專利名稱：用于檢測(cè)細(xì)胞死亡的組合物和其使用方法
用于檢測(cè)細(xì)胞死亡的組合物和其使用方法對(duì)相關(guān)申請(qǐng)案的引用本申請(qǐng)案依據(jù)35U. S. C. § 119(e)主張2008年7月30日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案 第61/084，861號(hào)的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，該案全文(包括所有圖式和說(shuō)明書(shū)所有部分)以引用的 方式并入本文中。
背景技術(shù)：
細(xì)胞死亡是許多疾病以及治療方法(例如癌癥的治療)的一個(gè)特征。因此，需要 能夠測(cè)量細(xì)胞死亡，評(píng)估涉及細(xì)胞死亡的疾病的狀態(tài)或者誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的治療的效果。近 年來(lái)，已經(jīng)描述了兩種截然不同的細(xì)胞死亡機(jī)制，稱為凋亡和壞死。盡管這兩種細(xì)胞死亡形 式在某些方面存在不同，但它們也可視為一個(gè)連續(xù)區(qū)的兩種極端情況，由此晚期凋亡與壞
死一致。凋亡，也稱為程序性細(xì)胞死亡，一般描述為一種能量相關(guān)性遺傳控制過(guò)程，借助于 這一過(guò)程，經(jīng)由內(nèi)部調(diào)控的自殺程序而激活細(xì)胞死亡。凋亡的特征一般包括磷脂酰絲氨酸 外翻、膜完整性喪失、細(xì)胞質(zhì)皺縮、染色質(zhì)和核凝集、DNA降解，以及細(xì)胞經(jīng)由出芽過(guò)程而分 裂成較小的凋亡小體。通常，由此產(chǎn)生的凋亡小體被巨噬細(xì)胞和鄰近細(xì)胞吞噬，而不會(huì)誘發(fā) 炎性反應(yīng)。評(píng)估凋亡常用的方法包括利用經(jīng)熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白A5(也稱為膜聯(lián)蛋白V)染 色禾口末端尿苷脫氧核苷酸末端標(biāo)記(terminal uridine deoxynucleotidylend-labeling, TUNEL)分析。壞死，也稱為事故性細(xì)胞死亡(accidental cell death)，通常是由多種突發(fā)的嚴(yán) 重非生理性損傷(例如物理、化學(xué)和局部缺血損傷)中任一者誘導(dǎo)。這一過(guò)程一般是以漸 進(jìn)式細(xì)胞腫脹、胞漿蛋白變性和凝結(jié)、亞細(xì)胞器分解和質(zhì)膜完整性不可逆破壞為特征。此后 一特征使得細(xì)胞毒性組分和其它細(xì)胞組分滲漏，從而誘發(fā)局部炎性反應(yīng)。膜完整性喪失(凋亡和壞死共有的特征)致使細(xì)胞內(nèi)組分從細(xì)胞漏出。因此，已 經(jīng)將例如乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)組分的血清和血漿含 量用作細(xì)胞死亡(即，壞死和晚期凋亡)的代用標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分基于本發(fā)明者得到的意外發(fā)現(xiàn)，S卩，包括LDH在內(nèi)的脫氫酶不僅 會(huì)從死亡細(xì)胞中漏出，而且還會(huì)被死亡細(xì)胞吸收和保留。所述死亡細(xì)胞對(duì)脫氫酶的攝取使 得有可能借助經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記的脫氫酶檢測(cè)和監(jiān)測(cè)死亡細(xì)胞。此外，所述死亡細(xì)胞對(duì)脫氫酶的 攝取同樣也使得有可能以選擇性方式靶向這些細(xì)胞，以便遞送以與脫氫酶的結(jié)合物形式提 供的試劑。以此方式遞送到死亡細(xì)胞的試劑可包括治療劑。本文描述的本發(fā)明的組合物和方法適用于在體內(nèi)和體外檢測(cè)和監(jiān)測(cè)死亡細(xì)胞。在 一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明適用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞，尤其包括處于早期凋亡階段的 細(xì)胞。可使用所述檢測(cè)和監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)估以細(xì)胞死亡為特征的病狀(尤其包括以凋亡性細(xì)胞死 亡為特征的病狀)的狀態(tài)?；蛘呋蛄硗猓墒褂盟鰴z測(cè)和監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)估以細(xì)胞死亡為特征或伴隨細(xì)胞死亡的治療(尤其包括以凋亡性細(xì)胞死亡為特征或伴隨凋亡性細(xì)胞死亡的治 療)的效果。例如，可以使用所述檢測(cè)和監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)估化療和放射療法在治療癌癥方面的效果。本文描述的本發(fā)明的組合物和方法還適用于將包括治療劑在內(nèi)的各種試劑選擇 性遞送到死亡細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明適用于將包括治療劑在內(nèi)的各種試劑選擇性 遞送到經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞，尤其包括處于早期凋亡階段的細(xì)胞。本文描述的本發(fā)明的組合物和方法還適用于治療以細(xì)胞死亡(尤其包括凋亡性 細(xì)胞死亡)為特征的多種病狀中的任一種。所述病狀可包括需要減少細(xì)胞死亡的病狀以及 需要增加細(xì)胞死亡的病狀。本發(fā)明在一方面是關(guān)于分離的由脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記構(gòu)成的結(jié)合物，其中所 述可檢測(cè)標(biāo)記不是免疫球蛋白或其脫氫酶結(jié)合片段。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。在 本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是人LDH。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是醇脫氫酶 (alcoholdehydrogenase,ADH)。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是 人 ADH。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是醛脫氫酶 (aldehydedehydrogenase，ALDH)。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶 是人ALDH。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是蘋(píng)果酸脫氫酶 (malatedehydrogenase, MDH)。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，脫氫酶是 人 MDH。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記選自由以下各物組 成的群組熒光標(biāo)記、放射性同位素、納米粒子、發(fā)色團(tuán)、染料、酶和造影劑，以及其任何組 合。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在本發(fā)明這 一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是放射性同位素。在本發(fā)明這一方面和其 它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是納米粒子。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明是關(guān)于一種包括本發(fā)明 的結(jié)合物的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物是適于投予個(gè)體的藥物組合物。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種分離的由脫氫酶連接于至少一種治療劑構(gòu)成的結(jié) 合物。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，治療劑是抗凋亡劑，其選自由以 下各物組成的群組環(huán)肌酸、磷酸環(huán)肌酸、輔酶Q10、L-肉堿、谷胱甘肽、α-硫辛酸、卡 斯帕酶(caspase)抑制肽，和抗凋亡蛋白或肽片段，例如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptoticprotein, IAPs)和抗凋亡BCL-2家族成員，及其任何組合。本發(fā)明在一方面是關(guān)于編碼脫氫酶的多聚核苷酸，其可操作地連接到編碼可檢測(cè) 標(biāo)記的多聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo)記是熒光蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，可檢測(cè)標(biāo) 記是酶。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種含有本發(fā)明的多聚核苷酸的載體。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種含有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種檢測(cè)經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方 面的方法包括以下步驟使測(cè)試細(xì)胞群與由脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記構(gòu)成的結(jié)合物在適于 所述測(cè)試細(xì)胞群攝取所述結(jié)合物的條件下接觸；和在所述測(cè)試細(xì)胞群中檢測(cè)所述標(biāo)記，其 中所述測(cè)試細(xì)胞群中所述標(biāo)記的存在指示經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞死亡是凋亡。在本發(fā)明這一 方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞死亡是壞死。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，方法步驟是在體外進(jìn)行。在本發(fā) 明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，方法步驟是離體進(jìn)行。在本發(fā)明這一方面和其它 方面，在一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)方法步驟是在體內(nèi)進(jìn)行。在本發(fā)明這一方面和其它方面， 在一個(gè)實(shí)施例中，方法步驟都是在體內(nèi)進(jìn)行。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)試細(xì)胞群是從患有或懷疑患 有與凋亡或壞死相關(guān)的病狀的個(gè)體獲得。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，個(gè)體是人類。在本發(fā)明這一方面和其它方面，在一個(gè)實(shí)施例中，病狀選自由以下各病狀組成的 群組癌癥；實(shí)體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；對(duì)療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環(huán)類誘發(fā)的心臟毒性；致心律失常性 右心室發(fā)育不良；骨骼肌細(xì)胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動(dòng)脈疾病；動(dòng)脈粥樣硬化；感染 性心內(nèi)膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 移植物抗宿主疾?。患?xì)菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再 灌注損傷，包括中風(fēng)；黃斑變性；神經(jīng)退化性疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷；自體免疫性糖尿病； 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；炎性腸??；多發(fā)性硬化；其它自體免疫疾病；膜聯(lián)蛋白 ?。还顷P(guān)節(jié)炎；腎衰竭；慢性腎萎縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎?。灰约捌淙魏谓M
I=I O在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟測(cè)量在測(cè)試細(xì)胞群中檢測(cè)到的 標(biāo)記的測(cè)試量；將在測(cè)試群中檢測(cè)到的標(biāo)記測(cè)試量與在參考細(xì)胞群中檢測(cè)到的標(biāo)記參考量 相比較；和確定(a)當(dāng)測(cè)試量大于參考量時(shí)細(xì)胞死亡的量增加，或(b)當(dāng)測(cè)試量小于參考量 時(shí)細(xì)胞死亡的量減少。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種治療與細(xì)胞凋亡相關(guān)的病狀的方法。根據(jù)本發(fā)明這一 方面的方法包括以下步驟對(duì)患有或懷疑患有與細(xì)胞凋亡有關(guān)的病狀的個(gè)體投予有效治療 所述病狀的量的藥物組合物，所述藥物組合物包含由脫氫酶連接于至少一種治療劑構(gòu)成的 結(jié)合物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)個(gè)體體內(nèi)的細(xì)胞凋亡的步驟。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種將試劑選擇性遞送到凋亡細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明這 一方面的方法包括使凋亡細(xì)胞與由脫氫酶連接于至少一種試劑構(gòu)成的結(jié)合物接觸的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑是抗凋亡劑。本發(fā)明在一方面是關(guān)于一種鑒別抗凋亡劑的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法包 括以下步驟使測(cè)試細(xì)胞與測(cè)試劑和由脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記構(gòu)成的結(jié)合物在另外誘導(dǎo) 測(cè)試細(xì)胞凋亡的條件下接觸；測(cè)量測(cè)試細(xì)胞中標(biāo)記的測(cè)試量；將標(biāo)記的測(cè)試量與參考細(xì)胞 中標(biāo)記的參考量相比較，所述參考細(xì)胞已與所述結(jié)合物在另外誘導(dǎo)測(cè)試細(xì)胞凋亡的條件下接觸；和當(dāng)標(biāo)記的測(cè)試量小于標(biāo)記的參考量時(shí)，將測(cè)試劑鑒別為抗凋亡劑。本發(fā)明的每一限定都可涵蓋本發(fā)明的各種實(shí)施例。因此，預(yù)期涉及任一要素或要 素組合的本發(fā)明的每一限定都可以包括在本發(fā)明各方面中。本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于以下 描述中所陳述或各圖式中所說(shuō)明的組分的構(gòu)建和布置細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠以其它實(shí)施例實(shí)踐 或以不同方式進(jìn)行。另外，本文使用的措辭和術(shù)語(yǔ)都是出于描述的目的，并且不應(yīng)將其視為 限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其變化形式將涵蓋后文 所列各項(xiàng)和其等效物以及額外各項(xiàng)。


圖 1 是一組熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 柱形圖，描述了使用經(jīng)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的膜聯(lián) 蛋白V和經(jīng)Cy5. 5標(biāo)記的LDH測(cè)量的海拉(HeLa)細(xì)胞隨時(shí)間的凋亡。圖2是一組FACS柱形圖，描述了使用經(jīng)FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和經(jīng)Cy5. 5標(biāo)記 的LDH測(cè)量的RS4 ；11細(xì)胞的凋亡。圖3是一組FACS柱形圖，描述了在含有鈣的膜聯(lián)蛋白緩沖液或不含鈣的磷酸鹽緩 沖的生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)中使用經(jīng)FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和經(jīng) Cy5. 5標(biāo)記的LDH測(cè)量的海拉細(xì)胞的凋亡。圖4是描述基于LDH的凋亡分析與基于膜聯(lián)蛋白V的凋亡分析對(duì)血清的不敏感性 的比較圖。圖5是一組FACS柱形圖，描述了經(jīng)FITC標(biāo)記的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione Stransferase, GST)無(wú)法使凋亡的海拉細(xì)胞染色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的利用三種人LDH同工型 (LDH-A、LDH-B和LDH-C)中每一種制備的GST融合蛋白可使凋亡的海拉細(xì)胞染色，未結(jié)合 的LDH-B探針也如此。圖6是一組FACS柱形圖，描述了利用經(jīng)Alexa 680標(biāo)記的醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫 酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)進(jìn)行的凋亡海拉細(xì)胞的檢測(cè)。圖7是一對(duì)攝影圖像，描述了用媒劑(左圖)或紫杉醇(Taxol)(右圖)處理的帶 有原位乳房異種移植(MDA-MB43Q腫瘤的小鼠體內(nèi)經(jīng)標(biāo)記LDH探針的積累。箭頭指示腫瘤 的位置。圖8提供在暴發(fā)性肝衰竭模型中LDH-B探針的示范性使用。㈧提供用抗Fas或 對(duì)照IgG抗體進(jìn)行處理的圖解以及由近紅外體內(nèi)成像獲得的一系列圖像；(B、C)提供的兩 個(gè)圖顯示了在比較經(jīng)抗Fas處理的動(dòng)物與IgG對(duì)照處理的動(dòng)物(每組η =幻時(shí)LDHB探針 和膜聯(lián)蛋白V探針的定量結(jié)果。圖9提供LDH探針用于使治療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡成像的示范性使用。(A)描述了用 ΑΜΝ107(尼羅替尼(nilotinib))處理KU812 (BCR-ABL+)腫瘤的圖解以及顯示經(jīng)AMN107處 理的動(dòng)物中腫瘤消退的圖；(B、C)提供的一系列圖像和圖說(shuō)明了經(jīng)AMN107處理的動(dòng)物中 LDHB探針的攝取相比媒劑處理的對(duì)照組有所增加。箭頭指示腫瘤的位置。
具體實(shí)施例方式凋亡是程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)的一種高度保守形式，在如器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和免疫系統(tǒng)調(diào)控等多種生理過(guò)程中起到重要作用，因?yàn)樵S多生物體 使用這一機(jī)制來(lái)選擇性除去不必要的細(xì)胞。然而，當(dāng)存活與死亡信號(hào)之間的生理平衡偏向 細(xì)胞死亡時(shí)，將進(jìn)入凋亡程序并達(dá)到多種病理病狀的頂點(diǎn)。據(jù)悉，過(guò)度凋亡會(huì)導(dǎo)致組織功 能性的漸進(jìn)性喪失，如在急性心肌梗塞、慢性心力衰竭、同種異體移植物排斥、中風(fēng)、神經(jīng)退 化性病癥(例如阿茲海默氏病(Alzheimer' s)、帕金森氏病(Parkinson' s)和亨廷頓 氏病(Huntington' s disease))和炎癥中所出現(xiàn)的情況。相比之下，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自體免疫疾病是以凋亡不足 為特征，這使得免疫活性細(xì)胞(即，自體反應(yīng)性淋巴細(xì)胞)能夠存活并且不適宜地?fù)p傷健康 器官?？沟蛲鰴C(jī)制在癌癥形成過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用。此外，許多藥物的有益或有害效應(yīng) 都可能歸因于其對(duì)凋亡過(guò)程的作用。因此，在體內(nèi)無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)凋亡發(fā)生的速率和程度將為臨 床醫(yī)生提供有關(guān)疾病活動(dòng)性和治療功效的相關(guān)臨床信息。凋亡可分為早期凋亡和晚期凋亡。處于早期凋亡階段的細(xì)胞通常對(duì)膜聯(lián)蛋白V染 色呈陽(yáng)性，而對(duì)例如碘化丙啶(propidium iodide,PI)等所謂的活體染色劑染色不呈陽(yáng)性。 相比之下，處于晚期凋亡階段的細(xì)胞以及壞死細(xì)胞常常對(duì)膜聯(lián)蛋白V和PI都呈陽(yáng)性。已經(jīng)進(jìn)行了包括臨床試驗(yàn)在內(nèi)的多種嘗試來(lái)測(cè)量體外和體內(nèi)的細(xì)胞凋亡。這些研 究中大部分都依賴于與將結(jié)合于磷脂酰絲氨酸的膜聯(lián)蛋白V形成的各種結(jié)合物。膜聯(lián)蛋白 V是結(jié)合鈣和磷脂的膜聯(lián)蛋白超家族的一個(gè)成員，這一家族中有至少13個(gè)成員已經(jīng)在多種 生物體中得到鑒別。與其它膜聯(lián)蛋白成員相同，膜聯(lián)蛋白V廣泛表達(dá)于真核生物體中。這種 蛋白質(zhì)主要是在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)上發(fā)現(xiàn)，但在健康人類的血液區(qū)室中的循環(huán)濃度極低 (l-6ng/ml)。此外，在多種細(xì)胞類型和組織中普遍表達(dá)這種蛋白質(zhì)，包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi) 皮、紅細(xì)胞、凝血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞Gchwarm cell)、骨胳肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、支氣管、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。在活細(xì)胞的質(zhì)膜內(nèi)，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)殘基呈不對(duì)稱定 向，致使其僅僅暴露于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，即，PS殘基朝向內(nèi)部。在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的早期，膜極性 喪失，由此導(dǎo)致PS殘基暴露于質(zhì)膜的細(xì)胞外側(cè)。在這一階段，膜聯(lián)蛋白V結(jié)合于外部暴露 的PS殘基，但膜不能自由地透過(guò)。小分子染料，例如碘化丙啶(PI)或臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue) (即活體染料)，無(wú)法自由地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞中。因此，早期凋亡細(xì)胞對(duì)膜聯(lián)蛋白V染色呈陽(yáng)性， 但對(duì)活體染料染色呈陰性。在晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞中，膜完整性喪失，由此使得活體染 料自由擴(kuò)散到細(xì)胞中。因此，死亡細(xì)胞對(duì)于膜聯(lián)蛋白V和活體染料都呈陽(yáng)性。根據(jù)這些觀察結(jié)果，最初曾用不同的熒光標(biāo)簽(例如FITC)來(lái)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V，而 現(xiàn)今常將膜聯(lián)蛋白V用于組織學(xué)和細(xì)胞分選研究中，以鑒別和定量凋亡細(xì)胞。然而，所有這 些檢測(cè)方法(例如顯微鏡檢查、免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)、高通量篩選法)或是在 檢測(cè)能力方面存在某些問(wèn)題，或是在體外的適用性有限，并且通常需要如活組織檢查等創(chuàng) 傷性取樣技術(shù)。如TUNEL分析等其它方法在定量所述過(guò)程方面經(jīng)常缺乏靈敏性，因?yàn)槠錂z 測(cè)機(jī)制僅靶向處于凋亡級(jí)聯(lián)的較晚階段的細(xì)胞，而此時(shí)凋亡細(xì)胞的吞噬作用已經(jīng)在體內(nèi)發(fā) 生了。也曾經(jīng)用例如99mTc或123I等放射性核素標(biāo)簽對(duì)膜聯(lián)蛋白V進(jìn)行放射性標(biāo)記，以便 在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)和定量。最初利用正常和鐮狀紅細(xì)胞、激活的血小板和組 織因子(tissue factor, TF)表達(dá)性成纖維細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行的體外研究明確證實(shí)了一個(gè)觀點(diǎn)，即，可以利用經(jīng)放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V成功地檢測(cè)早期凋亡。此后，在體內(nèi)評(píng) 價(jià)動(dòng)物和人體中經(jīng)放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V方面進(jìn)行了包括臨床試驗(yàn)在內(nèi)的深入研究。這些使用經(jīng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V測(cè)量細(xì)胞凋亡的嘗試的結(jié)果證實(shí)是令人失望的。由 這些方法得到的動(dòng)態(tài)范圍相當(dāng)有限，因?yàn)檠宓鞍讓?duì)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合具有抑制作用，并且 膜聯(lián)蛋白V結(jié)合需要鈣。此外，膜聯(lián)蛋白V和相關(guān)試劑相當(dāng)昂貴。本發(fā)明至少部分是基于經(jīng)歷凋亡和壞死的細(xì)胞能夠吸收和保留脫氫酶。先前曾報(bào) 導(dǎo)過(guò)，死亡細(xì)胞會(huì)釋放多種酶，包括LDH。而先前尚不了解且出乎預(yù)期的是，死亡細(xì)胞也吸收 和保留LDH。除LDH外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，類似地，經(jīng)歷凋亡和壞死的細(xì)胞可吸收和保留各種 其它脫氫酶，至少包括醇脫氫酶、醛脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶和各種人LDH的同工型(LDH-A、 LDH-B和LDH-C)。相比之下且如本文所揭示，這一現(xiàn)象是專門(mén)針對(duì)脫氫酶，因?yàn)楣入赘孰腟 轉(zhuǎn)移酶(GST ；—種分子量大致等于LDH的非脫氫酶類酶)不能被死亡細(xì)胞吸收和保留，而 GST-LDH結(jié)合物能被死亡細(xì)胞吸收和保留。很明顯，如本文所描述的，LDH探針不僅僅通過(guò)在膜完整性喪失后被動(dòng)擴(kuò)散到死亡 細(xì)胞中而充當(dāng)活體染料。第一，LDH探針使處于早期凋亡階段的細(xì)胞染色(即，膜聯(lián)蛋白V 陽(yáng)性、活體染料陰性)。第二，在徹底洗滌后，LDH探針不會(huì)自由擴(kuò)散到細(xì)胞外。脫氫酶是普遍存在的高度保守的酶，其催化一個(gè)質(zhì)子和一對(duì)電子從供體分子轉(zhuǎn)移 到受體分子，由此氧化供體并還原受體。這些酶通常使用NAD/NADP或者黃素輔酶(例如 FAD或FMN)作為受體。脫氫酶特別包括(但不限于)乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶和蘋(píng) 果酸脫氫酶。其它代表性脫氫酶列于表1中。表1.代表性脫氫酶的清單
權(quán)利要求
1.一種脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記的分離的結(jié)合物，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記不是免疫球蛋 白或其脫氫酶結(jié)合片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)合物，其中所述LDH為人LDH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合物，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自由以下組成的群組 熒光標(biāo)記、放射性同位素、納米粒子、發(fā)色團(tuán)、染料、酶和造影劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合物，其中所述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合物，其中所述標(biāo)記為放射性同位素。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合物，其中所述標(biāo)記為納米粒子。
10.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的結(jié)合物。
11.一種脫氫酶連接于至少一種治療劑的分離的結(jié)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的結(jié)合物，其中所述LDH為人LDH。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的結(jié)合物，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為抗凋亡劑，其選自由以下組成 的群組環(huán)肌酸、磷酸環(huán)肌酸、輔酶Q10、L_肉堿、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶(caspase)抑 制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
17.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一權(quán)利要求所述的結(jié)合物。
18.—種編碼脫氫酶的多聚核苷酸，其可操作地連接到編碼可檢測(cè)標(biāo)記的多聚核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多聚核苷酸，其中所述LDH為人LDH。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多聚核苷酸，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記為熒光蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多聚核苷酸，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是酶。
25.—種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求18至M中任一權(quán)利要求所述的多聚核苷酸。
26.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求25所述的載體。
27.一種用于檢測(cè)正經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞的方法，所述方法包含使測(cè)試細(xì)胞群與脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合物在適于所述測(cè)試細(xì)胞群攝取所述 結(jié)合物的條件下接觸；和在所述測(cè)試細(xì)胞群中檢測(cè)所述標(biāo)記，其中在所述測(cè)試細(xì)胞群中所述標(biāo)記的存在指示正經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述細(xì)胞死亡是凋亡。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述細(xì)胞死亡是壞死。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測(cè)都是在體外進(jìn)行的。
35.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測(cè)都是離體進(jìn)行的。
36.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述接觸和所述檢測(cè)中至少一者是在體內(nèi)進(jìn)行的。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述接觸和所述檢測(cè)都是在體內(nèi)進(jìn)行的。
38.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述測(cè)試細(xì)胞群是從患有或懷疑患有與細(xì)胞凋 亡有關(guān)的病狀的個(gè)體獲得。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述病狀選自由以下組成的群組癌癥；實(shí)體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；對(duì)療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環(huán)類誘發(fā)的心臟毒性；致心律失常性 右心室發(fā)育不良；骨骼肌細(xì)胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動(dòng)脈疾??；動(dòng)脈粥樣硬化；感染 性心內(nèi)膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 細(xì)菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再灌注損傷；黃斑變性； 神經(jīng)退化性疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷；自體免疫性糖尿?。活愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼 瘡；炎性腸?。欢喟l(fā)性硬化；其它自體免疫疾??；膜聯(lián)蛋白?。还顷P(guān)節(jié)炎 ’腎衰竭；慢性腎萎 縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎病。
40.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其進(jìn)一步包含 測(cè)量在所述測(cè)試細(xì)胞群中檢測(cè)到的標(biāo)記的測(cè)試量；將在所述測(cè)試細(xì)胞群中檢測(cè)到的所述標(biāo)記測(cè)試量與在參考細(xì)胞群中檢測(cè)到的標(biāo)記參 考量相比較；和確定(a)當(dāng)所述測(cè)試量大于所述參考量時(shí)細(xì)胞死亡的量增加，或(b)當(dāng)所述測(cè)試量小 于所述參考量時(shí)細(xì)胞死亡的量減少。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞死亡是凋亡。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞死亡是壞死。
43.一種用于治療與細(xì)胞凋亡有關(guān)的病狀的方法，所述方法包含對(duì)患有或懷疑患有與細(xì)胞凋亡相關(guān)的病狀的個(gè)體投予有效治療所述病狀的量的藥物 組合物，所述藥物組合物包含脫氫酶連接于至少一種治療劑的結(jié)合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
48.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述病狀選自由以下組成的群組癌癥；實(shí)體腫瘤和血液腫瘤中化療、放射或激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；對(duì)療法具抗性的腫 瘤；急性心臟同種異體移植物排斥；急性心肌梗塞；蒽環(huán)類誘發(fā)的心臟毒性；致心律失常性 右心室發(fā)育不良；骨骼肌細(xì)胞凋亡；充血性心力衰竭；冠狀動(dòng)脈疾??；動(dòng)脈粥樣硬化；感染 性心內(nèi)膜炎；心肌炎；心肌功能障礙；心肌缺血再灌注損傷；非心臟同種異體移植物排斥； 細(xì)菌感染；病毒感染；多器官功能障礙綜合癥；膿毒性休克；腦缺血再灌注損傷；黃斑變性； 神經(jīng)退化性疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷；自體免疫性糖尿??；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼 瘡；炎性腸??；多發(fā)性硬化；其它自體免疫疾??；膜聯(lián)蛋白?。还顷P(guān)節(jié)炎 ’腎衰竭；慢性腎萎 縮和腎纖維化；腎小球損傷；和多囊腎病。
49.根據(jù)權(quán)利要求43至48中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含監(jiān)測(cè)所述個(gè)體體 內(nèi)的細(xì)胞凋亡。
50.一種用于將試劑選擇性遞送到凋亡細(xì)胞的方法，所述方法包含 使凋亡細(xì)胞與脫氫酶連接于至少一種試劑的結(jié)合物接觸。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述試劑為抗凋亡劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述抗凋亡劑選自由以下組成的群組 環(huán)肌酸、磷酸環(huán)肌酸、輔酶Q10、L_肉堿、谷胱甘肽、α -硫辛酸、卡斯帕酶抑制肽和凋亡抑制蛋白(IAP)。
57.一種用于鑒別抗凋亡劑的方法，其包含使測(cè)試細(xì)胞與測(cè)試劑和脫氫酶連接于可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合物在另外誘導(dǎo)所述測(cè)試細(xì)胞 凋亡的條件下接觸；測(cè)量所述測(cè)試細(xì)胞中標(biāo)記的測(cè)試量；將所述標(biāo)記測(cè)試量與參考細(xì)胞中標(biāo)記的參考量相比較，所述參考細(xì)胞已與所述結(jié)合物 在另外誘導(dǎo)所述測(cè)試細(xì)胞凋亡的條件下接觸；和當(dāng)所述標(biāo)記測(cè)試量小于所述標(biāo)記參考量時(shí)，將所述測(cè)試劑鑒別為抗凋亡劑。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述脫氫酶是乳酸脫氫酶(LDH)。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述LDH為人LDH。
60.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述脫氫酶選自由以下組成的群組 醇脫氫酶(ADH)、醛脫氫酶(ALDH)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述脫氫酶為人脫氫酶。
62.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自由以下組成的群組 熒光標(biāo)記、放射性同位素、納米粒子、發(fā)色團(tuán)、染料、酶和造影劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述標(biāo)記為放射性同位素。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述標(biāo)記為納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明提供在體外和體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死的化合物和其使用方法。還提供將試劑選擇性遞送到正經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或壞死的細(xì)胞的化合物和其使用方法。所述化合物和方法是基于與例如乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等脫氫酶形成的結(jié)合物。所述化合物和方法適用于診斷和治療以細(xì)胞凋亡為特征的病狀，包括癌癥、心臟病、神經(jīng)病(包括中風(fēng))和自體免疫性。所述化合物和方法將提供超越與基于膜聯(lián)蛋白V的相應(yīng)化合物和方法的截然不同的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明還提供用于篩選可調(diào)節(jié)(即，抑制或促進(jìn))細(xì)胞凋亡的化合物的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK102105594SQ200980129095
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日
發(fā)明者安德魯·孔, 帕拉布·班納吉 申請(qǐng)人:達(dá)納-法伯癌癥研究所有限公司