專利名稱：用于dna提取的方法和試劑盒的制作方法
用于DNA提取的方法和試劑盒前言本教導(dǎo)提供用于獲得高數(shù)量、高質(zhì)量的核酸并且精確地在短時(shí)間內(nèi)獲得核酸的組合物、方法和試劑盒。本教導(dǎo)一般涉及從生物材料中分離核酸，以使所述核酸與下游應(yīng)用中的使用相適應(yīng)(compatible with)的方法。在各種實(shí)施方式中，本教導(dǎo)涉及多羥基聚合物和洗滌劑用于將核酸與具有親水表面的磁性顆粒結(jié)合、將核酸從所述磁性顆粒釋放并且通過使用數(shù)種緩沖液提取核酸的用途。在一些實(shí)施方式中，提供了用于從生物材料中分離DNA 的試劑盒。本教導(dǎo)的提取和純化方法提供了用于從生物樣品、食品樣品、水樣品、環(huán)境樣品、 農(nóng)業(yè)樣品、生物藥物樣品或者藥物樣品中獲得核酸(例如基因組DNA)的有用方法，所述核酸可用于下游應(yīng)用中，例如所述生物材料、食品材料、水材料、環(huán)境材料、農(nóng)業(yè)材料、生物藥物材料或者藥物材料來源的基因分型、檢測(cè)、定量和鑒定，其中采用分子生物學(xué)方法，例如 PCR0所提供的緩沖液系統(tǒng)在提取保持DNA完整性的高數(shù)量DNA中是獨(dú)特的。其提供了高效率DNA提取并去除了 PCR抑制劑。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)的液體處理系統(tǒng)，可使用于提取和純化核酸的程序(procedure)完全自動(dòng)化。本文所用的標(biāo)題部分只是用于編排目的，不理解為以任何方式限制所描述的主題。本申請(qǐng)中所引用的所有文獻(xiàn)和類似材料，包括但不限于專禾I』、專利申請(qǐng)、文章、書籍和協(xié)議，不管此類文獻(xiàn)和類似材料的形式如何，都以全文通過引用明確并入本文，用于任何目的。附圖本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解下文所描述的附圖只用于說明目的。附圖并無意以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。

圖1是說明如本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式中所描述的DNA分離和純化的方法的示意圖。圖2說明如實(shí)施例6中所描述的DNA分離和純化的DNA產(chǎn)率，其中按照實(shí)施例4 中所描述的方法，從細(xì)胞計(jì)數(shù)為1562-50000的培養(yǎng)的Raji細(xì)胞分離基因組DNA。圖3說明如實(shí)施例7中所描述的DNA分離和純化的DNA產(chǎn)率，其中按照實(shí)施例4 中所描述的方法，從細(xì)胞計(jì)數(shù)為3500-110000的培養(yǎng)的K562細(xì)胞分離基因組DNA。圖4說明如實(shí)施例13中所描述的從基材中分離和純化DNA后獲得的基因分型分布(genotyping profiles)，其中按照實(shí)施例11的方法從生物樣品中分離基因組DNA，并使用Identifier 試劑盒進(jìn)行處理，用于基因分型。圖5，在抑制劑的存在下，(加入)到洗滌溶液中的洗滌劑添加劑對(duì)從干燥于粗斜紋布(denim)上的血液中提取DNA的影響。圖6，在抑制劑的存在下，(加入)到洗滌溶液中的洗滌劑添加劑對(duì)從干燥于粗斜紋布上的血液中去除抑制劑的效率的影響。各種實(shí)施方式的描述雖然結(jié)合各種實(shí)施方式來描述本教導(dǎo)，但并無意將本教導(dǎo)限制于此類實(shí)施方式。相反，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，本教導(dǎo)涵蓋了各種替代、修改和等同物。本說明書中所用的絕大多數(shù)詞語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)為的那些詞語的含義。 本說明書中具體定義的詞語具有本教導(dǎo)上下文中提供的整體含義和如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。在詞語或短語的本領(lǐng)域所理解定義與本說明書中具體教導(dǎo)的該詞語或短語的定義相沖突的情況下，應(yīng)以本說明書為準(zhǔn)。本文所用的標(biāo)題只是為了方便起見，并不理解為以任何方式進(jìn)行限制。本文所用的“DNA”指本領(lǐng)域所理解的各種形式的脫氧核糖核酸，例如基因組DNA、 cDNA、分離的核酸分子、載體DNA和染色體DNA?！昂怂帷敝溉魏涡问降囊环N或多種核酸分子、DNA或RNA(核糖核酸)。本文所用的術(shù)語“分離的核酸分子”或“分離的核酸”指已從其天然環(huán)境中脫離(remove)的核酸分子(任何形式的DNA或RNA)。分離的核酸分子的一些實(shí)例為含于載體中的重組DNA分子；保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子；部分或基本純化的核酸分子；獲得自法醫(yī)樣品和其它樣品的核酸，所述其它樣品包括生物材料，例如血液、精液、唾液、皮膚組織等，食品樣品，包括但不限于肉、魚、水果、蔬菜、啤酒、葡萄酒、蛋、 奶等，以及植物、動(dòng)物、人或環(huán)境來源的樣品，水樣品，環(huán)境樣品，農(nóng)業(yè)樣品，生物藥物樣品， 藥物樣品，存在于用于制備或儲(chǔ)存食品、飲料、水、藥物產(chǎn)品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品或奶制品的原材料、設(shè)備、產(chǎn)品或工藝中的環(huán)境樣品，存在于臨床樣本或者用于處理人或動(dòng)物的設(shè)備、固定裝置(fixtures)或產(chǎn)品中的和存在于臨床樣品或臨床環(huán)境中的環(huán)境樣品；以及合成的DNA 分子?！胺蛛x”的核酸可以不含在取得所述核酸的有機(jī)體的基因組DNA中天然位于所述核酸側(cè)翼的序列(即位于所述核酸5 ‘和3’端的序列)。此外，“分離”的核酸分子(例如cNDA 分子)當(dāng)通過重組技術(shù)制備時(shí)，可以基本不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)， 可基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”(或“PCR”)指一種技術(shù)，其中使用變性、用引物退火以及用DNA 聚合酶延伸的重復(fù)循環(huán)來將靶DNA序列的拷貝數(shù)擴(kuò)增大約IO6倍或更多。用于擴(kuò)增核酸的 PCR方法涵蓋于美國(guó)專利No. 4，683，195和4，683，202中，通過引用將其全文并入本文，用于描述該方法。任何PCR的反應(yīng)條件包括該反應(yīng)的化學(xué)組分及其濃度、反應(yīng)循環(huán)中使用的溫度、反應(yīng)的循環(huán)數(shù)目以及反應(yīng)循環(huán)的階段的持續(xù)時(shí)間。"PCR相適應(yīng)的(PCR-compatible) ”指任何組合物、溶液、化合物、試劑等，其與PCT 測(cè)定中的后續(xù)使用相適應(yīng)，且對(duì)酶促聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是相對(duì)非限制性的。如通過PCR結(jié)果與相關(guān)陽性和陰性對(duì)照的比較所證明的，PCR相適應(yīng)的產(chǎn)品顯示相對(duì)最小地抑制或者不抑制PCR擴(kuò)增。PCR測(cè)定可以包括但不限于DNA基因分型系統(tǒng)；用于DNA定量的TaqMan 或SYBR 綠色實(shí)時(shí)PCR測(cè)定；多重PCR測(cè)定，包括設(shè)計(jì)為對(duì)短串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行基因分型的那些。本文所用的“擴(kuò)增”指酶促增加特定核苷酸序列的量的方法。該擴(kuò)增并不限于但是通常由PCR來實(shí)現(xiàn)?！熬酆衔?Polymer) ”或“多種聚合物(polymers) ”指用于將核酸與具有親水表面的磁性顆粒結(jié)合，以及將核酸從所述磁性顆粒釋放的可溶性多羥基聚合物。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中描述了方法，其中可以從樣品中分離(s印arated)和 /或分離(isolated)核酸分子，并且在一些實(shí)施方式中，其中從所述方法制備的產(chǎn)物為核酸。在一些實(shí)施方式中，本教導(dǎo)的方法導(dǎo)致形成了包含分離的核酸的產(chǎn)物。
在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，可以從含有生物材料的樣品中分離和/或分離核酸分子，并且在一些實(shí)施方式中，從所述方法制備的產(chǎn)物為核酸。此類樣品的例子包括但不限于血液和血斑(blood stain)、唾液和唾液斑、頰細(xì)胞和頰拭子、精液和精斑、煙蒂、口香糖、碎牛肉(ground beef)、布里干酪(brie cheese)、生雞(raw chicken)、蝦、羅馬甜瓜、干燥嬰兒配制食品、全殼蛋、碎(ground)黑胡椒、干燥寵物食品、花生醬、橙汁、巴氏滅菌奶、苜蓿芽、烤牛肉、煙熏鮭魚、蛋黃醬、色拉調(diào)料、奶、冰激凌、腌培根、萵苣、香腸、甜菜 (beet trim)、果汁、菠菜、切達(dá)干酪(cheddar cheese)、原奶(raw milk)、牡蠣、蛤以及貝類 (mussels)。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中描述了方法，其中可以用包含可溶性多羥基聚合物和洗滌劑的起始溶液處理樣品，并加入可磁性吸引的顆粒，以便從所述樣品中回收核酸分子， 并且在一些實(shí)施方式中，通過施加磁場(chǎng)從樣品中回收核酸。在各種實(shí)施方式中，所述樣品可以包括一種或多種游離核酸；細(xì)胞；生物材料，例如頰拭子、被沾染的織物等。在本教導(dǎo)的另外實(shí)施方式中描述了其中可以從樣品中分離核酸的方法，其包括以下步驟用包含聚合物和洗滌劑的起始溶液處理樣品；向處理的樣品中加入懸浮的可磁性吸引的顆粒；以及通過施加磁場(chǎng)，分離經(jīng)由聚合物附著于可磁性吸引的顆粒的核酸。此類方法可以進(jìn)一步包括從可磁性吸引的顆粒釋放核酸的步驟。此類方法還可以進(jìn)一步包括在水溶液中洗脫核酸的步驟。然后可將如此獲得的核酸用于各種下游應(yīng)用中的任何種，例如定量、檢測(cè)以及特定核酸的基因分型或甚至生物物種的基因分型?？梢酝ㄟ^例如PCR擴(kuò)增進(jìn)行這些分析。作為一個(gè)實(shí)例，在法醫(yī)DNA分析中，可以從復(fù)合生物材料中獲得人的核DNA (nDNA)和/或基因組DNA，然后使用PCR進(jìn)行基因分型。作為另一個(gè)實(shí)例，DNA制劑可用于使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng) (如Quantifiler )對(duì)人DNA、或者更具體的男人DNA進(jìn)行定量，和/或使用系統(tǒng)(例如 AmpF/STR 試劑盒)進(jìn)行常染色體或Y染色體短串聯(lián)重復(fù)基因座的基因分型?；诖嬖谟跇悠分械腄NA的量，可以選擇將產(chǎn)生用于特定分析所需的最佳結(jié)果的特定基因分型系統(tǒng)。因此，為了最好地將核酸用于下游應(yīng)用中，以高產(chǎn)率產(chǎn)生產(chǎn)品的提取和分離方法，以及相對(duì)不含下游應(yīng)用(例如PCR)的抑制劑的方法均是特別合意的。作為一個(gè)實(shí)例，在獲取和處理過程中，典型的法醫(yī)證據(jù)樣品常常暴露于各種環(huán)境傷害中，這可導(dǎo)致被起抑制PCR作用的化合物污染，并且其因此對(duì)基因分型或其它分析的嘗試造成干擾。在DNA分離期間以及擴(kuò)增之前去除此類抑制劑是合意的。核酸應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)例是在食品加工和生物藥物制備的質(zhì)量控制中檢測(cè)污染性 DNA0在一個(gè)實(shí)例中，分離摻入(spiked into)漢堡中的大腸桿菌(E. coli)0157 :H7的DNA， 然后通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)。作為另一個(gè)實(shí)例，可以分離支原體(Mycoplasma)DNA，并通過靈敏性(sensitivity)比競(jìng)爭(zhēng)方法更高的解鏈曲線分析進(jìn)行檢測(cè)。由于要求保護(hù)的提取和分離方法產(chǎn)生極大的DNA回收，因此可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)時(shí)PCR方法以更高的靈敏性檢測(cè)存在于樣品中的DNA的量。通常將食品或飲料的一部分與適當(dāng)?shù)囊后w組合，所述液體包括但不限于水、緩沖溶液或培養(yǎng)基(包括但不限于選擇性培養(yǎng)基或富集培養(yǎng)基)。在一些實(shí)施方式中，食品是剁碎的、浸軟的、液化的、切丁的(diced)或者勻質(zhì)化的。在一些實(shí)施方式中，按照公開的方法，對(duì)大體積的樣品(例如但不限于100mL、250mL或更大的體積)進(jìn)行處理，以確定在原材料中是否存在一種或多種外源核酸。根據(jù)某些實(shí)施方式，通常將食品或飲料的一部分和適當(dāng)?shù)囊后w組合以形成稀釋懸浮液，例如但不限于約1 5、1 10或1 20(w/vol)的比率。在一些實(shí)施方式中，加入洗滌劑、乳化劑或兩者，以增強(qiáng)高脂食品的溶解度，所述高脂食品例如但不限于黃油和某些其它的奶制品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)用于懸浮食品或飲料的液體的選擇將至少部分取決于原材料(即，食品或飲料)和外源核酸(包括但不限于一種或多種感興趣的微生物)；并且食品/飲料與液體之比可以寬泛變化，條件是該懸浮液充分流動(dòng)以進(jìn)行處理，例如但不限于使其通過過濾介質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，將25克的固體或半固體食品與225mL合適的培養(yǎng)基組合。在一些實(shí)施方式中，將25mL的飲料或者液化或部分液化的食品與225mL合適的培養(yǎng)基組合。本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式涉及將核酸(例如基因組DNA)與磁性顆粒(即，可磁性吸引的顆粒或珠子)以然后可以在適當(dāng)?shù)乃詶l件下將結(jié)合的核酸釋放的形式有效結(jié)合。因此，這些教導(dǎo)的實(shí)施方式使核酸(例如基因組DNA)能夠從各種不同類型的生物材料中有效分離。此外，可以從少量或大量的生物材料中分離核酸(例如基因組DNA)，所述材料通常在實(shí)驗(yàn)室中處理，例如在基因分型分析中涉及的那些材料。本文所用的洗滌緩沖液或洗滌溶液包含陰離子洗滌劑(優(yōu)選為0. 至2% )和諸如異丙醇或乙醇之類的極性溶劑(優(yōu)選為50%至90%)的混合物，所述陰離子洗滌劑例如為N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、CTAB、N-十二烷基β -D-麥芽糖苷、壬?；?N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide) >Triton X"100和/或十二烷基硫酸鈉。任選地，洗滌溶液還可包含吐溫20、脫氧膽酸鹽和月桂酰肌氨酸鈉(lauroyl sarcosinate)(也稱作十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl))。圖5和圖6提供了洗滌緩沖液中的各種洗滌劑的比較。洗滌緩沖液在DNA結(jié)合后洗滌珠子，并且還去除DNA抑制劑。這些實(shí)施方式和本教導(dǎo)的其它特征將從下文描述中變得更加明顯。核酸分離系統(tǒng)本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式涉及系統(tǒng)，其順應(yīng)(amenable to)組裝于試劑盒中，用于在洗滌劑的存在下，將核酸(例如基因組DNA)經(jīng)由可溶性多羥基聚合物與具有親水表面的磁性顆粒結(jié)合，形成核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物，并且產(chǎn)生和分離此類復(fù)合物，其中所述核酸不直接與磁性顆粒結(jié)合。復(fù)合物的形成是這樣的聚合物俘獲核酸，聚合物附著于顆粒，并因此間接地將核酸與顆粒相連。各種實(shí)施方式包括裂解溶液，其引起細(xì)胞的裂解和核酸的釋放，同時(shí)保護(hù)核酸免于降解并去除PCR抑制劑。在本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式中，在洗滌溶液的存在下，核酸經(jīng)由復(fù)合物保持與磁性顆粒結(jié)合，復(fù)合物在所述洗滌溶液中被洗滌以去除污染物和抑制劑，并使得所述核酸順應(yīng)用于諸如PCR之類的下游應(yīng)用中。用于洗滌核酸分離物的任何污染物和抑制劑的溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且可包含例如洗滌劑和極性溶劑。在本教導(dǎo)的實(shí)施方式中，然后可以在水溶液(例如緩沖液)中釋放核酸，所述水溶液也與用于諸如PCR之類的下游應(yīng)用相適應(yīng)。本發(fā)明的方法中可以進(jìn)行多次洗滌，分別地或者與多次向樣品施加磁場(chǎng)一起進(jìn)行所述洗滌，以回收和/或分離核酸。標(biāo)準(zhǔn)核酸提取技術(shù)，包括細(xì)胞裂解以及核酸的洗滌和洗脫是本領(lǐng)域所熟知的， 并且除非另有說明，可以按照在例如以下文獻(xiàn)中所描述的各種技術(shù)來進(jìn)行DNA Typing Protocols :Molecular Biology and Forensic Analysis,第 1 片反，B. Budowle 等人編， Eaton Publishing Co. (2000) ；JM Butler，F(xiàn)orensic DNA Typing :Biology，Technology,and Gen etics of STR Markers，第 2 片反，Elsevier Academic Press (2005)；或者 P.Gill, “ Application of LowCopy Number DNA Profiling， “ Croatian Medical Journal，42 :229-232 頁(2001) ；FR Bieber 等人，“Isolation of DNAA from Forensic Evidence, ” Current Protocols in Human Genetics，增干丨J 26(2000) ；Forensic DNAProfiling Protocols， Methods in Molecular Biology,第 98 卷，PJ Lincoln 禾口 J. Thomson 編，Humana Press (1998)。本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式涉及核酸分離系統(tǒng)(例如用于基因組DNA)，其包含用于從生物樣品、食品樣品、水樣品、環(huán)境樣品、農(nóng)業(yè)樣品、生物藥物樣品或藥物樣品中提取核酸的試劑和方法。這些方法的實(shí)施方式可以包括在洗滌劑的存在下，從生物材料中裂解細(xì)胞形成核酸(如基因組DNA)與可溶性聚合物的非共價(jià)復(fù)合物，所述聚合物具有與可磁性吸引的顆粒表面相同或類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)；經(jīng)由聚合物與顆粒表面之間的相互作用，將核酸-聚合物復(fù)合物與磁性顆粒結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的核酸_聚合物-顆粒復(fù)合物；經(jīng)由包含洗滌劑和極性溶劑的洗滌緩沖液去除未結(jié)合的材料，例如PCR抑制劑；以及從所述顆粒釋放核酸，并在水溶液中洗脫核酸。申請(qǐng)人:已發(fā)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)柠}和極性溶劑的存在下，使用多羥基水溶性聚合物和洗滌劑改進(jìn)了核酸(例如基因組DNA)在可磁性吸引的顆粒表面上的結(jié)合和釋放效率。適當(dāng)?shù)目纱判晕念w粒的實(shí)例包括但不限于葡聚糖包被的Nanomag 磁性納米顆粒(magnetite nanoparticles)。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，以約2至約10mg/ml將葡聚糖包被的磁性納米顆粒加入到包含核酸的樣品中。所述可溶性聚合物和洗滌劑可稱為結(jié)合促進(jìn)劑(binding enhancer)。適當(dāng)?shù)亩嗔u基水溶性聚合物的一些實(shí)例為但不限于長(zhǎng)鏈分支的多糖，例如葡聚糖(如葡聚糖5，000, 000-40, 000, 000)、可溶性淀粉、糊精、纖維糊精、聚乙二醇(PEG)、肝素、糖原、短鏈纖維素、纖維素衍生物及其組合。適當(dāng)?shù)南礈靹┑囊恍?shí)例為但不限于N-月桂酰肌氨酸(NLS)；月桂酰肌氨酸鈉(lauroyl sarcosinate)，也稱作十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)，為衍生自肌氨酸的離子表面活性劑；十六烷基三甲基、溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六燒基三甲基、溴化銨 (cetyltrimethylammonium bromide) (CTAB)；脫氧膽酸鹽；十二烷基 β-D-麥芽糖苷；壬?；?N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)；十二烷基硫酸鈉；聚乙二醇對(duì)_(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯基醚(商品名為Triton X-l00)；及其組合。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合促進(jìn)劑包含l-5mg/ml范圍內(nèi)的葡聚糖和約5-約15%范圍內(nèi)的十二烷基肌氨酸鈉。適當(dāng)?shù)臉O性溶劑的一些實(shí)例為但不限于異丙醇、乙醇、丁醇及其組合。在一些實(shí)施方式中，極性溶劑包含約70%至約100%異丙醇。在一些實(shí)施方式中，可以將可磁性吸引的顆粒加入到包含核酸的樣品(例如細(xì)胞裂解物)中，同時(shí)加入結(jié)合促進(jìn)劑，形成懸浮液。之后可以將包含極性溶劑的溶液加入到該懸浮液中?；蛘?，在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，可以將包含結(jié)合促進(jìn)劑和極性溶劑的單一溶液加入到該懸浮液中。結(jié)合促進(jìn)劑、溶劑和細(xì)胞裂解物提供獨(dú)特的條件，以使核酸被俘獲在與可溶性聚合物的非共價(jià)復(fù)合物中，所述可溶性聚合物具有與磁性顆粒表面相同或類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果是被聚合物俘獲的核酸在非共價(jià)的核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物中有效地與磁性顆粒結(jié)合。該復(fù)合物在醇洗滌條件下是穩(wěn)定的，并且以后可以在標(biāo)準(zhǔn)低鹽緩沖液(例如含有低濃度的二價(jià)金屬離子螯合劑(例如EDTA)的Tris緩沖液)中容易地將核酸洗脫。 在一些實(shí)施方式中，核酸-聚合物與顆粒結(jié)合的這一階段可以通過冷卻(chill)加以輔助。此外，本教導(dǎo)提供了使用與極性溶劑(例如乙醇或異丙醇)混合的洗滌劑(例如但不限于N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、CTAB、N-十二烷基β -D-麥芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton Χ-100和/或十二烷基硫酸鈉)作為核酸-顆粒復(fù)合物的洗滌溶液， 以改進(jìn)下游應(yīng)用的抑制劑(例如PCR抑制劑)從結(jié)合于磁性顆粒的這些核酸中的去除。在核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物形成中，在被聚合物俘獲的核酸與磁性顆粒結(jié)合之后，可以向所述懸浮液施加磁場(chǎng)。該磁場(chǎng)可用于從懸浮液中去除核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物，形成復(fù)合物層(例如在管的底部或一側(cè))，并留下上清液?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的設(shè)備和方法(例如經(jīng)由Ambion (Austin,TX)磁力站)將磁場(chǎng)施加于樣品。之后可以從管中去除上清液。然后可任選洗滌核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物層，以去除殘余的污染物和/或PCR 抑制劑；然后，可以在不存在任何磁場(chǎng)的情況下，將核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物重懸浮于必需體積的適當(dāng)洗脫緩沖液中。用于分離核酸的適當(dāng)洗脫緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。 這使得核酸從核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物中釋放進(jìn)入到溶液中。可以再次向管施加磁場(chǎng)， 導(dǎo)致從懸浮液中去除磁性顆粒，例如到管(tube)的底部或一側(cè)，留下現(xiàn)在核酸溶解于其中的上清液?，F(xiàn)在可以通過用例如移液器收集上清液，從磁性顆粒分離再次溶解的核酸，同時(shí)所述顆粒被磁場(chǎng)保持于管的底部或一側(cè)。在這些方法中不需要對(duì)樣品進(jìn)行離心。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，然后可以從含有生物材料的生物樣品、食品樣品、水樣品、環(huán)境樣品、農(nóng)業(yè)樣品、生物藥物樣品或藥物樣品中分離核酸分子，并結(jié)合使用具有親水表面的磁性顆粒(例如磁性葡聚糖顆粒)從溶液中純化。磁性顆粒促進(jìn)的核酸分離和純化可用來極大地改進(jìn)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基于醇的沉淀的常規(guī)分離和純化核酸的方法。 可通過參考圖1來說明可通過這些教導(dǎo)修改的基于醇的分離和純化程序的實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例。樣品制備本文所述方法的實(shí)施方式可以包括將食品或飲料的一部分與適當(dāng)?shù)囊后w組合，所述液體包括但不限于水、緩沖溶液或培養(yǎng)基(非限制性包括選擇性培養(yǎng)基或富集培養(yǎng)基)。 在一些實(shí)施方式中，食品是剁碎的、浸軟的、液化的、切丁的或者勻質(zhì)化的。在一些實(shí)施方式中，按照公開的方法，對(duì)大體積(例如但不限于100mL、250mL或更大)的樣品進(jìn)行處理， 以確定在原材料中是否存在特定的微生物。根據(jù)某些實(shí)施方式，通常將食品或飲料的一部分和適當(dāng)?shù)囊后w組合以形成稀釋懸浮液，例如但不限于約1 5、1 10或1 20(W/vol) 的比率。在一些實(shí)施方式中，加入洗滌劑、乳化劑或兩者，以增強(qiáng)高脂食品的溶解度，所述高脂食品例如但不限于黃油和某些其它的奶制品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)用于懸浮食品或飲料的液體的選擇將至少部分取決于原材料(即，食品或飲料)和一種或多種感興趣的微生物；并且食品/飲料與液體之比可以寬泛變化，條件是該懸浮液充分流動(dòng)以進(jìn)行處理，例如但不限于使其通過過濾介質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，將25克的固體或半固體食品與 225mL合適的培養(yǎng)基組合。在一些實(shí)施方式中，將25mL的飲料或者液化或部分液化的食品與225mL合適的培養(yǎng)基組合。裂解溶液
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本文所述方法的實(shí)施方式可包括從存在于基材(例如頰拭子的棉花或沾染的織物)上的生物材料裂解細(xì)胞，以產(chǎn)生包含核酸的裂解物；從所述裂解物中去除基材；形成核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物，之后如上文所述，將核酸分離并洗脫。在一個(gè)實(shí)施方式中，裂解溶液可包含SDS、Tris緩沖液和NaCl，任選含有蛋白酶K ；在一些實(shí)施方式中，裂解溶液可包含 0. 0% -1% SDSUOOmM Tris 緩沖液和 2M NaCl。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，裂解溶液可包含硫氰酸胍(GuSCN)或鹽酸胍、 Tris ·Ηα、乙二胺四乙酸(EDTA)、消泡劑A和兩親性洗滌劑(例如二甲基氨基-丙烷磺酸酉旨(dimethylammonio-propane-1-sulfonate)(例如Zwittergent ，如Zwittergent 3-16，具有C16鏈)。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，裂解溶液包含3. 5-6M范圍內(nèi)的GuSCN、 10-150mM范圍內(nèi)的EDTA、100-500mM范圍內(nèi)的Tris 'HCUO. 005-0. 05%范圍內(nèi)的消泡劑A、 1-5%范圍內(nèi)的Zwittergent ，pH范圍為7. 2-8. 5。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，裂解溶液可以進(jìn)一步包含強(qiáng)還原劑，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)。因?yàn)閺?qiáng)還原劑起到水解和斷裂蛋白二硫鍵的作用，所以例如在生物材料為精子的情況下，這些是尤為有用的，這是因?yàn)樵撛噭┛梢云鸬剿獾鞍椎淖饔?，所述蛋白保持精子壁完整，并且其因此使得精子?xì)胞的裂解相對(duì)困難。在本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式中，可將裂解溶液加入到含有生物材料的樣品(并且任選地，對(duì)所述樣品進(jìn)行加熱一段時(shí)間，例如二十分鐘至兩個(gè)小時(shí))中，以便裂解細(xì)胞和將核酸釋放到裂解物中。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液可以為包含設(shè)計(jì)為有效裂解細(xì)胞(例如收集在棉拭子上的頰細(xì)胞)，同時(shí)還保護(hù)釋放的核酸免于降解的化合物的組合物。在一些實(shí)施方式中，裂解溶液進(jìn)一步包含確保釋放的核酸與用于下游測(cè)定(例如PCR測(cè)定、尤其DNA 基因分型系統(tǒng))相適應(yīng)的這樣的化合物。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，然后在裂解程序后，可以將磁性顆粒(例如葡聚糖磁性納米顆粒)、結(jié)合促進(jìn)劑和極性溶劑加入到包含核酸的裂解物中，生成其中形成核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物的懸浮液，如上文所述分離并洗脫核酸。結(jié)合溶液然后可將結(jié)合促進(jìn)劑加入到懸浮液中，所述結(jié)合促進(jìn)劑包含離子洗滌劑(例如N-月桂酰肌氨酸(NLS)或月桂酰肌氨酸鈉(也稱作十二烷基肌氨酸鈉， 為衍生自肌氨酸的離子表面活性劑)和水可溶性長(zhǎng)鏈分支的多糖(例如葡聚糖 5，000，000-40，000，000)。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合促進(jìn)劑可包含洗滌劑十六烷基三甲基、溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六燒基三甲基、溴化銨 (cetyltrimethylammonium bromide) (CTAB)、脫氧膽酸鹽、十二烷基 β-D-麥芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)、十二烷基硫酸鈉和聚乙二醇對(duì)-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚(商品名為THton x-l00)中的一種或多種。結(jié)合促進(jìn)劑還可以包含或者可選地包含其他水溶性聚合物，例如短鏈纖維素、纖維素衍生物、PEG、肝素、淀粉、糖原等?；蛘撸判灶w?？梢院徒Y(jié)合促進(jìn)劑在同一時(shí)間加入到裂解物中。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合促進(jìn)劑包含5-15%范圍內(nèi)的十二烷基肌氨酸鈉和l-5mg/ml范圍內(nèi)的葡聚糖?？蓪?例如乙醇、丁醇或異丙醇)的結(jié)合溶液加入到懸浮液中。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合溶液包含30-100%異丙醇?；蛘?，在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，可將包含結(jié)合促進(jìn)劑和結(jié)合溶液的單一溶液加入到懸浮液中。結(jié)合促進(jìn)劑、結(jié)合溶液和細(xì)胞裂解物提供了獨(dú)特的條件，以使核酸被俘獲在與可溶性聚合物(例如葡聚糖)的非共價(jià)復(fù)合物中，所述可溶性聚合物具有與磁性顆粒表面相同或類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果是聚合物俘獲的核酸在非共價(jià)的核酸-顆粒復(fù)合物中有效地與磁性顆粒結(jié)合。該復(fù)合物在醇洗滌條件(例如含乙醇的洗滌溶液)下是穩(wěn)定的，并且以后可以在標(biāo)準(zhǔn)低鹽緩沖液(例如含有低濃度的二價(jià)金屬離子螯合劑(如EDTA)的IOmM Tris緩沖液(pH8.0))中容易地洗脫核酸。在一些實(shí)施方式中，該結(jié)合階段可以通過冷卻來輔助一些類型的沉淀。洗滌溶液本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式涉及核酸分離系統(tǒng)(例如用于基因組DNA)，其包含用于從生物樣品、食品樣品、水樣品、環(huán)境樣品、農(nóng)業(yè)樣品、生物藥物樣品或藥物樣品中提取核酸的試劑和方法，并包含洗滌步驟以從所述樣品中去除PCR抑制劑。在洗滌步驟中使用的洗滌溶液為例如本領(lǐng)域所已知的(溶液)。在一些實(shí)施方式中，所述洗滌溶液的具體組分可以為濃度為70%-90%的乙醇。這些方法的實(shí)施方式可以包括形成核酸(如基因組DNA) 與可溶性聚合物的非共價(jià)復(fù)合物，所述聚合物具有與磁性顆粒的表面相同或類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)；經(jīng)由聚合物與顆粒表面之間的相互作用，將所述核酸_聚合物復(fù)合物與磁性顆粒結(jié)合， 從而形成穩(wěn)定的核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物；通過包含洗滌劑和極性溶劑的洗滌溶液試劑去除未結(jié)合的材料，例如PCR抑制劑；以及在水溶液中洗脫順應(yīng)用于諸如PCR之類的下游應(yīng)用中的核酸。在核酸-顆粒復(fù)合物的形成中，被俘獲的核酸與磁性顆粒結(jié)合之后，然后可以向所述懸浮液施加磁場(chǎng)。該磁場(chǎng)可用于從懸浮液中去除核酸-顆粒復(fù)合物，在管的底部或一側(cè)形成復(fù)合物層，并留下第一上清液。然后可從管中去除第一上清液。使用洗滌劑和極性溶劑的洗滌溶液來洗滌去除第一上清液后留下的核酸_聚合物-顆粒復(fù)合物層，幫助去除任何殘留的鹽、核苷酸、化學(xué)品、有機(jī)溶劑和樣品中的其它污染物，并且促進(jìn)去除下游應(yīng)用的抑制劑，例如PCR抑制劑。在各種實(shí)施方式中，可將洗滌溶液用作核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物的洗滌液，以去除PCR抑制劑和/或污染物。對(duì)分離和 /或純化期間洗滌核酸有用的溶液是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在一些實(shí)施方式中，將洗滌溶液加入到核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物中以產(chǎn)生洗滌懸浮液。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液包含十二烷基肌氨酸鈉和醇(例如乙醇、異丙醇和 70% (ν/ν)乙醇中的一種或多種)。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液包含洗滌劑，例如失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯(polysorbate 20)或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯 (polysorbate 80)。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液包含1-2M范圍內(nèi)的GuSCN、3_50mM范圍內(nèi)的EDTA、30-170mM范圍內(nèi)的Tris 'HCUO. 001-0. 02%范圍內(nèi)的消泡劑A、0. 3_2%范圍內(nèi)的Zwittergent 、30-45%范圍內(nèi)的異丙醇和0. 5-2%范圍內(nèi)的十二烷基肌氨酸鈉。所述核酸不溶于醇(例如異丙醇、乙醇和70% (ν/ν)乙醇)，并在洗滌期間保持為與聚合物及顆粒的穩(wěn)定復(fù)合物。因此，可劇烈(例如通過渦旋混合)進(jìn)行洗滌步驟，而沒有損失核酸的風(fēng)險(xiǎn)。之后可將樣品再次置于磁場(chǎng)前，可從所述復(fù)合物層中去除從洗滌懸浮液中分離出來的包含污染物的所得洗滌上清液。洗滌步驟之后，還可以按照第一次洗滌中的類似步驟進(jìn)行第二次洗滌步驟。在本教導(dǎo)的一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟后，如上文所述，將核酸分離并洗脫。
核酸提取和純化本教導(dǎo)的提取和純化方法提供了用于從生物樣品中獲得核酸(例如基因組DNA) 的有用方法，所述核酸可用于下游應(yīng)用中，例如基因分型、定量和生物材料來源的鑒定，其中利用了諸如PCR之類的分子生物學(xué)方法。本文實(shí)施例中所描述的示例性結(jié)果說明了本教導(dǎo)的核酸提取和純化方法的各種優(yōu)勢(shì)，其包括但不限于提供核酸(例如基因組DNA)制品， 所述核酸制品(a)可源自各種生物材料；(b)不含下游應(yīng)用(例如PCR擴(kuò)增)的可檢測(cè)抑制劑；(c)可以為濃縮形式；以及(d)順應(yīng)用于核酸分析(例如基因分型、定量、生物材料來源的檢測(cè)等)用的各種應(yīng)用中的任何種。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)液體處理系統(tǒng)，可使核酸的提取及純化用程序完全自動(dòng)化。此外，通過本教導(dǎo)的方法修改目前使用的標(biāo)準(zhǔn)醇沉淀程序(例如需要離心的那些程序)，可以提供數(shù)種明顯的益處。第一，本教導(dǎo)舉例說明的本文方法更快速——用于從分離的核酸復(fù)合物中去除溶液的修改程序只花費(fèi)約1-2分鐘，相比之下使用離心的常規(guī)方法花費(fèi)約10-30分鐘。第二，本文方法不依賴于離心設(shè)備，卻可用簡(jiǎn)單的磁性裝置來進(jìn)行。第三，本文方法更易于適合自動(dòng)化。例如，可將大量的管放置在大型電磁體上，使用例如多通道移液器具可同時(shí)分離來自這些管中的所有核酸。第四，本教導(dǎo)的方法對(duì)于洗滌核酸_聚合物-磁性顆粒復(fù)合物的步驟(例如為了去除任何殘留的鹽、核苷酸或有機(jī)溶劑(例如酚))尤其有效，因?yàn)樵诒窘虒?dǎo)中，洗滌步驟不需要離心，因此可以迅速進(jìn)行。此外，不存在材料損失的風(fēng)險(xiǎn)或存在最小的材料損失風(fēng)險(xiǎn)，基于離心的常規(guī)方法可發(fā)生材料損失(其中粒狀沉淀(pellet)常常在此類洗滌期間從管的底部脫離)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，對(duì)本教導(dǎo)的各種實(shí)施方式可以進(jìn)行多種變化和修改，而不背離這些教導(dǎo)的精神。所有此類變化有意落入這些教導(dǎo)的范圍內(nèi)。如本文所公開和要求保護(hù)的本教導(dǎo)的所有組合物和方法按照本公開內(nèi)容，無需過度實(shí)驗(yàn)，即可制備和實(shí)施。盡管已經(jīng)以具體實(shí)施方式
對(duì)這些教導(dǎo)的組合物和方法進(jìn)行描述， 但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的是，可對(duì)所述組合物和方法，以及在本文所述方法的步驟中或者步驟順序中，進(jìn)行改變，而不背離這些教導(dǎo)的概念和范圍。更具體地，顯然，可用化學(xué)及生理學(xué)上均相關(guān)的某些試劑代替本文所述試劑，但將達(dá)到相同或類似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類類似的替代和修改都被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例本教導(dǎo)的各方面可根據(jù)以下實(shí)施例得到進(jìn)一步理解，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。實(shí)施例1將人的體液樣品置于2. Oml容量的聚丙烯管中。所述樣品為2 μ 1血液、10 μ 1唾液和2μ1精液。將每個(gè)樣品與裂解溶液混合，以便裂解細(xì)胞。裂解溶液包含0.0% -1% SDSUOOmM Tris緩沖液和2Μ NaCl，任選含有蛋白酶K。將裂解混合物在約60°C至80°C范圍內(nèi)的溫度下，在搖動(dòng)或不搖動(dòng)條件下孵育約40分鐘至1小時(shí)的時(shí)段。之后使釋放自該生物材料的基因組DNA與具有葡聚糖的多羥基基團(tuán)的磁性顆粒結(jié)合。每一樣品的結(jié)合混合物含有細(xì)胞裂解物；包含濃度為約5-20mg/ml的磁性顆粒的10 μ 1至20 μ 1懸浮液；以及約150至300 μ 1極性化合物，例如異丙醇、乙醇和/或PEG。 然后通過向結(jié)合混合物施加磁場(chǎng)，將與磁性顆粒結(jié)合的DNA從該混合物中物理分離。然后，用基于醇的洗滌溶液(90%乙醇)洗滌仍與復(fù)合物中的磁性顆粒結(jié)合的 DNA。通過使用磁場(chǎng)，將DNA-磁性顆粒復(fù)合物再次從洗滌混合物中物理分離。重復(fù)洗滌步驟一至兩次。在該洗滌步驟中去除俘獲在DNA-磁性顆粒復(fù)合物中的PCR抑制劑和其他大分子。之后通過將DNA-顆粒復(fù)合物懸浮于10至100 μ 1水溶液(例如不含DNA的水或例如Tris-HCl的中性緩沖液)中，將DNA從磁性顆粒上釋放，并在約50至75°C范圍內(nèi)的溫度下孵育該DNA釋放混合物。然后通過使用磁場(chǎng)將釋放的基因組DNA與磁性顆粒物理分離。 將如此獲得的基因組DNA制品在4°C下短期儲(chǔ)存，或在-20°C下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)DNA進(jìn)行定量。表1中示出了典型關(guān)于人的基因組DNA的結(jié)果。表 1
權(quán)利要求
1.非共價(jià)復(fù)合物，其包含核酸、聚合物和可磁性吸引的顆粒，以形成核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物。
2.制備產(chǎn)品的方法，其中所述產(chǎn)品包含核酸，所述方法包括以下步驟(a)用包含聚合物和洗滌劑的起始溶液處理樣品；(b)施加懸浮的可磁性吸引的顆粒；(c)通過施加磁場(chǎng)回收所述核酸。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸源自生物材料樣品，所述樣品包括血液、血斑、唾液、唾液斑、頰細(xì)胞、頰拭子、精液、精斑、煙蒂、口香糖、碎牛肉、布里干酪、生雞、蝦、羅馬甜瓜、干燥嬰兒配制食品、全殼蛋、碎黑胡椒、干燥寵物食品、花生醬、橙汁、巴氏滅菌奶、 苜蓿芽、烤牛肉、煙熏鮭魚、蛋黃醬、色拉調(diào)料、奶、冰激凌、腌培根、萵苣、香腸、甜菜、果汁、 菠菜、切達(dá)干酪、原奶、牡蠣、蛤或貝類中的一種或多種。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述可磁性吸引的顆粒包括葡聚糖包被的磁性納米顆粒。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纖維素、纖維素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纖維糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其組合中的一種或多種。
6.權(quán)利要求所述2的方法，其中所述洗滌劑包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、 脫氧膽酸鹽、CTAB、脫氧膽酸鹽、十二烷基β-D-麥芽糖苷、壬?；?N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇對(duì)-(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸鈉、及其組合中的一種或多種。
7.制備產(chǎn)品的方法，其中所述產(chǎn)品包含核酸，所述方法包括以下步驟(a)在裂解溶液中從樣品中裂解細(xì)胞，從而形成包含核酸的裂解物；(b)用包含聚合物和洗滌劑的起始溶液處理所述裂解物；(c)施加懸浮的可磁性吸引的顆粒，以形成核酸-聚合物-顆粒復(fù)合物；(d)用洗滌溶液洗滌所述核酸_聚合物_顆粒復(fù)合物； (c)通過施加磁場(chǎng)回收所述核酸。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可磁性吸引的顆粒包括葡聚糖包被的磁性納米顆粒。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纖維素、纖維素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纖維糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其組合中的一種或多種。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述洗滌劑包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鹽、CTAB、脫氧膽酸鹽、十二烷基β -D-麥芽糖苷、壬?；?N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇對(duì)-(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸鈉、及其組合中的一種或多種。
11.用于從包含生物材料的樣品中分離和純化核酸的試劑盒，其包含含有聚合物和洗滌劑的起始溶液；以及可磁性吸引的顆粒。
12.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述聚合物包括葡聚糖、纖維素、纖維素衍生物、 可溶性淀粉、糊精、纖維糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其組合中的一種或多種。
13.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述洗滌劑包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鹽、CTAB、脫氧膽酸鹽、十二烷基β -D-麥芽糖苷、壬?；?N-甲基葡糖酰胺、 聚乙二醇對(duì)-(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸鈉、及其組合中的一種或多種。
14.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述可磁性吸引的顆粒包括葡聚糖包被的磁性納米顆粒。
15.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中所述試劑盒的所有內(nèi)含物在一個(gè)容器內(nèi)。
16.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含裂解溶液。
17.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含洗滌溶液。
18.從樣品中分離核酸的方法，其包括以下步驟(a)用包含聚合物和洗滌劑的起始溶液處理所述樣品；(b)將懸浮的可磁性吸引的顆粒加入到經(jīng)處理的樣品中；以及(c)通過施加磁場(chǎng)來分離經(jīng)由聚合物附著于可磁性吸引的顆粒的核酸。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述可磁性吸引的顆粒釋放所述核酸的步驟。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其進(jìn)一步包括在水溶液中洗脫所述核酸的步驟。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述核酸源自生物材料樣品，所述樣品包括血液、血斑、唾液、唾液斑、頰細(xì)胞、頰拭子、精液、精斑、煙蒂、口香糖、碎牛肉、布里干酪、生雞、蝦、羅馬甜瓜、干燥嬰兒配制食品、全殼蛋、碎黑胡椒、干燥寵物食品、花生醬、橙汁、巴氏滅菌奶、 苜蓿芽、烤牛肉、煙熏鮭魚、蛋黃醬、色拉調(diào)料、奶、冰激凌、腌培根、萵苣、香腸、甜菜、果汁、 菠菜、切達(dá)干酪、原奶、牡蠣、蛤或貝類中的一種或多種。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述可磁性吸引的顆粒包括葡聚糖包被的磁性納米顆粒。
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纖維素、纖維素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纖維糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其組合中的一種或多種。
24.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述洗滌劑包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鹽、CTAB、脫氧膽酸鹽、十二烷基β -D-麥芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇對(duì)-(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸鈉、及其組合中的一種或多種。
25.通過權(quán)利要求1所述方法制備的核酸產(chǎn)品。
26.通過權(quán)利要求7所述方法制備的核酸產(chǎn)品。
27.通過權(quán)利要求18所述方法分離的核酸。
全文摘要
公開了用于從溶液中回收生物聚合物的方法和材料。尤其，本發(fā)明提供了用于從生物材料中提取和分離核酸的方法。在洗滌劑和溶劑的存在下，可以通過形成與可溶性多糖聚合物和磁性顆粒的穩(wěn)定復(fù)合物來分離核酸。當(dāng)從溶液中磁性地分離出顆粒時(shí)，核酸和它們一起分離。隨后可以從顆粒釋放和分離核酸。該核酸制劑有用于在下游分子技術(shù)中得到有效且精確的結(jié)果，所述下游分子技術(shù)例如核酸來源的定量、鑒定以及基因分型。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102203251SQ200980129089
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者H·S·帕瓦, J·G·謝威爾, M·G·布列夫諾夫, M·富爾塔多 申請(qǐng)人:生命科技公司