括使用該電壓信號(hào)確定生物聚合物上的兩個(gè)探針之間的距離。
26.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括使用電壓信號(hào)的變化的持續(xù)時(shí)間確定分析物的長度。
27.一種用于確定生物聚合物的序列的方法，該方法包括 制備包括生物聚合物的分析物；把分析物布置在流體通道中； 沿流體通道施加電勢(shì)；使分析物從流體通道的第一端向流體通道的第二端移位；當(dāng)分析物移經(jīng)位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)時(shí)測(cè)量該感測(cè)電極對(duì)之間的電壓信號(hào)，該電壓信號(hào)對(duì)應(yīng)于沿生物聚合物的位置，該感測(cè)電極對(duì)包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一電極和第二電極，其中所述流體通道包括納米通道或微米通道。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中沿流體通道施加電勢(shì)的步驟包括在流體通道中產(chǎn)生電泳力。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中使分析物移位的步驟包括使用壓力差。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中使分析物移位的步驟包括使用化學(xué)梯度。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中制備分析物的步驟包括使生物聚合物與探針雜、-父。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中電壓信號(hào)的變化對(duì)應(yīng)于沿包含探針的雜交的生物聚合物的位置。
33.如權(quán)利要求27所述的方法，還包括使用計(jì)算機(jī)算法處理電壓信號(hào)以重構(gòu)生物聚合物的序列。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述生物聚合物包括雙鏈生物聚合物目標(biāo)分子。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中制備分析物的步驟包括使目標(biāo)分子與具有用于目標(biāo)分子的識(shí)別部位的第一探針特異性的第一探針接觸以形成第一多個(gè)局部三元復(fù)合物， 第一探針具有第一預(yù)測(cè)識(shí)別部位序列。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，還包括使用電壓信號(hào)確定第一多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述位置信息包括與兩個(gè)局部三元復(fù)合物之間的空間距離對(duì)應(yīng)的參數(shù)。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中制備分析物的步驟還包括使目標(biāo)分子與具有用于目標(biāo)分子的識(shí)別部位的第二探針特異性的第二探針接觸以形成第二多個(gè)局部三元復(fù)合物，第二探針具有第二預(yù)測(cè)識(shí)別部位序列。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，還包括使用電壓信號(hào)確定第二多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，還包括排列至少第一多個(gè)局部三元復(fù)合物和第二多個(gè)局部三元復(fù)合物的位置信息以確定目標(biāo)的DNA序列。
41.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述生物聚合物包括雙鏈核酸目標(biāo)分子，該雙鏈核酸目標(biāo)分子具有沿其序列布置的多個(gè)結(jié)合部位。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中制備分析物的步驟包括把具有第一序列特異性的多個(gè)探針分子加入到雙鏈核酸目標(biāo)分子。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，還包括培養(yǎng)目標(biāo)分子和具有第一序列特異性的探針分子，以實(shí)現(xiàn)第一探針分子優(yōu)先結(jié)合到目標(biāo)分子的第一結(jié)合部位和第二結(jié)合部位。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，還包括使用電壓信號(hào)測(cè)量與第一結(jié)合部位和第二結(jié)合部位之間的距離相關(guān)的參數(shù)。
45.如權(quán)利要求27所述的方法，其中制備分析物的步驟包括使生物聚合物與第一探針接觸以在第一探針針對(duì)其具有已知特異性的生物聚合物的識(shí)別部位產(chǎn)生至少一個(gè)探針目標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)剩下第一探針針對(duì)其不具有特異性的生物聚合物的未復(fù)合的區(qū)域。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中制備分析物的步驟還包括使生物聚合物與第二探針接觸以在第二探針針對(duì)其具有已知特異性的生物聚合物的識(shí)別部位產(chǎn)生至少一個(gè)探針目標(biāo)復(fù)合物，同時(shí)剩下第二探針針對(duì)其不具有特異性的未復(fù)合的區(qū)域。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，還包括使用電壓信號(hào)檢測(cè)和記錄生物聚合物的復(fù)合和未復(fù)合的區(qū)域以創(chuàng)建第一探針的第一探針圖譜和第二探針的第二探針圖譜，第一探針圖譜和第二探針圖譜包括關(guān)于探針的雜交的相對(duì)位置的信息。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，還包括通過使用位置信息或探針分子的交迭序列和位置信息的組合整理至少兩個(gè)探針序列，確定候選序列。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，其中第一探針圖譜和第二探針圖譜還包括關(guān)于每個(gè)探針的位置信息的誤差的信息。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，還包括通過使用位置信息和與位置信息的誤差相關(guān)的參數(shù)或探針分子的交迭序列和位置信息以及位置信息的誤差的組合整理至少兩個(gè)探針序列，確定候選序列。
全文摘要
提供了用于檢測(cè)分析物的裝置和方法。用于分析物的電壓感測(cè)的裝置(100)可包括限定在基片中的流體通道(105)；感測(cè)電極對(duì)(115A、115B)，位于流體通道中以用于感測(cè)該流體通道中的電壓；以及電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)(110、110′)，用于沿流體通道施加電勢(shì)。所述感測(cè)電極對(duì)可包括位于沿流體通道的長度的兩個(gè)分離位置的第一感測(cè)電極和第二感測(cè)電極，所述電動(dòng)勢(shì)電極對(duì)可位于流體通道的第一端和第二端。所述流體通道可包括納米通道或微米通道。用于檢測(cè)分析物的方法可包括下述步驟把分析物布置在流體通道中；沿流體通道施加電勢(shì)以在流體通道中產(chǎn)生電泳力，從而使分析物從流體通道的第一端向流體通道的第二端移位；當(dāng)分析物移經(jīng)位于流體通道中的感測(cè)電極對(duì)時(shí)測(cè)量該感測(cè)電極對(duì)之間的電壓信號(hào)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102186989SQ200980140663
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者凌新生, B·布蘭迪, J·S·奧利弗, M·尤茲, L·帕特羅塞安 申請(qǐng)人:納伯塞斯股份有限公司